一种含黄芪多糖佐剂的IBV多表位重组枯草芽孢杆菌鼻腔疫苗及其制备方法和应用

本发明涉及基因工程疫苗，具体涉及一种含黄芪多糖佐剂的ibv多表位重组枯草芽孢杆菌鼻腔疫苗及其制备方法和应用。

背景技术：

1、鸡传染性支气管炎（infectious bronchitis,ib）是由鸡传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus,ibv）引起的一种家禽急性、高度接触性呼吸道传染病，具有传播速度快、变异频繁的特点。ibv主要侵害鸡的呼吸系统，同时部分毒株还可侵害肾脏和生殖系统，导致呼吸道炎症、肾脏病变、生长性能下降、产蛋量降低和蛋品质下降等一系列生产损失，常年给国内外肉鸡、蛋鸡养殖产业带来持续性重大经济损失。ibv属于冠状病毒科、γ冠状病毒属，为单股正链rna病毒，其基因组在复制和传播过程中容易发生突变及重组，导致不同基因型和遗传谱系的病毒持续出现，并形成较为复杂的抗原多样性，其中qx型（gi-19谱系）已成为我国及亚洲地区的优势流行毒株。ibv刺突糖蛋白（spike protein，s蛋白）是病毒表面的主要结构蛋白，由s1和s2两个亚基组成。其中s1亚基是介导病毒识别宿主受体、启动入侵过程的核心中和抗原，也是病毒基因型分化、血清差异的关键决定区段，而s2亚基主要介导病毒包膜与细胞膜的融合，是病毒进入宿主细胞所必需的功能区域，与变异程度较高的s1相比，s2在不同ibv毒株间相对保守，含有具有交叉反应潜力的抗原表位；n蛋白是病毒高丰度结构蛋白，参与病毒基因组rna的包装、复制和转录调控，富含可诱导细胞免疫的保守t细胞抗原表位。从s1、s2和n蛋白中联合筛选抗原表位，有利于在同一候选疫苗分子中兼顾体液免疫、细胞免疫和不同毒株间的抗原覆盖能力。

2、疫苗免疫仍是目前预防和控制ibv最经济、主流的技术手段。现有商业化ibv疫苗主要分为弱毒活疫苗、灭活疫苗两大类，两类产品均存在难以克服的固有技术缺陷。ibv弱毒活疫苗可通过滴鼻、点眼、饮水途径接种，能诱导局部黏膜免疫，但疫苗毒株具备体内复制能力，存在毒力返强、疫苗株与野毒株发生基因重组产生新型变异毒株的双重安全风险；同时，其保护作用与疫苗株和流行毒株之间的抗原相关性密切相关，当二者抗原差异较大时，可能出现交叉保护不足。另一类是灭活疫苗，安全性较好，但主要诱导体液免疫应答，难以有效诱导呼吸道局部的黏膜免疫，且需要逐只肌肉注射，操作繁琐，人工免疫成本高，动物应激大，不适合大规模免疫接种。因此，现有疫苗技术仍难以同时兼顾较高安全性、较宽抗原覆盖范围、有效呼吸道黏膜免疫以及便捷的大规模接种。

3、近年来，随着病毒序列数据库和免疫信息学分析技术的发展，基于抗原表位的理性疫苗设计逐渐成为ibv新型疫苗研发的重要方向。该类技术通常结合既往免疫学研究资料、病毒抗原蛋白序列比对以及免疫信息学预测，从ibv的主要抗原蛋白中筛选具有潜在免疫活性的b细胞抗原表位和t细胞抗原表位，将来自不同抗原蛋白的多个优势抗原表位进行组合，有利于在同一候选疫苗分子中兼顾体液免疫和细胞免疫，并为提高疫苗对不同ibv毒株的抗原覆盖能力提供技术基础。然而，部分研究主要依赖单一免疫信息学软件或数据库预测，缺少既往实验研究证据和病毒实际序列信息的共同支持，容易产生预测结果与真实免疫活性不一致的问题；另外，部分研究主要集中于变异程度较高的s1蛋白，对相对保守的s2蛋白和n蛋白中的交叉反应性抗原表位关注不足。因此，现有筛选方法所得候选抗原表位可能存在目标毒株适配性不足、安全性评价不完整或跨毒株适用范围有限等问题，进而影响后续多表位疫苗的免疫效果和应用价值。

