一种用于新生血管性疾病的新型玻璃体内基因疗法的制作方法

本发明涉及生物医学领域，涉及重组aav（raav）颗粒及其用途，特别是在预防和/或治疗眼科疾病中的用途。

背景技术：

1、新生血管性湿性年龄相关性黄斑变性（wamd）和糖尿病性黄斑水肿（dme）是导致失明的严重疾病。wamd在2020年影响全球超过2000万人，并预计到2050年将翻倍（brightfocus）。dme导致糖尿病患者的视力损害。据估计，2020年全球有1880万成年人患有临床意义上的dme，预计到2045年将增加到2860万。wamd和dme的根本原因存在差异，但是它们具有相似的病理生理学，诸如vegf信号通路。vegf促进的异常血管在脉络膜中生长并穿透进视网膜，渗漏流体和血液，这可能导致黄斑的肿胀和损伤。

2、基于raav的基因疗法对大多数眼部疾病的成功取决于将载体高效递送至光感受器（pr）和/或rpe。虽然视网膜下施用能最直接地到达pr和rpe，但是其侵入性更大，存在损伤视网膜组织的风险。玻璃体内（ivt）注射是一种安全的非手术程序，并且已被广泛用于蛋白质治疗剂的递送以治疗常见的视网膜疾病。

3、然而，目前将腺相关病毒作为眼部系统基因治疗载体的应用仍存在组织特异性差、感染效率低等缺陷。因此，为了实现准确的基因治疗，需要一种高效且特异性的新型重组腺相关病毒载体。

技术实现思路

1、本发明提供一种重组aav（raav）颗粒，其包含

2、(a)编码多肽的核酸，其中该多肽从n-末端到c-末端包含（i）能够结合血管生成素的第一结构域；（ii）来源于vegfr-1的第二结构域；和（iii）来源于vegfr-2的第三结构域；以及

3、(b)衣壳蛋白，其中该衣壳蛋白是aav2衣壳蛋白的变体，其在aav2的衣壳蛋白vp1的氨基酸位置587和588之间的位置处包含seq id no：1的插入序列。

4、在一个具体的实施方案中，其中aav2衣壳蛋白包含seq id no：2的氨基酸序列。

5、在一个具体的实施方案中，其中aav2衣壳蛋白的变体包含seq id no：4的氨基酸序列。

6、在一个具体的实施方案中，其中第一结构域包含seq id no：15、seq id no：16、seq id no：17、seq id no：18、seq id no：19或seq id no：20的氨基酸序列或由其组成，或者第一结构域包含与seq id no：15、seq id no：16、seq id no：17、seq id no：18、seq idno：19或seq id no：20具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列。

7、在一个具体的实施方案中，其中第二结构域包含seq id no：13的氨基酸序列或由其组成，或者第二结构域包含与seq id no：13具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列。

8、在一个具体的实施方案中，其中第三结构域包含seq id no：14的氨基酸序列或由其组成，或者第三结构域包含与seq id no：14具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列。

9、在一个具体的实施方案中，其中多肽进一步包含（iv）能够结合vegfc的第四结构域，第四结构域位于第三结构域的n-末端。

10、在一个具体的实施方案中，其中第四结构域包含seq id no：21、seq id no：22或seq id no：23的氨基酸序列或由其组成，或者第四结构域包含与seq id no：21、seq idno：22或seq id no：23具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列。

11、在一个具体的实施方案中，其中第一结构域包含seq id no：15的氨基酸序列或由其组成，或者第一结构域包含与seq id no：15具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列；第二结构域包含seq id no：13的氨基酸序列或由其组成，或者第二结构域包含与seq id no：13具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列；第三结构域包含seq id no：14的氨基酸序列或由其组成，或者第三结构域包含与seq id no：14具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列。

12、在一个具体的实施方案中，其中第一结构域包含seq id no：15的氨基酸序列或由其组成，或者第一结构域包含与seq id no：15具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列；第二结构域包含seq id no：13的氨基酸序列或由其组成，或者第二结构域包含与seq id no：13具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列；第三结构域包含seq id no：14的氨基酸序列或由其组成，或者第三结构域包含与seq id no：14具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列；第四结构域包含seq id no：23的氨基酸序列或由其组成，或者第四结构域包含与seq id no：23具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列。

13、在一个具体的实施方案中，其中多肽进一步包含抗体的fc区或其变体。

14、在一个具体的实施方案中，其中fc区包含seq id no：24或seq id no：25的氨基酸序列。

15、在一个具体的实施方案中，其中多肽进一步包含信号肽，其中任选地信号肽包含seq id no：26的氨基酸序列。

16、在一个具体的实施方案中，其中多肽进一步包含一个或更多个接头。

17、在一个具体的实施方案中，其中多肽包含seq id no：46、seq id no：47、seq idno：48、seq id no：49、seq id no：50、seq id no：51、seq id no：52、seq id no：53、seq idno：54、seq id no：55、seq id no：56、seq id no：57或seq id no：58的氨基酸序列，或者与seq id no：46、seq id no：47、seq id no：48、seq id no：49、seq id no：50、seq id no：51、seq id no：52、seq id no：53、seq id no：54、seq id no：55、seq id no：56、seq idno：57或seq id no：58具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列。

18、在一个具体的实施方案中，重组aav（raav）颗粒进一步包含aav 5’末端反向重复（itr）、指导多肽表达的调节序列和aav 3’itr。

19、本发明提供了一种宿主细胞，其特征在于该宿主细胞用如前所述的raav颗粒转化。

20、本发明提供了一种药物组合物，其包含a）如前所述的raav颗粒；和b）药学上可接受的赋形剂。

21、本发明提供了一种治疗疾病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的如前所述的raav颗粒、宿主细胞、药物组合物。

22、在一个具体的实施方案中，宿主细胞或药物组合物通过玻璃体内注射递送。

23、本发明提供了如前所述的raav颗粒、宿主细胞、药物组合物在制备用于预防和/或治疗疾病的药物中的用途。

24、在一个具体的实施方案中，其中疾病是眼科疾病。

25、在一个具体的实施方案中，眼科疾病选自rpe层相关疾病，诸如干性amd、湿性amd或脉络膜新生血管（cnv）；诸如可选自年龄相关性黄斑变性（amd）、脉络膜新生血管（cnv）、脉络膜新生血管膜（cnvm）、囊样黄斑水肿（cme）、视网膜前膜（erm）和黄斑裂孔；近视相关性脉络膜新生血管、血管样条纹、视网膜脱离、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿（dme）、视网膜色素上皮细胞（rpe）的萎缩性病变、视网膜色素上皮细胞（rpe）的肥厚性病变、视网膜静脉阻塞、脉络膜视网膜静脉阻塞、黄斑水肿；缺氧引起的角膜血管生成、翼状胬肉结膜、视网膜下水肿和视网膜内水肿；视网膜静脉阻塞引起的黄斑水肿、视网膜色素变性（retinitis pigmentosa）、stargardt病、青光眼、炎性疾病、白内障、难治性异常（refractory anomalies）、圆锥角膜、早产儿视网膜病变、眼前血管生成、角膜炎、角膜移植或角膜形成术后角膜血管生成；诸如leber先天性黑蒙（lca）、色素性视网膜变性（pigmentretinal degeneration）和由rpe细胞相关基因突变引起的stargardt病。

26、在一个具体的实施方案中，其中药物用于疾病的基因治疗。