一种同时检测4种瓜类病害的引物探针组合、试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及分子检测领域，特别是涉及一种同时检测4种瓜类病害的引物探针组合、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、瓜类细菌性果斑病(bacterial fruit blotch ofcucurbits，bfb)、黄瓜细菌性角斑病(cucumber angular leafspot)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottlemosaic virus，cgmmv)和黄瓜黑星病(scab ofcucurbits)是瓜类作物上的重要种传病害。瓜类细菌性果斑病的病原菌是燕麦嗜酸菌(acidovorax avenae subsp.citrulli，ac)，ac被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》、《全国农业植物检疫性有害生物名单》和eppo有害生物名单；黄瓜细菌性角斑病的病原菌是丁香假单胞菌黄瓜角斑病致病变种(pseudomonas syringaepv.lachrymans，psl)；cgmmv被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》和《全国农业植物检疫性有害生物名单》；黄瓜黑星病的病原菌是瓜枝孢(cladosporium cucumerinum，cc)，被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》和《全国农业植物检疫性有害生物名单》。上述4种病原体存活时间长，为害严重，种子携带病原体是主要远距离传播的初侵染源，因此做好病害监管工作具有重要意义。

2、植物检疫性病害诊断检测技术主要以生理生化检测、血清学检测和分子生物学检测为主。其中分子生物学检测是最常用的方法，如聚合酶链式反应(polymerase chainreaction，pcr)、逆转录-pcr(reverse transcription-pcr，rt-pcr)、实时荧光定量pcr(real-time quantitative pcr，qpcr)方法等。例如，中华人民共和国国家标准gb/t36853-2018发布了黄瓜细菌性角斑病菌检疫鉴定方法；中华人民共和国出入境检验检疫行业标准sn/t 1465-2004发布西瓜细菌性果斑病菌检疫鉴定方法；专利cn112813189b公开了一种利用四重实时荧光pcr对转基因玉米品系进行快速鉴定的方法，选择设计mir162、mon89034、bt11三个转基因玉米品系和玉米内州萎蔫病菌cmn四重引物探针，进行实时荧光pcr扩增，检测玉米病害。

3、现有瓜类病害的分子生物学检测系统或方法，通常需要在检测前进行瓜类样本前处理，且大部分检测方法不能同时检测多种病害，检测方法或体系的操作繁琐，耗时较长。因此，十分有必要寻找一种能够同时检测多种病害的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种同时检测4种瓜类病害的引物探针组合、试剂盒及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。

2、本发明人基于上述问题，经过数年研发，于在先申请号为“cn202110057507.0”的中国发明专利中公开了一种新型现场化快速核酸检测设备，经过温控的优化和升级，该设备为“手持实时荧光pcr一体机p1000f”，可在36min内完成现场自动化核酸检测，能够实现“样品进，结果出”的快速检测。为了解决样本前处理的难题，本发明人研发出了操作简便快速的样本处理管(公开于申请号为“cn202320319535.x”的中国实用新型专利中)。本发明即在样本处理和检测设备的基础上，进一步研发出能够更好的配合该设备的发明，即四种瓜类病害联合检测的引物探针组合及一体化封闭式微流控芯片试剂盒和应用，该试剂盒在一体化芯片上进行样本的核酸提取、纯化、扩增和检测，应用于现场快速的即时检验(point-of-care testing，poct)。

3、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

4、本发明提供了一种同时检测4种瓜类病害的引物探针组合，所述引物探针组合包括用于检测瓜类细菌性果斑病的引物探针组合、用于检测瓜类细菌性角斑病的引物探针组合、用于检测瓜类绿斑驳花叶病的引物探针组合、用于检测瓜类黑星病的引物探针组合和用于检测ipc的引物探针组合；

5、所述用于检测瓜类细菌性果斑病的引物探针组合包括核苷酸序列如seq id no:1-seq id no:3所示的引物探针；

6、用于检测瓜类细菌性角斑病的引物探针组合包括核苷酸序列如seq id no:4-seqid no:6所示的引物探针；

7、用于检测瓜类绿斑驳花叶病的引物探针组合包括核苷酸序列如seq id no:7-seqid no:9所示的引物探针；

8、用于检测瓜类黑星病的引物探针组合包括核苷酸序列如seq id no:10-seq idno:12所示的引物探针；

9、用于检测ipc的引物探针组合包括核苷酸序列如seq id no:13-seq id no:15所示的引物探针。

10、即，所述用于检测瓜类细菌性果斑病的引物探针组合包括核苷酸序列如seq idno:1所示ac-f、核苷酸序列如seq id no:2所示ac-r和核苷酸序列如seq id no:3所示ac-p；