4、枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）属于研究和应用较为成熟的革兰氏阳性细菌，是国际公认食品级安全益生菌，具有不产生内毒素、培养条件简单、遗传操作体系相对完善、外源蛋白表达系统成熟以及适用于黏膜抗原递送等特点。此外，枯草芽孢杆菌的细胞壁成分（如肽聚糖和脂磷壁酸）具有天然的免疫佐剂效应，能够激活toll样受体（tlr）信号通路，促进抗原呈递细胞的活化。然而，尽管枯草芽孢杆菌作为疫苗载体具有上述优势，现有技术中仍存在明显的局限性。首先，枯草芽孢杆菌作为革兰氏阳性菌，其细胞壁结构致密，外源基因的导入和同源重组效率通常低于大肠杆菌等革兰氏阴性菌，这给重组菌株的构建带来了技术挑战。其次，虽然枯草芽孢杆菌常被用于口服黏膜疫苗的研究，但在鼻腔黏膜免疫的应用中，其作为活载体的定植能力及对呼吸道局部免疫（特别是siga分泌）的诱导机制尚不完全清楚。

5、黄芪多糖（astragalus polysaccharide，aps）是中药材黄芪提取的天然活性多糖，大量基础研究证实其具备免疫增强活性，可促进t细胞增殖、增强巨噬细胞吞噬功能、上调细胞因子表达，是极具应用潜力的天然绿色佐剂。现有黄芪多糖在禽疫苗中的应用仅局限于与ibv灭活疫苗配合作为注射用佐剂，或作为饲料添加物促进肉鸡生长和免疫增强，天然多糖与表达ibv抗原的活菌载体协同黏膜佐剂体系亟待开发。

6、综上所述，现有技术中缺乏一种能将免疫信息学多表位设计、重组枯草芽孢杆菌活载体递送和黄芪多糖鼻腔黏膜佐剂三者有机整合的ibv疫苗方案，以同时解决传统疫苗交叉保护力不足、活载体疫苗黏膜免疫原性偏弱，以及大规模便捷免疫接种这三个核心问题。

7、需要说明的是，在上述背景技术部分公开的信息仅用于加强对本公开的背景的理解，因此可以包括不构成对本领域普通技术人员已知的现有技术的信息。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种含黄芪多糖佐剂的ibv多表位重组枯草芽孢杆菌及其制备方法。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供了一种重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌表达鸡传染性支气管炎病毒多表位抗原mersn；

3、其中，所述多表位抗原mersn包含：m细胞靶向肽cks9、b细胞抗原决定簇e1和e2、t细胞抗原决定簇e3和e4、连接肽以及6×his标签；

4、所述b细胞抗原决定簇e1的氨基酸序列如seq id no.4所示，e2的氨基酸序列如seq id no.5所示；所述t细胞抗原决定簇e3的氨基酸序列如seq id no.6所示，e4的氨基酸序列如seq id no.7所示。

