一种提高海藻糖合成酶可溶性表达的促融标签组合及其应用的制作方法

本发明涉及工业酶分子表达、微生物基因工程、酶制剂发酵生产，更具体的说是涉及一种提高海藻糖合成酶可溶性表达的促融标签组合及其应用。

背景技术：

1、海藻糖是一种非还原性双糖，具备耐高温、抗脱水、保护生物大分子活性等优良特性，广泛用于食品保鲜、医药冻干保护剂、化妆品保湿等领域。酶法催化麦芽糖转化制备海藻糖是当前工业化主流绿色工艺，核心催化元件为海藻糖合成酶 （tres），提升重组海藻糖合成酶的发酵表达量与可溶性是降低海藻糖生产综合成本的关键。

2、目前工业化生产海藻糖合成酶普遍采用大肠杆菌异源表达体系，但野生型海藻糖合成酶自身疏水残基占比高、折叠效率差，直接表达极易发生错误折叠，大量聚集形成不溶性包涵体，可溶性蛋白占比不足35%；包涵体复性工艺流程繁琐、蛋白回收率低，复性过程会造成40%以上酶活损失，大幅增加下游纯化、制备成本，制约工业化放大生产。

3、现有改善蛋白可溶性的常规手段多采用单一促融标签，如his标签、gst标签、mbp标签、nusa标签等：his标签促融能力弱，仅适用于低疏水小分子蛋白；gst标签分子量大，会显著降低目的蛋白催化活力；单独mbp或nusa标签仅能小幅提升可溶性，针对高疏水海藻糖合成酶提升幅度有限，仍存在大量包涵体；同时现有标签与目的蛋白之间酶切位点设计不合理，切除标签过程会损伤海藻糖合成酶活性中心，造成酶活大幅下降。

4、现阶段行业内缺少适配海藻糖合成酶的高效串联促融标签组合，未形成标准化的标签筛选、表达优化、酶活验证一体化改造流程，难以兼顾高可溶性、高酶活、低成本纯化三大工业化需求。

5、因此，开发一种新型促融标签组合，从根源解决海藻糖合成酶包涵体表达难题，对海藻糖工业化大规模生产具有重要实用价值

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种提高海藻糖合成酶可溶性表达的促融标签组合及其应用。涉及适配海藻糖合成酶的串联促融标签组合构建、重组载体构建方法、大肠杆菌高效可溶性表达工艺，适用于食品级海藻糖合成酶的规模化发酵制备，可拓展应用于各类难溶工业酶的异源可溶性改造。

2、具体的，本发明构建nusa+mbp串联促融标签组合，搭配 （ggs）5柔性连接肽与tev温和酶切位点，将大肠杆菌中海藻糖合成酶可溶性表达率由32%提升至90%以上，从根源解决传统表达体系包涵体产量高、酶活损失大的行业痛点；本发明优化配套低温低浓度iptg诱导发酵工艺，mbp标签可实现一步亲和纯化，整体酶制备生产成本降低30%；同时建立标准化改造流程，可通用拓展至dpe、脂肪酶、木聚糖酶等各类疏水难溶工业酶改造。本发明操作简便、发酵稳定性强、适合15 l及以上发酵罐工业化放大生产，为海藻糖大规模酶法合成提供足量高活性可溶性酶源，具备极高产业化价值。

3、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

4、一种提高海藻糖合成酶可溶性表达的促融标签组合，促融标签组合为nusa与mbp串联结构，从n端至c端依次包含：nusa促融标签、（ggs）5柔性连接肽、mbp促融标签、tev蛋白酶酶切位点。

5、优选的：nusa促融标签编码碱基序列如seq id no.7所示，氨基酸序列如seq idno.8所示；（ggs）5柔性连接肽碱基序列如seq id no.13所示，氨基酸序列如seq id no.14所示；mbp 促融标签编码碱基序列如seq id no.9所示，氨基酸序列如seq id no.10所示；tev酶切位点碱基序列如seq id no.15所示，氨基酸序列如seq id no.16所示。