11、用于检测瓜类细菌性角斑病的引物探针组合包括核苷酸序列如seq id no:4所示psl-f、核苷酸序列如seq id no:5所示psl-r和核苷酸序列如seq id no:6所示psl-p；

12、用于检测瓜类绿斑驳花叶病的引物探针组合包括核苷酸序列如seq id no:7所示cgmmv-f、核苷酸序列如seq id no:8所示cgmmv-r和核苷酸序列如seq id no:9所示cgmmv-p；

13、用于检测瓜类黑星病的引物探针组合包括核苷酸序列如seq id no:10所示cc-f、核苷酸序列如seq id no:11所示cc-r和核苷酸序列如seq id no:12所示cc-p；

14、用于检测ipc的引物探针组合包括核苷酸序列如seq id no:13所示ipc-f、核苷酸序列如seq id no:14所示ipc-r和核苷酸序列如seq id no:15所示ipc-p。

15、优选的，所述瓜类细菌性角斑病为黄瓜细菌性角斑病；所述瓜类绿斑驳花叶病为黄瓜绿斑驳花叶病；所述瓜类黑星病为黄瓜黑星病。

16、进一步优选的，探针的5'端标记有荧光报告基团，探针的3'端标记有淬灭基团。

17、进一步优选的，所述荧光报告基团选自fam、rox、hex、cy5、vic、tet、joe、cy3、cy7、red610、texas red、red670、ned、amca、pacific blue、atto 425、bodipyfl、alexa fluor488、yakimayellow、quasar 570、aqua phluor 593、atto 590和cy5.5中的一种或多种。

18、进一步优选的，所述的荧光报告基团选自atto 425、fam、hex、cy3、cy5、cy5.5、vic、joe和rox中的一种或多种。

19、进一步优选的，所述淬灭基团为荧光淬灭基团。

20、进一步优选的，所述的荧光淬灭基团选自6-tamra、bhq1、bhq2、bhq3、dabcyl、eclipse、mgb、qys-7和sq1中的一种或多种。

21、进一步优选的，所述的荧光淬灭基团选自bhq2、bhq3和sq1中的一种或多种。

22、本发明提供了上述的引物探针组合在制备检测瓜类病害的产品中的应用，所述瓜类病害包括瓜类细菌性果斑病、瓜类细菌性角斑病、瓜类绿斑驳花叶病的和瓜类黑星病。

23、优选的，所述瓜类细菌性角斑病为黄瓜细菌性角斑病；所述瓜类绿斑驳花叶病为黄瓜绿斑驳花叶病；所述瓜类黑星病为黄瓜黑星病。

24、优选的，所述的产品包括独立的检测试剂、芯片或试剂盒

25、本发明提供了一种能够现场检测瓜类病害的试剂盒，所述的试剂盒包括上述的引物探针组合。

26、优选的，所述的试剂盒为一体化封闭式微流控芯片试剂盒。

27、优选的，所述的一体化封闭式微流控芯片试剂盒还包括纯化试剂、风干qpcr试剂和冻干内部过程质控品(integratedprocess control，简称ipc)。

28、进一步优选的，所述的纯化试剂包括裂解液、洗涤液、洗脱液和磁珠，所述的裂解液和洗涤液包括盐酸胍、醋酸钠、triton x-100和1,3-丁二醇，所述的洗脱液包括tris-hcl，所述的磁珠为干化磁珠。

29、进一步优选的，所述的裂解液和洗涤液包括4.2m盐酸胍、0.28m醋酸钠(ph 4.7)、1.4％triton x-100和30％1,3-丁二醇，所述的洗脱液包括10mm tris-hcl(ph 8.5)。