5、优选地，本发明提供的重组枯草芽孢杆菌中，所述多表位抗原mersn的全长氨基酸序列如seq id no.9所示。

6、本发明还提供了编码所述多表位抗原mersn的核苷酸序列，如seq id no.10所示。

7、优选地，本发明提供的所述重组枯草芽孢杆菌的宿主菌为枯草芽孢杆菌wb800n。

8、优选地，本发明提供的所述重组枯草芽孢杆菌的表达载体选自pht43。

9、本发明还提供了一种ibv多表位抗原的重组枯草芽孢杆菌鼻腔疫苗，包含所述的重组枯草芽孢杆菌和黄芪多糖佐剂。

10、优选地，所述鼻腔疫苗中重组枯草芽孢杆菌的浓度为1×109~1×1010cfu/ml。

11、优选地，所述鼻腔疫苗中所述黄芪多糖佐剂在所述疫苗中的终浓度为50 mg/ml。

12、本发明还提供了一种所述鼻腔疫苗的制备方法，包括以下步骤：

13、（1）将核苷酸序列如seq id no.10所示的mersn抗原基因克隆入原核表达载体中，得到重组质粒p-mersn；

14、（2）将所述重组质粒p-mersn转化入枯草芽孢杆菌wb800n，筛选阳性转化子，得到重组枯草芽孢杆菌wb800n(p-mersn)；

15、（3）将步骤（2）所得重组枯草芽孢杆菌进行诱导培养，收集菌体；

16、（4）重悬菌体至菌液浓度为1×109~1×1010cfu/ml；

17、（5）将黄芪多糖溶解，经0.22μm滤膜过滤除菌，与步骤（4）所得菌液混合，即得。

18、优选地，所述制备方法步骤（5）中所述黄芪多糖在混合体系中的终浓度为50 mg/ml；所述重悬菌体和黄芪多糖溶解选自无菌pbs。

19、本发明提供的重组枯草芽孢杆菌或由所述制备方法制得的鼻腔疫苗可用于制备用于预防鸡传染性支气管炎的药物中。

20、本发明首先依托ibv流行优势qx scsn毒株s1、s2、n完整编码序列开展多层次抗原表位筛选工作，系统检索已公开的ibv免疫相关文献初筛具备优良免疫活性的候选肽段，再经序列同源比对筛选四段跨毒株高保守、无细胞毒性、无致敏性的b/t细胞抗原决定簇，随后搭配6×his标签、cks9 m细胞靶向肽、gpgpg与aay柔性连接肽进行模块化串联，此串联抗原多肽被命名为“mersn”，经生信工具预测无跨膜结构、整体呈高亲水属性，多肽内部抗原表位集中分布于无规则卷曲区域。

21、本发明进一步构建可稳定表达上述mersn抗原的重组枯草芽孢杆菌工程菌株。选用pht43诱导型表达载体，根据目标基因序列及表达载体图谱，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成密码子优化、基因合成及重组载体构建，经双酶切与全长测序验证序列准确无误，得到重组质粒pht43-mersn。制备枯草芽孢杆菌wb800n感受态细胞，并将重组质粒pht43-mersn电转导入，借助氯霉素与新霉素双抗平板筛选阳性转化子，经wb验证该工程菌在适宜诱导条件下可稳定分泌可溶性mersn抗原。

22、本发明所述的黄芪多糖佐剂重组枯草芽孢杆菌鼻腔疫苗的制备，是将重组枯草芽孢杆菌wb800n(pht43-mersn)经诱导培养后，离心收集菌体，用无菌pbs重悬并调整菌体浓度至1×109~1×1010cfu/ml，将黄芪多糖用无菌pbs溶解并经0.22μm滤膜过滤除菌，按确定的最优比例与重组菌液混合，制得鼻腔滴鼻用疫苗制剂。

23、本发明所述的免疫原性评价方法，是将spf鸡随机分为pbs空白对照组、空载体菌株组、重组菌无佐剂组和重组菌加黄芪多糖佐剂组四组，分别于7日龄、14日龄和21日龄通过点眼滴鼻途径免疫，连免三天；免疫后定期采集血清和气管灌洗液，分别检测血清ibv特异性igy抗体水平和气管黏膜siga抗体水平；同时检测血清中细胞因子ifn-γ和il-4的浓度变化。本发明所述的攻毒保护实验方法，是在三免后以qx型ibv毒株通过点眼滴鼻途径进行攻毒，攻毒后连续观察发病情况，采集咽喉拭子和泄殖腔拭子检测排毒量，攻毒7天后处死全部鸡只，收集气管、肺脏和肾脏组织检测病毒载量并进行病理组织学观察。

24、本发明具有以下优点：

25、本发明筛选了同时满足无毒性、无过敏性、抗原性评分≥0.4且跨毒株保守性≥95%的4个优势抗原决定簇，并构建了一种mersn抗原分子，其氨基酸序列如seq id no.9所示，编码其抗原分子的核苷酸序列如seq id no.10所示。

26、本发明采用安全菌株枯草芽孢杆菌作为载体，转入可表达抗原分子的序列构建得到了一种重组枯草芽孢杆菌。经过与黄芪多糖的复配，可以作为一种鼻腔疫苗，可同时诱导体液免疫、细胞免疫以及呼吸道黏膜siga应答。

27、攻毒保护实验显示，重组枯草芽孢杆菌和aps的组合在气管、肺脏、肾脏组织中的病毒载量均显著低于重组菌组，且病理组织学观察未见明显病变，表明该疫苗可有效保护多靶器官免受病毒损伤。