一种从黄芪中分离黄芪多糖的级联分离纯化方法

本发明涉及分离纯化，具体涉及一种从黄芪中分离黄芪多糖的级联分离纯化方法。

背景技术：

1、黄芪多糖（astragalus polysaccharide，aps）是黄芪中的主要活性成分之一，具有免疫调节、抗氧化等生物活性，在中药制剂及相关产品中具有一定的应用价值。研究表明，黄芪多糖的生物活性与其分子量大小及分布密切相关，低分子量且分子量分布均一的黄芪多糖通常具有更好的水溶性、生物利用度及药理活性，因此获得分子量适宜、均一性良好的黄芪多糖产品具有重要的应用价值。

2、目前黄芪多糖的提取通常采用水提醇沉法，即先对黄芪原料进行水提取，再对水提液进行浓缩和醇沉处理。然而，传统的直接提取法所得黄芪多糖呈天然分布状态，分子量通常极大且跨度极广，无法获得特定低分子量的多糖组分，产品均一性差。为获得低分子量黄芪多糖，现有技术多采用酸、碱或常规酶解等方法对其进行降解处理，但此类降解方法的断键具有随机性，虽然平均分子量有所降低，但产物变成了一锅包含单糖、寡糖以及各种结构残缺多糖片段的大杂烩，不仅破坏产物的均一性，还可能损伤黄芪多糖的活性结构，导致其生物活性降低。

3、此外，黄芪水提液中除多糖外，还含有蛋白质、无机盐、色素、小分子糖以及悬浮颗粒等杂质，直接进行浓缩和醇沉容易发生多糖与杂质共同沉淀，影响所得黄芪多糖的纯度。为去除水提液中的蛋白质，现有技术通常采用酶法或sevage法。酶法脱蛋白的处理条件较为温和，但单独采用酶法时，可能存在蛋白质去除不充分的问题；sevage法能够去除部分蛋白质，但通常需要进行多次萃取，有机试剂用量较大，并可能造成多糖损失。因此，单独采用一种脱蛋白方法，难以兼顾脱蛋白效果和多糖得率。

4、再者，黄芪水提液中含有一定量的悬浮颗粒和胶体物质，直接采用小孔径微滤膜或超滤膜进行处理时，容易出现过滤速度下降和膜污染等问题；采用普通滤纸进行预过滤，对细小颗粒和胶体物质的去除效果有限，仍可能影响后续微滤和超滤过程。

技术实现思路

1、针对现有技术中黄芪多糖直接提取产物分子量极大、分布宽、均一性差，酸碱或常规酶解制备低分子量多糖又存在随机断键、易破坏多糖结构，且水提液中蛋白质、小分子及无机盐等杂质难以高效去除、纯化过程中纯度与得率难以兼顾的技术问题，本发明提供一种从黄芪中分离黄芪多糖的级联分离纯化方法，通过分级微滤、超滤浓缩、组合脱蛋白、超滤洗涤脱盐和醇沉等步骤，改善黄芪多糖的分离纯化效果。

2、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、一种从黄芪中分离黄芪多糖的级联分离纯化方法，包括如下步骤：

4、（1）将黄芪饮片经水提取和固液分离得到的粗滤液，依次通过多个孔径逐级减小的微滤膜进行梯度级联过滤，收集澄清液；

5、（2）采用截留分子量为5~10 kda的超滤膜对所述澄清液进行超滤浓缩，收集膜截留液，得到第一浓缩液；

6、（3）向所述第一浓缩液中加入木瓜蛋白酶进行酶解脱蛋白，经灭活和离心后，收集第一上清液；向所述第一上清液中加入谢瓦格试剂（sevage试剂）进行振荡萃取，经离心后，收集第二上清液；

7、（4）采用截留分子量为5~10 kda的超滤膜对所述第二上清液进行超滤，并在超滤过程中动态补加超纯水进行洗涤脱盐和浓缩，得到第二浓缩液；

8、（5）向所述第二浓缩液中加入乙醇进行醇沉，分离并收集沉淀，将所述沉淀复溶后干燥，得到黄芪多糖。

9、进一步地，步骤（1）中，将黄芪饮片破碎，加入乙醇或体积分数为70％~95％的乙醇水溶液进行超声脱脂。

10、进一步地，收集脱脂后的固体，以黄芪饮片的初始质量计，分1~3次加入超纯水，黄芪饮片质量与超纯水累计加入体积之比为1 g: （10~20）ml，在70~90 ℃下水浴提取，每次60~90 min。

