一对三萜类化合物差相异构体、制备方法及应用

本发明涉及天然药物化学，具体涉及一对三萜类化合物差相异构体、制备方法及应用。

背景技术：

1、癌症是全球第二大死亡原因，严重威胁人类健康。目前临床使用的化疗药物存在毒性强、易产生耐药性等问题，因此从天然药物中寻找高效低毒的抗肿瘤活性成分一直是新药研发的重要方向。

2、雪胆（

hemsleya chinensiscogn. ex f. b. forbes&hemsl.），又名曲莲、罗锅底等，为葫芦科雪胆属植物的块茎，是我国传统中草药，具有清热解毒、抗菌消炎等功效。现代药理研究表明，雪胆提取物及其所含的化学成分（如雪胆素甲、雪胆素乙、葫芦素d等）具有抗菌、抗炎、抗肿瘤等多种生物活性。

技术实现思路

1、针对上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一对葫芦烷型三萜类非对映异构体化合物及其制备方法和应用。本发明从葫芦科植物雪胆块茎中分离得到一对非对映异构体化合物，分子式均为c30h48o8，两者的结构差异在于c-22位和c-23位的绝对构型均互为相反。其中，化合物1的绝对构型为22r,23s，化合物2的绝对构型为22s,23r。本发明对上述两个化合物进行了抗肿瘤活性评价。结果显示，化合物2（22s,23r）对人大细胞肺癌nci-h460细胞和人肺腺癌nci-h1975细胞显示出显著抑制活性，而化合物1（22r,23s）基本无活性。鉴于两者仅在c-22和c-23位的绝对构型上存在差异（均互为相反），表明这两个手性中心的构型组合对活性具有重要影响。本发明还建立了可重复的稳定制备方法，为开发新型高效抗肿瘤药物提供先导化合物或原料药。

2、为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

3、一对三萜类化合物，所述葫芦烷型三萜非对映异构体化合物分别为化合物1为(2

s,3

s,16

r,20

r,22

r,23

s)-2,3,20,22-四羟基-16,23-环氧-葫芦-5,24-二烯-11-酮，结构式为：；化合物2为(2

s,3

s,16

r,20

r,22

s,23

r)-2,3,20,22-四羟基-16,23-环氧-葫芦-5,24-二烯-11-酮，结构式为。

4、在本发明优选的实施方式中，化合物1为（22r,23s）构型，化合物2为（22s,23r）构型，分子式均为c30h48o8；化合物1为无色结晶，化合物2为白色粉末。

5、在本发明优选的实施方式中，所述（22s,23r）构型的化合物2具有显著抗肿瘤细胞活性。

6、一对三萜类化合物的制备方法，包括以下步骤：

7、以雪胆根茎为原料，采用乙醇水溶液提取，过滤，合并滤液经减压浓缩，得到浸膏。

8、将所述的浸膏用纯净水分散制成混悬液，用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇分别萃取，减压回收溶剂，得到四部位浸膏。

9、将乙酸乙酯部位浸膏进行第一次硅胶柱色谱分离，采用第一次梯度洗脱，得到10个组分，为fr1-fr10。

10、将所述的10个组分中的fr5经第二次硅胶柱色谱分离，采用第二次梯度洗脱，得到9个组分，分别为fr51-fr59。

11、将所述的组分fr53再经第三次硅胶柱色谱分离，采用第三次梯度洗脱，得到12个流分，分别为fr531-fr5312。

12、将所述的组分fr535进行hplc分离，得到化合物1和化合物2。

13、在本发明优选的实施方式中，雪胆根茎与乙醇的质量体积比为1：8-15。

14、在本发明优选的实施方式中，第一次硅胶柱色谱分离中硅胶粒径为100-200目，第二次硅胶柱色谱分离和第三次硅胶柱色谱分离硅胶粒径为200-300目；第一次和第二次梯度洗脱的洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，第三梯度洗脱的洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯，其中第一次梯度洗脱中二氯甲烷和甲醇的体积比为1-10：1，第二次梯度洗脱中二氯甲烷和甲醇的体积比为5-30：1，第三次梯度洗脱中石油醚和乙酸乙酯的体积比为1-4：1-5；薄层色谱显色检测条件为：展开剂为体积比30-15：1的二氯甲烷和甲醇，显色剂为香草醛硫酸试剂，配方为2-5g：90ml：10ml的香草醛：乙醇：浓硫酸混合液。