30、进一步优选的，所述的冻干ipc过程质控品为rna假病毒。

31、进一步优选的，所述的冻干ipc过程质控品以冻干球的形式封装在一体化微流控芯片中。

32、进一步优选的，所述的试剂盒在一体化芯片上完成样本的核酸提取、纯化、扩增和检测。

33、进一步优选的，所述的微流控芯片试剂盒可用于p1000f快速核酸检测设备。

34、进一步优选的，所述瓜类细菌性角斑病为黄瓜细菌性角斑病；所述瓜类绿斑驳花叶病为黄瓜绿斑驳花叶病；所述瓜类黑星病为黄瓜黑星病。

35、本发明提供了一种现场检测瓜类病害的方法，所述的方法包括以下步骤：

36、(1)对待测样本进行预处理，得到预处理样本；

37、(2)将所述预处理样本与上述的引物探针组合或上述的试剂盒中的引物探针组合混合，并利用检测设备进行检测分析；

38、所述瓜类病害包括瓜类细菌性果斑病、瓜类细菌性角斑病、瓜类绿斑驳花叶病的和瓜类黑星病。

39、进一步优选的，所述待测样本包括瓜类种子、种子粉末或叶片。

40、进一步优选的，所述瓜类细菌性角斑病为黄瓜细菌性角斑病；所述瓜类绿斑驳花叶病为黄瓜绿斑驳花叶病；所述瓜类黑星病为黄瓜黑星病。

41、作为一个可增加的方案，本发明提供了一种现场检测瓜类作物病原的方法，所述方法包括一体化封闭式微流控芯片试剂盒的制备、样本前处理、快速设备检测；

42、具体地，所述的方法包括以下步骤：

43、(1)将上述的引物探针组合制备成一体化封闭式微流控试剂盒；

44、(2)将瓜类种子、种子粉末或叶片样本加入样本处理管中进行处理，得到待检液体；

45、(3)将所述待检液体滴入所述一体化封闭式微流控试剂盒中；

46、(4)将加入待检液体的一体化封闭式微流控试剂盒放入检测设备上进行检测分析。

47、进一步优选的，所述的步骤(2)具体为：在样本处理管中加入样本前处理液和研磨颗粒；所述的样本前处理液包括tris-hcl(ph 8.0)、nacl、edta和sds；

48、进一步优选的，所述的tris-hcl的浓度范围为10mm-100mm，nacl的浓度范围为30mm-1.4m，edta的浓度范围为1.5mm-20mm，sds的浓度范围为0.05％-2％；研磨颗粒的直径为0.1μm-1mm。

49、进一步优选的，所述样本前处理液tris-hcl(ph 8.0)的浓度范围为30mm-55mm，nacl的浓度范围为350mm-700mm，edta的浓度范围为5mm-10mm，sds的浓度范围为0.5％-1％。

50、进一步优选的，所述的步骤(4)具体包括：

51、1)打开快速检测设备；

52、2)扫描二维码；

53、3)插入所述一体化微流控芯片试剂盒；

54、4)运行检测；

55、5)结束，查看检测结果及扩增曲线。

56、作为一个可增加的方案，本发明提供了一种现场检测瓜类作物病原的方法，所述的方法包括以下步骤：

57、(1)将上述引物探针组合制备一体化封闭式微流控试剂盒；

58、(2)利用样本处理管进行样本的快速前处理；

59、(3)利用芯片上的纯化试剂进行样本的裂解及核酸提取纯化；

60、(4)利用上述引物探针组合快速扩增步骤(3)提取并纯化的样本核酸；

61、(5)对扩增结果进行分析。

62、本发明提供了上述的引物探针组合或上述的试剂盒在检测瓜类病害中的应用，所述瓜类病害包括瓜类细菌性果斑病、瓜类细菌性角斑病、瓜类绿斑驳花叶病的和瓜类黑星病。

63、进一步优选的，所述瓜类细菌性角斑病为黄瓜细菌性角斑病；所述瓜类绿斑驳花叶病为黄瓜绿斑驳花叶病；所述瓜类黑星病为黄瓜黑星病。

64、本发明公开了以下技术效果：

65、本发明提供了一种检测瓜类作物中瓜类细菌性果斑病菌、黄瓜细菌性角斑病菌、黄瓜绿斑驳花叶病毒和黄瓜黑星病菌的引物探针组合、一体化微流控芯片试剂盒及方法。采用本发明所述的引物探针组合及试剂盒检测瓜类作物中病原体的方法，集成了样本前处理、核酸提取、纯化、扩增和检测，具有较好的灵敏度(瓜类细菌性果斑病菌的最低检测限为4.2×102cfu/反应，黄瓜细菌性角斑病的最低检测限为4.8×102cfu/反应，黄瓜绿斑驳花叶病毒的最低检测限为1.0×101copies/反应，黄瓜黑星病的最低检测限为3.4×10-5ng/反应)和准确度，方法操作简便、快速省时。本发明提供的引物探针组合、一体化微流控芯片试剂盒及方法可同时检测瓜类细菌性果斑病、黄瓜细菌性角斑病、黄瓜绿斑驳花叶病毒和黄瓜黑星病四种病原，对瓜类种植中病原体的现场快速检测具有重要作用。