用于检测浓香型白酒窖泥中Methanomethylophilaceae的引物、试剂盒及PCR方法与流程

本发明涉及微生物鉴定，具体为用于检测浓香型白酒窖泥中methanomethylophilaceae的引物、试剂盒及pcr方法。

背景技术：

1、浓香型白酒的独特风味与其窖泥中复杂且稳定的微生物群落结构密切相关。窖泥作为一个独特的厌氧发酵生态系统，蕴含着丰富的细菌和古菌。methanomethylophilaceae，隶属于甲烷马赛球菌目，是近年来新发现的产甲烷古菌类群。与大多数利用h2/co2或乙酸的产甲烷古菌不同，该类群能够以甲醇、甲胺等甲基化合物作为产甲烷底物，并可能以氢气或胞外电子作为电子供体。这一独特的代谢特性暗示，methanomethylophilaceae在窖泥中可能具备双重潜在功能，一是通过消耗甲醇等物质，参与窖泥中甲基化合物的循环；二是通过消耗氢气，可能解除对产酸菌的氢反馈抑制，从而促进己酸等关键风味前体物质的生成。

2、然而，methanomethylophilaceae的生理学研究及其在窖泥中的生态功能探索仍然面临技术瓶颈。该类微生物绝大多数属于难培养或未培养微生物，依赖传统分离培养的技术手段难以获得纯培养物，导致无法运用经典的微生物学方法对其进行鉴定和计数。目前，对环境样本中产甲烷古菌的检测与鉴定主要依赖于针对16s rrna基因的分子生物学技术。尽管16s rrna基因作为系统发育标记被广泛应用，但其在近缘种属间，尤其是在产甲烷古菌某些类群内部，序列保守性较高，分辨率有限。使用通用或广谱引物进行检测时，可能无法准确区分methanomethylophilaceae与其他亲缘关系较近的产甲烷古菌，易导致检测结果特异性不足、出现假阳性或漏检，难以实现对该功能类群的精准靶向监测和定量分析。

3、功能基因编码产物直接参与特定代谢途径，其序列在不同生理类群间可能具有更高的区分度。

mtab基因编码甲醇甲基转移酶，是methanomethylophilaceae利用甲基化合物产甲烷途径中的关键功能基因。因此，我们提出了用于检测浓香型白酒窖泥中methanomethylophilaceae的引物、试剂盒及pcr方法，以便于缓解或解决上述问题。

4、本背景技术所公开的上述信息仅仅用于增加对本发明背景技术的理解，因此，其可能包括不构成本领域普通技术人员已知的现有技术。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供用于检测浓香型白酒窖泥中methanomethylophilaceae的引物、试剂盒及pcr方法，以解决现有技术中传统培养法难以实现该菌的有效检出、现有分子检测方法特异性差且假阳性率高、缺乏针对窖泥复杂基质的痕量methanomethylophilaceae精准定量检测手段，进而无法支撑该菌资源挖掘与功能解析的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供了一种用于特异性鉴定methanomethylophilaceae的引物对。所述引物对是针对上述

mtab基因保守序列设计而成，包括上游引物和下游引物。该引物对能够从methanomethylophilaceae基因组dna中特异性扩增出长度约为250 bp的片段，而对甲烷八叠球菌科、甲烷袋状菌科等其他常见产甲烷古菌无扩增作用，具有良好的种属特异性。

3、一种非诊断目的的methanomethylophilaceae的定性检测方法，包括以下步骤：

4、(a).提供待测样品的基因组dna；

5、(b).以步骤(a)获得的基因组dna为模板，使用上述引物对进行聚合酶链式反应(pcr)扩增；

6、(c).检测步骤(b)的扩增产物，若存在长度为250 bp的dna片段，则判定所述待测样品中含有methanomethylophilaceae。

7、一种浓香型白酒窖泥中methanomethylophilaceae的定量检测方法，包括以下步骤：

8、s1.提供窖泥样品的基因组dna；

9、s2.以步骤s1获得的基因组dna为模板，使用上述引物对进行实时荧光定量pcr(qpcr)扩增，并记录ct值；

10、s3.基于步骤s2获得的ct值，参照使用含有seq id no: 2所示序列的核酸分子构建的标准曲线，计算所述窖泥样品中methanomethylophilaceae功能基因

mtab的拷贝数。

11、本发明提供的pcr检测方法包括常规pcr定性检测方法和qpcr定量检测方法，其中常规pcr定性检测方法用于快速筛查样品中是否含有methanomethylophilaceae，qpcr定量检测方法用于精准测定样品中methanomethylophilaceae的丰度。

12、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

13、本发明首次针对methanomethylophilaceae特有的甲醇甲基转移酶编码基因（

mtab）设计特异性引物，该基因序列在methanomethylophilaceae中高度保守，而在其他产甲烷古菌中同源性很低或存在显著差异。实验验证表明，所提供的引物对仅对methanomethylophilaceae能扩增出单一的250 bp目标条带，而对卢米尼甲烷马赛球菌、马氏甲烷八叠球菌、海沼甲烷球菌等多种其他科属的产甲烷古菌均无任何非特异性扩增。克服了依赖16s rrna通用引物可能导致的交叉反应和假阳性问题，实现了在科水平上对目标菌群的特异性鉴别，确保了检测结果的准确性。

14、本发明集成了实时荧光定量pcr技术，能够对窖泥样品中痕量的methanomethylophilaceae基因组dna进行精确定量。所建立的标准曲线线性关系良好，扩增效率符合要求，检测下限低。这使得本方法能够有效应对窖泥中微生物总量大但目标菌群相对丰度可能较低的实际情况，实现对methanomethylophilaceae的灵敏检出和准确定量，避免了因丰度低而导致的漏检。

15、本发明的整个检测流程无需对难以培养的methanomethylophilaceae进行分离和纯培养。从窖泥样品中直接提取总dna开始，通过pcr扩增及后续分析，可在数小时内完成定性判断或定量分析。缩短了检测周期，提高了工作效率。

16、本发明的技术方案直接来源于浓香型白酒窖泥宏基因组，实验验证以窖泥样品及窖泥富集液为对象，考虑了窖泥这一复杂基质的特性，经过实际窖泥样品的反复验证，证明其能够有效排除背景干扰，稳定、可应用于真实生产环境的样品检测中。

17、本发明的引物验证所用嗜甲基甲烷菌（vadinca11 sp.jn-1）的保藏编号为cicc25540，保藏时间为2026年06月10日，保藏中心为中国工业微生物菌种保藏管理中心（cicc），地址为北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼，邮政编码为100015，属于methanomethylophilaceae，vadinca11属。其他菌种均为市售菌株，菌种编号见表2。

18、上述概述仅仅是为了说明书的目的，并不意图以任何方式进行限制。除上述描述的示意性的方面、实施方式和特征之外，通过参考附图和以下的详细描述，本发明进一步的方面、实施方式和特征将会是容易明白的。