15、在本发明优选的实施方式中，hplc分离条件为采用ods c18柱，以甲醇和水作为流动相进行洗脱，甲醇和水体积比60-75：25-40，洗脱时间为10-18min，洗脱速率为2.5-3ml/min。

16、在本发明优选的实施方式中，用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇分别萃取次数为3-5次，提取为加热回流，其中提取温度为78-90℃，提取次数为1-3次，减压浓缩至无醇味，乙醇水溶液的浓度为70%-90%。

17、在本发明优选的实施方式中，薄层色谱显色检测条件为：展开剂为体积比20：1的二氯甲烷和甲醇。显色剂为香草醛硫酸试剂，配方比例为香草醛：乙醇：浓硫酸，比例为2g：90ml：10ml）。

18、本发明所述的一对三萜类化合物在制备抗肿瘤药物中的用途，所述肿瘤包括肺癌，具体为nci-h460人肺癌细胞或nci-h1975人肺腺癌细胞相关肿瘤。

19、与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：

20、本发明对雪胆根茎进行提取，发现了一对三萜类化合物分别为化合物1和化合物2，其中化合物1为(2

s,3

s,16

r,20

r,22

r,23

s)-2,3,20,22-四羟基-16,23-环氧-葫芦-5,24-二烯-11-酮，结构式为：；化合物2为(2

s,3

s,16

r,20

r,22

s,23

r)-2,3,20,22-四羟基-16,23-环氧-葫芦-5,24-二烯-11-酮，结构式为

21、本发明发现，c-23位的绝对构型是决定该对化合物抗癌活性的关键，其中，23r构型的化合物表现出显著活性，而其23s对映体则基本无活性，本发明所述的化合物具有重要抗肿瘤活性，对肿瘤细胞具有较强的抑制作用，能够作为制备防治肿瘤药物的原料，具有较强的应用价值和市场前景，为开发新型高效抗肿瘤药物提供先导化合物或原料药。

1.一对三萜类化合物，其特征在于，所述三萜类化合物分别为化合物1和化合物2，其中化合物1为(2s,3s,16r,20r,22r,23s)-2,3,20,22-四羟基-16,23-环氧-葫芦-5,24-二烯-11-酮，结构式为：；化合物2为(2s,3s,16r,20r,22s,23r)-2,3,20,22-四羟基-16,23-环氧-葫芦-5,24-二烯-11-酮，结构式为。

2.根据权利要求1所述的一对三萜类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的一对三萜类化合物的制备方法，其特征在于，雪胆根茎与乙醇的质量体积比为1：8-15。

4.根据权利要求2所述的一对三萜类化合物的制备方法，其特征在于，第一次硅胶柱色谱分离中硅胶粒径为100-200目，第二次硅胶柱色谱分离和第三次硅胶柱色谱分离硅胶粒径为200-300目；第一次和第二次梯度洗脱的洗脱剂为二氯甲烷和甲醇，第三梯度洗脱的洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯，其中第一次梯度洗脱中二氯甲烷和甲醇的体积比为1-10：1，第二次梯度洗脱中二氯甲烷和甲醇的体积比为5-30：1，第三次梯度洗脱中石油醚和乙酸乙酯的体积比为1-4：1-5；薄层色谱显色检测条件为：展开剂为体积比30-15：1的二氯甲烷和甲醇，显色剂为香草醛硫酸试剂，配方为2-5g：90ml：10ml的香草醛：乙醇：浓硫酸混合液。

5.根据权利要求2所述的一对三萜类化合物的制备方法，其特征在于，hplc分离条件为采用ods c18柱，以甲醇和水作为流动相进行洗脱，甲醇和水体积比60-75：25-40，洗脱时间为10-18min，洗脱速率为2.5-3ml/min。

6.根据权利要求2所述的一对三萜类化合物的制备方法，其特征在于，用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇分别萃取次数为3~5次，提取为加热回流，其中提取温度为78-90℃，提取次数为1-3次，减压浓缩至无醇味，乙醇水溶液的体积浓度为70%-90%。

7.根据权利要求1所述的一对三萜类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

8.根据权利要求1所述的一对三萜类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述化合物2具有显著抗肿瘤细胞活性。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括肺癌，肺癌为nci-h460人肺癌细胞或nci-h1975人肺腺癌细胞相关肿瘤。