用于检测博德特氏菌属的方法与流程

本公开提供用于确定表现出百日咳样症状的患者是否从抑制霍氏博德特氏菌(bordetella holmesii)的治疗剂的治疗中获益的方法。这些方法基于通过测定is481、is1001和his1001靶向重复序列的存在来检测生物样品中的百日咳博德特氏菌(bordetella pertussis)、副百日咳博德特氏菌(bordetella parapertussis)和霍氏博德特氏菌。还提供用于实施所述方法的试剂盒。

背景技术：

1、提供以下对本公开的背景的描述仅为了帮助读者理解本公开，而不承认描述或构成本公开的现有技术。

2、百日咳博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌通常在人类中引起百日咳，一种高传染性和急性呼吸系统疾病。hoppe je., pediatr infect dis j. 18:375-81 (1999)；mattoo等, clin. microbiol. rev., 18: 326-382 (2005)。百日咳的症状包括剧烈咳嗽的发作伴随吸气性咳嗽和有时呕吐。在极端情况下，百日咳症状可导致低氧、永久性脑损害或者甚至死亡。在一些情况下，支气管炎博德特氏菌(b. bronchiseptica)和霍氏博德特氏菌感染可导致百日咳样症状。

3、在其早期诊断百日咳可为困难的，尤其是因为其症状类似于其他常见的呼吸疾病(如支气管炎、感冒或流感)中观察到的那些症状。传统上，细菌培养物已经用于明确诊断百日咳。粘液获自患者鼻子和/或喉咙，且送至医学实验室用于培养。虽然阳性结果被认为是决定性的，但博德特氏菌属培养通常需要5到7天以获得诊断。由于该细菌的苛刻本性，博德特氏菌属菌种细菌培养物还易于得到假阳性结果。

4、抗体测定(包括elisa)还用于通过检测特征的细菌抗原来诊断博德特氏菌属菌种。最常见的是，百日咳毒素蛋白的检测作为博德特氏菌属感染的指标。虽然这些基于抗体的测定具有良好的灵敏度和特异性，但它们通常需要患者的血液样品，而不是非侵入性获得的粘液样品，并且需要感染处于早期和/或恢复期。如果在疾病进展期间没有在适当的时间窗口获得患者样品，则这些测定可能得到假阴性结果。用于检测博德特氏菌属感染的其他方法包括直接荧光抗体(dfa)测试，其受限于灵敏度的缺乏。

5、因此，对于能够快速检测和区分单个生物样品中多个相关的博德特氏菌属菌种(如百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和霍氏博德特氏菌)的更稳固和灵敏的方法存在巨大需求。

技术实现思路

1、本公开提供用于检测和区分生物样品中多个相关的致病性博德特氏菌属菌种(即百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和霍氏博德特氏菌)的组合物和方法。在另一方面，本技术的方法和组合物在为表现出百日咳样症状的受试者选择最佳治疗方案中是有用的。预期本文公开的方法允许快速、灵敏和同时检测对应于is481、is1001和his1001多拷贝插入序列(is)的一个或多个靶核酸序列。生物样品中is481、is1001和his1001重复元件的检测在分别确定百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和霍氏博德特氏菌的存在中是有用的。在一些实施方案中，治疗方案包括氟喹诺酮类(fluoroquinolones)、碳青霉烯类(carbapenems)、甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异噁唑(trimethoprim-sulfamethoxazole)、霍氏博德特氏菌-特异性抗体、全细胞(wp)百日咳博德特氏菌疫苗、无细胞百日咳博德特氏菌疫苗、泰利霉素(telithromycin)和大环内酯类抗生素中的一种或多种。本技术的方法可在未处理的生物样品上实施，得到直接的、流线化的样品至结果过程。

