一种含珍珠粉成分的细菌纤维素复合膜及其制备方法与流程

本发明涉及海南生物资源高值化利用及功能性生物基农业材料，具体涉及一种以海南优质珍珠粉为活性组分的细菌纤维素复合膜及其制备方法。本发明特别公开了两种珍珠粉-细菌纤维素复合膜的制备路径：（一）通过原位发酵将珍珠粉颗粒均匀负载于细菌纤维素三维网络中，得到钙元素均匀分布的复合膜；（二）通过乙酸完全水解珍珠粉后浸渍细菌纤维素，得到具有显著抑菌活性的复合膜。本发明从"结构均一负载"和"功能活性释放"两个维度解决了珍珠粉在细菌纤维素基材中难以有效复合的技术难题。

背景技术：

1、细菌纤维素（bacterial cellulose，bc）是由木醋杆菌等微生物发酵产生的天然纳米级纤维素材料，具有高纯度、高结晶度、高持水性、三维纳米网络结构、良好力学性能及生物相容性，已广泛应用于食品、包装、创面敷料及组织工程等领域。然而，未改性的细菌纤维素通常缺乏矿物活性成分和抑菌功能，其在功能性食品、活性敷料及护肤材料等方面的应用仍受到一定限制。

2、本发明所述珍珠粉主要成分包括碳酸钙、蛋白质、氨基酸和微量元素，具有补钙、促修复及一定生物活性。现有技术中，珍珠粉及其提取物已被应用于部分生物材料体系中。然而，珍珠粉直接用于细菌纤维素复合时仍存在以下问题：

3、（1）珍珠粉以难溶颗粒态存在，直接浸渍时易出现分布不均、局部团聚和外观缺陷；

4、（2）颗粒态珍珠粉中的有效组分释放受限，难以在细菌纤维素膜中充分发挥功能；

5、（3）现有细菌纤维素改性方法多采用高分子共混、无机抗菌剂负载或表面化学修饰等手段，对于珍珠粉这类兼具无机矿物和有机基质的天然原料，尚缺乏兼顾均匀负载与功能活性发挥的适宜路径。

6、因此，如何将珍珠粉或其活性组分有效导入细菌纤维素膜中，并分别实现结构均一化负载和功能活性释放，是本领域需要解决的技术问题。

7、经发明人对现有技术路径进行系统分析及实验验证发现：

8、（1）珍珠直接浸渍法（pearl extract infusion，pei）：将成型的细菌纤维素膜直接浸泡于珍珠粉悬浮液中。该方法虽然可以借助纳米级珍珠粉颗粒部分嵌入细菌纤维素网络，但珍珠粉颗粒不能溶解释放有效成分，分布严重不均（出现明显的局部团聚和色斑），抑菌环径为0 mm（无抑菌活性），外观品质差。

9、（2）现有掺杂珍珠粉的高分子材料体系：如cn117084969a公开的"掺杂珍珠粉的可注射水凝胶"，依靠壳聚糖-海藻酸钠-β-甘油磷酸钠等多组分体系通过聚电解质络合包裹珍珠粉颗粒，珍珠粉仍以颗粒形式存在，需依赖凝胶降解才能释放，且不适用于已成型的细菌纤维素膜体系；又如cn120556268a公开的"纳米珍珠粉改性抗菌亲肤布料"，需先制备粒径≤100 nm的纳米珍珠粉再借助胶黏剂（萜烯树脂/水性聚氨酯/松香）锚定于布料表面，工艺复杂、引入大量化学胶黏剂，且对细菌纤维素这类体现高度生物相容性的纳米纤维网络并不适用。

10、（3）珍珠原位发酵（in-situ fermentation of pearls，ifp）的空白：目前尚未见将珍珠粉直接添加于细菌纤维素发酵培养基进行原位共培养以制备复合膜的报道。

