一种海南油茶低磷响应启动子及其应用

本发明涉及植物基因工程的，特别涉及一种海南油茶的低磷响应启动子及其应用。

背景技术：

1、磷是植物生长发育所必需的大量营养元素之一，它不仅是植物细胞中许多重要分子的组成成分，而且以多种方式参与植物体内的各种代谢过程。土壤中总磷含量通常很高（>1000μm），但有效磷非常低（1-10μm）。植物不能吸收有机磷，而只能通过根系吸收无机磷酸盐。施用磷肥是提高土壤中无机磷含量的有效措施，但过量施用磷肥不仅加剧资源消耗与环境污染，也增加了生产成本。利用基因工程技术培育能够提高磷吸收和利用率的植物是应对土壤磷限制的一种可持续的措施。精细调控磷响应相关基因的表达对控制磷吸收和利用至关重要，其成功关键依赖于精准调控基因表达的启动子。

2、相较于可能引起代谢负担和“磷中毒”的组成型启动子，响应低磷胁迫的启动子能在外界磷缺乏信号下特异性启动基因表达，是实现精准、安全遗传改良的理想工具。然而，目前针对低磷胁迫的诱导型启动子较多，而响应低磷胁迫抑制目的基因表达的启动子较少，尤其在本本植物中，相关研究仍很有限。

3、油茶是我国特有的食用木本油料作物，其中海南油茶作为生长在海南的特有十倍体物种，具有果实大，籽粒含油量高且茶油品质优异等特点。海南油茶林地多为酸性红壤，有效磷含量低（~2μm），且由于土壤中富含铁铝而使得当季施用的磷肥容易被固定为难溶性磷，降低利用效率。磷素缺乏会降低茶油的产量和品质，严重制约了海南油茶产业的发展。通过基因工程方法，开发精确调控磷响应相关基因表达的启动子，培育耐低磷的磷高效油茶品种是促进海南油茶遗传改良的有效手段。然而，当前对海南油茶低磷响应启动子的研究还很有限。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种海南油茶的低磷响应启动子及其应用，利用该启动子可以调节外源基因在低磷条件下的表达水平。

2、本发明第一方面提供了一种海南油茶的pho2p启动子，其包括下述其中之一：

3、（1）其核苷酸序列如seq id no.1所示；

4、（2）其核苷酸序列与seq id no.1所示的多核苷酸序列有75%以上同源性，且具有seq id no.1所示的多核苷酸序列功能。

5、进一步的，所述（2）中的多核苷酸序列具体指，seq id no.1所示的多核苷酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个碱基得到的，且具有seq id no.1所示的多核苷酸序列功能的多核苷酸序列。

6、本发明第二方面提供了一种基于pho2p启动子改造的pho2pm启动子，其包括下述其中之一：

7、（1）其核苷酸序列如seq id no.2所示；

8、（2）其核苷酸序列与seq id no.2所示的多核苷酸序列有75%以上同源性，且具有seq id no.2所示的多核苷酸序列功能。

9、进一步的，所述（2）中的多核苷酸序列具体指，seq id no.2所示的多核苷酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个碱基得到的，且具有seq id no.2所示的多核苷酸序列功能的多核苷酸序列。

10、本发明第三方面提供了一种基于pho2p启动子的改造方法，将pho2p启动子上mir399识别位点进行碱基突变，得到相应的所述的pho2pm启动子。

11、本发明第四方面提供了一种基于pho2p启动子的用途，所述pho2p启动子在低磷条件下，降低抑制磷吸收利用的基因表达水平，以提升植物磷吸收与利用效率。

12、本发明第五方面提供了一种基于pho2pm启动子的用途，其特征在于，用于在低磷胁迫条件下，调控抑制磷吸收利用的基因表达效率。

13、本发明第六方面提供了一种植物表达载体，其特征在于，所述表达载体含有至少一个上述的多核苷酸序列作为启动子元件，由所述启动子元件指导抑制磷吸收利用的基因表达。

14、进一步的，所述表达载体为将 pcambia1301载体中的35s启动子取代为所述启动子元件后获得。

15、本发明第七方面提供了一种培育转基因植物的方法，包括：

16、将上述的植物表达载体，采用农杆菌介导的浸花法获得种子；

17、获得的种子经25 μg/ml潮霉素抗性筛选和pcr检测获得转基因阳性植株；

18、转基因阳性植株再经两代潮霉素抗性筛选及自交获得转基因株系。

19、本方案的有益效果在于：

20、本方案从海南油茶中分离克隆获得的低磷响应启动子pho2p，其核苷酸序列如seqid no.1所示，该启动子具有低磷诱导下调表达的特性，即在磷充足条件下高效驱动基因表达，在低磷胁迫条件下表达活性显著降低；所述启动子区含有mir399识别位点，通过对这些识别位点进行突变，获得受低磷调控响应程度不同的改造启动子pho2pm，其核苷酸序列如seq id no.2所示。

21、pho2pm启动子降低了mir399对靶基因的调控作用，从而精细调节目的基因的表达水平以适应低磷环境。当海南油茶遭遇低磷胁迫时，pho2p和pho2pm启动子可以在不同程度上降低那些抑制磷吸收和利用基因的表达水平，具有重要的应用价值。

22、通过对pho2p启动子区的mir399识别位点进行定点突变获得pho2pm启动子，可改变mir399与启动子的结合效率，从而精细调节低磷条件下基因表达下调的程度，实现对磷响应信号的梯度控制。

1.一种海南油茶的pho2p启动子，其特征在于，其包括下述其中之一：

2.根据权利要求1所述的pho2p启动子，其特征在于，所述（2）中的多核苷酸序列具体指，seq id no.1所示的多核苷酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个碱基得到的，且具有seq id no.1所示的多核苷酸序列功能的多核苷酸序列。

3.一种基于权利要求1所述的pho2p启动子改造的pho2pm启动子，其特征在于，其包括下述其中之一：

4.根据权利要求3所述的pho2pm启动子，其特征在于，所述（2）中的多核苷酸序列具体指，seq id no.2所示的多核苷酸序列经过取代、缺失或者添加一个或多个碱基得到的，且具有seq id no.2所示的多核苷酸序列功能的多核苷酸序列。

5.一种基于权利要求1中所述的pho2p启动子的改造方法，其特征在于，将pho2p启动子上mir399识别位点进行碱基突变，得到如权利要求3中相应的所述的pho2pm启动子。

6.一种基于权利要求1中所述的pho2p启动子的用途，其特征在于，所述pho2p启动子在低磷条件下，降低抑制磷吸收利用的基因表达水平，以提升植物磷吸收与利用效率。

7.一种基于权利要求3中所述的pho2pm启动子的用途，其特征在于，用于在低磷胁迫条件下，调控抑制磷吸收利用的基因表达效率。

8.一种植物表达载体，其特征在于，所述表达载体含有至少一个如权利要求1或3所述的多核苷酸序列作为启动子元件，由所述启动子元件指导抑制磷吸收利用的基因表达。

9.根据权利要求8所述的植物表达载体，其特征在于，所述表达载体为将 pcambia1301载体中的35s启动子取代为所述启动子元件后获得，其中，pcambia1301载体的核苷酸序列如seq id no.3所示。

10.一种培育转基因植物的方法，其特征在于，包括：