用于肺癌循环肿瘤细胞3D培养的培养体系、培养方法和药效检测应用与流程

本发明涉及癌循环肿瘤细胞三维培养，具体涉及用于肺癌循环肿瘤细胞3d培养的培养体系、培养方法和药效检测应用。

背景技术：

1、肺癌是起源于肺部支气管黏膜或腺体的恶性肿瘤，其发病率和死亡率在全球范围内均位居所有癌症之首，是对人类健康与生命威胁最大的恶性肿瘤之一，主要分为非小细胞癌和小细胞癌。其中非小细胞肺癌（nsclc）的癌细胞较大，生长和扩散相对较慢，主要包括肺腺癌和肺鳞癌。

2、肺癌循环肿瘤细胞（ctc）是存在于肺癌患者外周血中的肿瘤细胞，是临床上监测肺癌症转移的重要标志物。体外三维培养技术是研究肺癌生物学特性、开发新药和实现个体化治疗的关键工具；通过体外三维培养ctc并进行鉴定与药筛，相比传统组织活检具有创伤小、可重复性强等优势。同时三维培养较常规体外培养更能模拟真实体内环境，支持细胞间自由地相互作用，组成和分化。

3、在体外三维培养技术中，细胞外基质（ecm）是体外三维培养系统的关键组成部分。现有ecm材料成分基本上是胶原蛋白、基质胶、纤维蛋白、合成聚合物等，存在批次差异大，来源不可控、成本较高、降解快、生物相容性较差等问题。此外，目前ctc体外培养因每毫升血液中仅有数个ctc，难以富集和捕获，依旧存在增殖困难的情况，导致无法建立稳定的培养体系，影响后续临床实验和药物筛查。鉴于此，本发明提供用于肺癌循环肿瘤细胞3d培养的培养体系、培养方法和药效检测应用。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供用于肺癌循环肿瘤细胞3d培养的培养体系、培养方法和药效检测应用。目的实现肺癌循环肿瘤细胞快速、稳定地增殖。

2、本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

3、第一方面，一种用于肺癌循环肿瘤细胞3d培养的培养体系，包括细胞培养基和细胞外基质，所述细胞培养基包括如下浓度的组分：egf 10–50 ng/ml，bfgf 10–150μg/ml，igf－1 10–100μg/ml，hgf 10–50μg/ml，pdgf－bb 5–20 ng/ml，vegf－a 5–50 ng/ml，heregulin β 15–20 ng/ml，tgf－β1 0.5–5 ng/ml，wnt3a 50–200 ng/ml，r－spondin1 1–3 mg/ml，noggin 50–200 ng/ml，scf 20–100 ng/ml，cxcl12 50–200 ng/ml，il－6 5–50ng/ml，il－8 5–50 ng/ml。

4、在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

5、进一步，所述细胞培养基包括如下浓度的组分：egf 20–40 ng/ml，bfgf 50–100μg/ml，igf－1 30–80μg/ml，hgf 20–40μg/ml，pdgf－bb 10–15 ng/ml，vegf－a 15–40 ng/ml，heregulin β 16–19 ng/ml，tgf－β1 1–4 ng/ml，wnt3a 90–150 ng/ml，r－spondin11.5–2.5 mg/ml，noggin 80–150 ng/ml，scf 40–80 ng/ml，cxcl12 80–150 ng/ml，il－615–40 ng/ml，il－8 15–40 ng/ml。