11、（4）珍珠酸解浸渍法（pearl acid hydrolyzed impregnation，pahi），能够将珍珠粉中的钙离子、氨基酸和小分子肽等有效成分高效负载于细菌纤维素膜中，并使其具有显著抑菌活性和高钙含量的制备方法，具有重要的应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种珍珠粉复合细菌纤维素膜及其制备方法，以解决现有技术中珍珠粉直接用于细菌纤维素复合时存在的颗粒分布不均、有效成分释放不足以及功能活性难以体现的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供两种可选的制备路径：

3、路径一：原位发酵法（ifp）

4、将珍珠粉加入细菌纤维素发酵培养基中，在产纤维素菌株发酵生成细菌纤维素的过程中，使珍珠粉颗粒被形成中的细菌纤维素纳米纤维网络包埋，从而获得颗粒分布较均匀、钙元素分布较一致的复合膜。该路径适用于强调结构均一性、矿物成分稳定负载及补钙功能的应用场景。

5、路径二：酸解浸渍法（pahi）

6、先采用乙酸对珍珠粉进行水解，使珍珠粉中的不溶性矿物组分转化为可溶性钙盐，并使珍珠来源有机组分以小分子形式释放，再利用所得酸水解液浸渍脱水细菌纤维素膜，使可溶性钙离子及有机活性组分进入细菌纤维素网络中，获得具有抑菌活性的复合膜。该路径适用于强调功能释放和抑菌活性的应用场景。

7、本发明进一步通过颗粒直接浸渍法（pei）、原位发酵法（ifp）和酸解浸渍法（pahi）的对比发现：珍珠粉以颗粒形式存在于细菌纤维素膜中时，虽可提高膜中钙含量，但难以赋予膜明显抑菌功能；而当珍珠粉经酸解转化为可溶性组分后，可显著提高其在细菌纤维素膜中的功能活性。该结果说明，在珍珠粉-细菌纤维素复合体系中，活性组分的可溶化导入是获得抑菌功能的关键。

8、与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

9、1. 提供了适用于珍珠粉-细菌纤维素复合体系的两类技术路径，分别满足结构型负载和功能型负载需求；

10、2. 原位发酵法可改善珍珠粉颗粒在细菌纤维素膜中的分布均匀性；

11、3. 酸解浸渍法可将珍珠粉中的可溶性钙及有机活性组分导入细菌纤维素膜中，使所得复合膜具有明确抑菌活性；

12、4. 通过不同复合路径对比，揭示了珍珠粉在细菌纤维素中由颗粒态负载向可溶性活性组分负载转变后功能表现的差异，为珍珠来源天然组分在生物基功能材料中的应用提供了新的技术思路。

13、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案

14、原位发酵法制备含珍珠粉成分的细菌纤维素复合膜（ifp法），包括以下步骤：

15、步骤1.1：配制细菌纤维素发酵培养基（含碳源、氮源、无机盐等常规成分），将珍珠粉于灭菌后按0.2%~0.8%（m/v，优选0.6%~0.8%）的比例均匀分散于发酵培养基中，得到含珍珠粉的发酵培养基，121℃，20 min灭菌处理。

16、步骤1.2：接种木醋杆菌于步骤1.1所得培养基中，静置发酵培养，培养温度28~30℃，培养时间2-7天，使细菌纤维素纳米纤维在含珍珠粉的体系中生长并原位包埋珍珠粉颗粒。

17、步骤1.3：取出复合膜，依次以去离子水、稀naoh溶液（0.1 m, 80℃, 120 min）和去离子水洗涤纯化至中性，去除菌体和残余培养基。

18、步骤1.4：经巴氏杀菌备用，即得含珍珠粉的原位发酵细菌纤维素复合膜（ifp组）。

19、酸解浸渍法制备含珍珠粉成分的细菌纤维素复合膜（pahi法），包括以下步骤：

20、步骤2.1：珍珠粉酸水解液（pahi）的制备

21、由珍珠粉、冰乙酸和去离子水构成完整水解体系（总体积20份）。固定珍珠粉用量2份，加入冰乙酸2~8份（优选4~6份），补加去离子水至总体系20份，于室温至50℃下以120 r/min搅拌反应至珍珠粉完全溶解，定容后得到澄清透明的10%(m/v)高浓度珍珠粉酸水解液（母液）。使用前以去离子水稀释至目标浓度0.6%~1.2%(m/v)。