11、进一步地，步骤（1）中，所述粗滤液依次通过孔径为10~20 μm、3~5 μm和0.2~0.65μm的微滤膜进行梯度级联过滤。优选地，所述粗滤液依次通过孔径为10 μm、5 μm和0.45 μm的微滤膜进行梯度级联过滤。优选地，微滤膜为mce膜。

12、进一步地，步骤（2）中，所述超滤浓缩的跨膜压力为0.1~0.3 mpa，将所述澄清液浓缩至初始体积的1/10~1/4，得到所述第一浓缩液。

13、进一步地，步骤（3）中，所述木瓜蛋白酶的加入质量为所述第一浓缩液质量的1％~3％；所述酶解脱蛋白在55~60 ℃下进行3~4 h，酶解结束后升温至70~90 ℃并保持10~15min，使木瓜蛋白酶灭活，再经离心收集第一上清液。

14、进一步地，步骤（3）中，所述sevage试剂由氯仿和正丁醇按照4: 1的体积比混合制成；所述第一上清液与所述sevage试剂的体积比为（4~5）: 1，在200 r/min下振荡萃取30~50 min。

15、进一步地，步骤（4）中，对所述第二上清液进行超滤，并同步等体积补加超纯水，超纯水的累计补加体积为所述第二上清液初始体积的5~10倍。

16、进一步地，步骤（5）中，向所述第二浓缩液中加入其体积2~4倍的无水乙醇，在4 ℃下静置醇沉10~18 h，经离心收集沉淀。

17、进一步地，所述干燥为真空冷冻干燥。

18、与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

19、（1）本发明通过梯度微滤、超滤浓缩、超滤洗涤等膜分离手段对黄芪多糖进行温和的物理分级与纯化，无需采用酸、碱或常规酶解等易发生随机断键的降解方式，即可获得分子量较低、分布窄且均一性好的黄芪多糖产品，其重均分子量mw为5.073×104 g/mol，峰值分子量mp为2.812×104 g/mol，分散系数mw/mn为1.519，主要分子量组分的质量分数可达99.1%，避免了降解过程对多糖链完整性和生物活性的破坏。

20、（2）本发明中的粗滤液依次通过孔径逐级减小的多级微滤膜进行梯度过滤，可逐步截留并去除悬浮颗粒和胶体等杂质，显著减轻小孔径微滤膜及后续超滤膜的过滤负荷，延缓膜污染、维持较高的过滤通量，有利于分离过程的稳定运行和连续化操作。

21、（3）本发明先采用木瓜蛋白酶对第一浓缩液进行酶解脱蛋白，再采用sevage试剂对第一上清液进行振荡萃取脱蛋白，两种脱蛋白方式协同互补，可将黄芪水提液中的蛋白质分步、彻底去除，所得产品中蛋白质含量低于bca蛋白定量法的检出限；同时，酶解处理可先行去除大部分蛋白质，减少sevage试剂用量，避免了单一sevage法需多次萃取导致的有机试剂用量大及多糖损失，兼顾了脱蛋白效果与多糖得率。

22、（4）本发明超滤过程中同步等体积补加超纯水进行洗涤，可同时实现脱盐与浓缩，有效去除小分子糖、无机盐及色素等杂质，减少醇沉过程中杂质与黄芪多糖的共沉淀，提高产品纯度。所得黄芪多糖产品的总多糖含量可达98.8%~99.3%，蛋白质未检出，产品为纯净的白色粉末，外观品质良好。

23、（5）本发明各步骤工艺条件温和、操作参数范围宽、易于控制，便于工业化生产；原料投料量由100 g放大至1400 g级时，所得黄芪多糖产品的纯度仍可稳定保持在99%以上，表明本发明方法工艺稳定性好，具备良好的工业化应用前景。