6、进一步，所述细胞外基质包括多糖衍生物－多肽共聚物和/或多糖衍生物－氨基酸多聚物。

7、其中，细胞外基质的结构式如式ⅰ所示（详见专利公开号为cn120555357a专利的记载）。

8、进一步，所述多糖衍生物－多肽共聚物的形状为纤维状和/或片状，所述多糖衍生物－氨基酸多聚物的形状为纤维状和/或片状。

9、进一步，所述细胞培养基与所述细胞外基质质量比0.5－1.5:0.5－1.5。

10、第二方面，一种用于肺癌循环肿瘤细胞3d培养的培养方法，包括如下步骤：

11、将待培养的细胞重悬于所述的一种用于肺癌循环肿瘤细胞3d培养的培养体系中，进行培养直至获得3d的肺癌循环肿瘤细胞。

12、进一步，每毫升所述的一种用于肺癌循环肿瘤细胞3d培养的培养体系的细胞外基质中所述待培养的细胞的初始数量为（1.0－9.0）×106个。

13、进一步，所述培养的条件为：温度为37℃，co2的体积含量为5%。

14、第三方面，所述的培养方法获得的3d的肺癌循环肿瘤细胞在体外药物敏感性筛查中的应用。

15、进一步，所述体外药物包括卡铂、盐酸恩沙替尼、紫杉醇中的至少一种。

16、本发明的有益效果是：

17、(1)本发明通过调整肺癌循环肿瘤细胞的培养体系，该培养体系采用了通用性较强、生物安全性高、可工业化生产、质量可控的3d培养的细胞外基质和优化的培养基，优化肺癌循环肿瘤细胞培养方法，使得肺癌ctc快速聚集成团、传代、快速稳定地增殖。

18、(2)本发明通过免疫组化等方法鉴定不同分型肺癌循环肿瘤细胞，根据免疫鉴定结果进行检测。

19、(3)本发明通过靶向药对肺癌循环肿瘤细胞的体外药物敏感性检测，达到个性化精准治疗，避免化疗药引起的严重的不良反应。

20、（4）本发明针对非小细胞肺癌进行了靶向药物的药效检测，能直接看到靶向药对特定肿瘤的抑制效果；时间短、成本低，对早期患者可以最大化初始治疗的成功率，同时可以尽量避免晚期患者接受靶向药物治疗易出现耐药的情况。

1.一种用于肺癌循环肿瘤细胞3d培养的培养体系，其特征在于，包括细胞培养基和细胞外基质，所述细胞培养基包括如下浓度的组分：egf 10–50 ng/ml，bfgf 10–150μg/ml，igf－1 10–100μg/ml，hgf 10–50μg/ml，pdgf－bb 5–20 ng/ml，vegf－a 5–50 ng/ml，heregulin β 15–20 ng/ml，tgf－β1 0.5–5 ng/ml，wnt3a 50–200 ng/ml，r－spondin1 1–3 mg/ml，noggin 50–200 ng/ml，scf 20–100 ng/ml，cxcl12 50–200 ng/ml，il－6 5–50ng/ml，il－8 5–50 ng/ml。

2.根据权利要求1所述一种用于肺癌循环肿瘤细胞3d培养的培养体系，其特征在于，所述细胞培养基包括如下浓度的组分：egf 20–40 ng/ml，bfgf 50–100μg/ml，igf－1 30–80μg/ml，hgf 20–40μg/ml，pdgf－bb 10–15 ng/ml，vegf－a 15–40 ng/ml，heregulin β 16–19 ng/ml，tgf－β1 1–4 ng/ml，wnt3a 90–150 ng/ml，r－spondin1 1.5–2.5 mg/ml，noggin 80–150 ng/ml，scf 40–80 ng/ml，cxcl12 80–150 ng/ml，il－6 15–40 ng/ml，il－8 15–40 ng/ml。

3.根据权利要求1所述一种用于肺癌循环肿瘤细胞3d培养的培养体系，其特征在于，所述细胞外基质包括多糖衍生物－多肽共聚物和/或多糖衍生物－氨基酸多聚物。

4.根据权利要求3所述一种用于肺癌循环肿瘤细胞3d培养的培养体系，其特征在于，所述多糖衍生物－多肽共聚物的形状为纤维状和/或片状，所述多糖衍生物－氨基酸多聚物的形状为纤维状和/或片状。

5.根据权利要求1至4任一项所述一种用于肺癌循环肿瘤细胞3d培养的培养体系，其特征在于，所述细胞培养基与所述细胞外基质质量比0.5－1.5:0.5。

6.一种用于肺癌循环肿瘤细胞3d培养的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述一种用于肺癌循环肿瘤细胞3d培养的培养方法，其特征在于，每毫升所述的一种用于肺癌循环肿瘤细胞3d培养的培养体系的细胞外基质中所述待培养的细胞的初始数量为（1.0－9.0）×106个。

8.根据权利要求6所述一种用于肺癌循环肿瘤细胞3d培养的培养方法，其特征在于，所述培养的条件为：温度为37℃，co2的体积含量为5%。

9.权利要求6至8任一项所述的培养方法获得的3d的肺癌循环肿瘤细胞在体外药物敏感性筛查中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述体外药物包括卡铂、盐酸恩沙替尼、紫杉醇中的至少一种。