6、本发明还提供了一种携带任一上述促融标签组合和目标基因的重组表达载体。

7、优选的：用于用于海藻糖合成酶、dpe差向异构酶、木聚糖酶、脂肪酶的可溶性改造。

8、优选的：以pet-28a （+）为骨架，载体上融合基因片段顺序为：nusa-（ggs）5-mbp-tev-tres，融合基因表达的氨基酸序列如seq id no.17所示。

9、本发明还提供了一种基因工程菌，转化任一上述重组表达载体获得。

10、本发明还提供了上述基因工程菌的可溶性发酵表达方法，基因工程菌转化上述重组表达载体获得，包括以下步骤：

11、（1）种子培养：基因工程菌接种lb卡那霉素培养基，37℃振荡培养至od600=0.6；

12、（2）低温诱导：加入终浓度0.2 mm iptg，18℃、160 r/min低温诱导16 h；

13、（3）菌体破碎离心，上清液为高可溶性重组海藻糖合成酶粗酶液。

14、本发明还提供了一套工业酶可溶性改造标准化方法，包括使用上述促融标签组合筛选、发酵表达条件正交优化、酶活验证。

15、优选的：应用于海藻糖合成酶、dpe差向异构酶、木聚糖酶、脂肪酶。

16、本发明还提供了上述促融标签组合在制备可溶性海藻糖合成酶、dpe差向异构酶中的工业化应用。

17、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种提高海藻糖合成酶可溶性表达的促融标签组合及其应用，取得的技术效果为：

18、（1）克服现有单一促融标签促融效率不足、海藻糖合成酶易形成包涵体的缺陷，提供mbp+nusa串联促融标签组合，将重组海藻糖合成酶可溶性表达率提升至90%以上；

19、（2）优化标签与海藻糖合成酶之间的连接肽及专用酶切位点，在完整切除促融标签的前提下，最大程度保留海藻糖合成酶原始催化活力，消除标签对酶活的抑制作用；

20、（3）建立一套标准化“标签组合筛选-表达条件优化-酶活验证”完整操作流程，流程可直接迁移应用至其他疏水难溶工业酶的可溶性改造；

21、（4）大幅简化下游蛋白纯化步骤，降低海藻糖合成酶整体制备成本30%，为工业催化提供足量高活性可溶性酶源。

1.一种提高海藻糖合成酶可溶性表达的促融标签组合，其特征在于，所述促融标签组合为nusa与mbp串联结构，从n端至c端依次包含：nusa促融标签、（ggs）5柔性连接肽、mbp促融标签、tev蛋白酶酶切位点。

2. 如权利要求1所述的促融标签组合，其特征在于，nusa促融标签编码碱基序列如seqid no.7所示，氨基酸序列如seq id no.8所示；（ggs）5柔性连接肽碱基序列如seq idno.13所示，氨基酸序列如seq id no.14所示；mbp 促融标签编码碱基序列如seq id no.9所示，氨基酸序列如seq id no.10所示；tev酶切位点碱基序列如seq id no.15所示，氨基酸序列如seq id no.16所示。

3.一种携带权利要求1或2任一所述促融标签组合和目标基因的重组表达载体。

4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，用于用于海藻糖合成酶、dpe差向异构酶、木聚糖酶、脂肪酶的可溶性改造。

5. 如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，以pet-28a （+）为骨架，载体上融合基因片段顺序为：nusa-（ggs）5-mbp-tev-tres，融合基因表达的氨基酸序列如seq idno.17所示。

6.一种基因工程菌，其特征在于，转化权利要求3~5任一所述重组表达载体获得。

7.权利要求6所述基因工程菌的可溶性发酵表达方法，其特征在于，所述基因工程菌转化权利要求5所述重组表达载体获得，包括以下步骤：

8.一套工业酶可溶性改造标准化方法，其特征在于，包括使用权利要求1所述促融标签组合筛选、发酵表达条件正交优化、酶活验证。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，应用于海藻糖合成酶、dpe差向异构酶、木聚糖酶、脂肪酶。

10.权利要求1或2所述促融标签组合在制备可溶性海藻糖合成酶、dpe差向异构酶中的工业化应用。