2、因此，在一方面，本公开提供用于检测生物样品中至少一种致病性博德特氏菌属菌种的存在的方法，其包括：(a)使该生物样品与下列接触：(i)扩增is481靶核酸的第一引物对，其包括与seq id no: 1或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸；(ii)扩增is1001靶核酸的第二引物对，其包括与seq id no: 2或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸；和(iii)扩增his1001靶核酸的第三引物对，其包括与seq id no: 3或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸；以在其中发生is481、is1001和his1001靶核酸(如果其存在于生物样品中的话)的扩增而不从该生物样品中提取该靶核酸的情况下产生反应-样品混合物；(b)使反应-样品混合物经受实时pcr条件，在该条件下扩增该生物样品中存在的各靶核酸以产生荧光信号；(c)检测由在步骤(b)中产生的各扩增的靶核酸生成的该荧光信号；和(d)通过评价各靶核酸的荧光信号来检测该生物样品中至少一种致病性博德特氏菌属菌种的存在，由此(i)当检测到针对his1001靶核酸的荧光信号时，在该生物样品中检测到霍氏博德特氏菌(b. holmesii)；(ii)当检测到针对is1001靶核酸的荧光信号时，在该生物样品中检测到副百日咳博德特氏菌(b. parapertussis)；和(iii)当检测到针对is481靶核酸的荧光信号且未检测到针对his1001靶核酸的荧光信号时，在该生物样品中检测到百日咳博德特氏菌(b.pertussis)，其中该致病性博德特氏菌属菌种是百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和霍氏博德特氏菌中的一种或多种；且其中该生物样品在扩增前不经提取或纯化步骤。实时pcr扩增可在与集成的热循环仪协作的直接扩增盘中进行。该生物样品可包括鼻咽(np)抽吸物或洗涤物、鼻拭子或细菌分离物。

3、在接触生物样品前，所有引物对可一起包含在扩增主混合物中，该混合物进一步包括dna聚合物、dntps和pcr缓冲液。此外，该扩增主混合物可进一步包括在严格条件下特异性杂交至对照靶核酸的第四对引物对。

4、该生物样品可单独或同时接触到这些引物对的一个或多个。其中该接触同时发生(即多路技术)，第一、第二和第三引物对中的一个或多个与该生物样品接触且互相接触以扩增靶核酸序列。

5、在该方法的一些实施方案中，第一引物对由包括5’ ccataagcatgcccgatt 3’(seq id no: 11)的第一正向引物和包括5’ cgcttcaggcacacaaact 3’ (seq id no: 10)的第一反向引物组成。此外或可替换地，在一些实施方案中，第二引物对由包括5’cggctcgacgaattgc 3’ (seq id no: 7)的第二正向引物和包括5’ agttcgtcacgcaggacat3’ (seq id no: 8)的第二反向引物组成。在任一上述实施方案中，第三引物对由包括5’ggcacggatcgaggttttt 3’ (seq id no: 4)的第三正向引物和包括5’tacggccgtgaagtgataga 3’ (seq id no: 5)的第三反向引物组成。

6、任选地，对照核酸和与对照核酸的区段互补的第四引物对可包括于扩增混合物中。在一些实施方案中，对照核酸包括seq id no: 13。在某些实施方案中，该第四引物对由包括5’ gcttcagtaccttcggcttg 3’ (seq id no: 17)的第四正向引物和包括5’ttgcaggcatctctgacaac 3’ (seq id no: 18)的第四反向引物组成以生成seq id no: 20的对照靶核酸。

7、在一些实施方案中，该方法进一步包括使该生物样品与能够特异性杂交至seq idno: 1的is481靶核酸的区段的第一核酸探针接触，其中该第一核酸探针是可检测标记的，且包括5’ tcaattgctggaccatttcgagtcgac 3’ (seq id no: 12)。此外或可替换地，在一些实施方案中，该方法进一步包括使该生物样品与能够特异性杂交至seq id no: 2的is1001靶核酸的互补物的区段的第二核酸探针接触，其中该第二核酸探针是可检测标记的，且包括5’ caaccagccgctgctgacggtc 3’ (seq id no: 9)。此外或可替换地，在一些实施方案中，该方法进一步包括使该生物样品与能够特异性杂交至seq id no: 3的his1001靶核酸的区段的第三核酸探针接触，其中该第三核酸探针是可检测标记的，且包括5’agtcgctggctactgctgcgca 3’ (seq id no: 6)。

8、在该方法的某些实施方案中，该第一核酸探针是用fam荧光团标记的，且该第二核酸探针是用crf610荧光团可检测标记的，且该第三核酸探针是用joe荧光团可检测标记的。

9、在任一上述实施方案中，该方法进一步包括使该生物样品与第四核酸探针接触，其中该第四核酸探针是可检测标记的且包括5’ tggctcttggcggtccagatg 3’ (seq id no:19)。在一些实施方案中，该第四核酸探针是用q670荧光团可检测标记的。