22、经系统优化,乙酸/珍珠粉份数比为 0/2、2/2、3/2、4/2、6/2、8/2,，当乙酸/珍珠粉份数比≥3/2时，珍珠粉可被高效水解，水解液澄清透明；优选4/2~6/2。

23、步骤2.2：细菌纤维素膜的预处理

24、将细菌纤维素湿膜经清洗、压榨脱水后备用。

25、步骤2.3：浸渍复合

26、将脱水细菌纤维素与步骤2.1所得目标浓度珍珠粉酸水解液按质量体积比 1:20(m/v)混合，于室温下以200 r/min搅拌浸泡2~24小时,优选12小时，使水解液中的可溶性钙离子、氨基酸和小分子肽充分扩散进入细菌纤维素网络。

27、步骤2.4：清洗与成型

28、取出复合膜，测得残液ph约为4.2~4.8，以去离子水冲洗去除表面残留杂质，沥干后经巴氏杀菌备用，即得酸解浸渍法细菌纤维素复合膜（pahi组）。

29、所得含珍珠粉成分的细菌纤维素复合膜的特征在于：

30、ifp组复合膜：珍珠粉颗粒被均匀包埋于细菌纤维素三维网络中，钙元素分布高度均匀；sem显示珍珠粉颗粒被纳米纤维紧密包裹；xrd和ft-ir结果证实纤维素基本结晶结构未被破坏，并出现特征峰；干物质钙含量随发酵浓度梯度升高而升高；但因钙盐以纳米颗粒形式存在、有效成分难以释放，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均无抑菌活性。

31、pahi组复合膜：珍珠粉有效成分以离子和小分子形式均匀负载于纤维素网络中；对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有显著抑菌活性，当珍珠粉浓度为1.2%时，抑菌环径分别达 6.51±0.57 mm 和3.20±0.22 mm；xrd和ft-ir结果证实钙盐及有机组分成功负载且未破坏纤维素结晶结构。

32、本发明与现有技术相比的有益效果是：

33、（1）首创原位发酵复合路径：本发明首次将珍珠粉引入细菌纤维素发酵培养体系，利用微生物原位合成纳米纤维网络的过程将珍珠粉颗粒均匀锚定，无需任何化学胶黏剂或交联剂，实现了珍珠粉在细菌纤维素中的真正"原位均匀负载"，钙元素分布均匀性显著优于直接浸渍法（pei法）。该路径填补了珍珠粉-细菌纤维素原位发酵复合的技术空白。

34、（2）创新性提出酸解浸渍路径：相比于现有以颗粒形式负载珍珠粉的方法（包括pei法、ifp法以及对比文件cn117084969a和cn120556268a中以颗粒形式包裹/锚定的方法），本发明通过乙酸完全水解将珍珠粉转化为可溶性活性组分，从根本上解决了珍珠粉有效成分难以释放的问题，赋予复合膜显著的抑菌活性（金黄色葡萄球菌抑菌环径达6.51mm，大肠杆菌达3.20 mm），实现了从"物理掺杂"到"活性释放"的本质突破。

35、（3）两种路径功能互补、应用场景广：

36、ifp法所得膜结构均一、钙元素分布均匀，适用于功能性补钙食品（如高钙椰果）、缓释补钙基材；

37、pahi法所得膜抑菌活性显著，适用于抑菌敷料、活性面膜基材、抑菌包装等场景。

38、（4）工艺绿色环保：本发明全程不使用任何化学胶黏剂、合成抗菌剂或交联剂，仅以食品级乙酸为水解剂，原料天然、操作温和（室温~50℃），符合食品级和医用级材料的安全要求。

39、（5）明确揭示构效关系：本发明通过ifp、pei、pahi三种路径的系统对比，首次明确证明：珍珠粉以颗粒形式存在时无法在细菌纤维素中发挥抑菌作用；只有将其水解为可溶性小分子组分，才能实现抑菌功能。这一发现为珍珠粉在生物基功能材料中的应用提供了重要的理论依据和技术路线。