10、在另一方面，本公开提供用于选择表现出百日咳样症状的患者使用抑制霍氏博德特氏菌的治疗剂治疗的方法，其包括：(a)使获自该患者的生物样品与下列接触：(i)扩增is481靶核酸的第一引物对，其包括与seq id no: 1或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸；(ii)扩增is1001靶核酸的第二引物对，其包括与seq id no: 2或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸；和(iii)扩增his1001靶核酸的第三引物对，其包括与seq id no: 3或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸；以在其中发生is481、is1001和his1001靶核酸(如果其存在于生物样品中的话)的扩增而不从该生物样品中提取该靶核酸的情况下产生反应-样品混合物；(b)使反应-样品混合物经受实时pcr条件，在该条件下扩增该生物样品中存在的各靶核酸以产生荧光信号；(c)检测由在步骤(b)中产生的各扩增的靶核酸生成的该荧光信号；和(d)如果检测到针对his1001靶核酸的荧光信号，选择患者使用抑制霍氏博德特氏菌的治疗剂治疗，其中该生物样品在扩增前不经提取或纯化步骤。在一些实施方案中，实时pcr扩增在与集成的热循环仪协作的直接扩增盘中进行。该生物样品可包括鼻咽(np)抽吸物或洗涤物、鼻拭子或细菌分离物。

11、在该方法的一些实施方案中，第一引物对由包括5’ ccataagcatgcccgatt 3’(seq id no: 11)的第一正向引物和包括5’ cgcttcaggcacacaaact 3’ (seq id no: 10)的第一反向引物组成。此外或可选择地，在一些实施方案中，第二引物对由包括5’cggctcgacgaattgc 3’ (seq id no: 7)的第二正向引物和包括5’ agttcgtcacgcaggacat3’ (seq id no: 8)的第二反向引物组成。在任一上述实施方案中，第三引物对由包括5’ggcacggatcgaggttttt 3’ (seq id no: 4)的第三正向引物和包括5’tacggccgtgaagtgataga 3’ (seq id no: 5)的第三反向引物组成。

12、任选地，对照核酸和与对照核酸的区段互补的第四引物对可包括于扩增混合物中。在一些实施方案中，该对照核酸包括seq id no: 13。在某些实施方案中，第四引物对由包括5’ gcttcagtaccttcggcttg 3’ (seq id no: 17)的第四正向引物和包括5’ttgcaggcatctctgacaac 3’ (seq id no: 18)的第四反向引物组成以生成seq id no: 20的对照靶核酸。

13、在一些实施方案中，该方法进一步包括使该生物样品与能够特异性杂交至seq idno: 1的is481靶核酸的区段的第一核酸探针接触，其中该第一核酸探针是可检测标记的且包括5’ tcaattgctggaccatttcgagtcgac 3’ (seq id no: 12)。此外或可替代地，在一些实施方案中，该方法进一步包括使该生物样品与能够特异性杂交至seq id no: 2的is1001靶核酸探针的互补物的区段的第二核酸探针接触，其中该第二核酸探针是可检测标记的且包括5’ caaccagccgctgctgacggtc 3’ (seq id no: 9)。此外或可替代地，在一些实施方案中，该方法进一步包括使该生物样品与能够特异性杂交至seq id no: 3的his1001靶核酸的区段的第三核酸探针接触，其中该第三核酸探针是可检测标记的且包括5’agtcgctggctactgctgcgca 3’ (seq id no: 6)。

14、在该方法的某些实施方案中，该第一核酸探针是用fam荧光团可检测标记的，该第二核酸探针是用cfr610荧光团可检测标记的，和该第三核酸探针是用joe荧光团可检测标记的。

15、在任一上述实施方案中，该方法进一步包括使该生物样品与第四核酸探针接触，其中该第四核酸探针是可检测标记的且包括5’ tggctcttggcggtccagatg 3’ (seq id no:19)。在一些实施方案中，该第四核酸探针是用q670荧光团可检测标记的。

16、在一些实施方案中，抑制霍氏博德特氏菌的治疗剂是一种或多种选自下组的药剂：氟喹诺酮类、碳青霉烯类、甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异噁唑和霍氏博德特氏菌-特异性抗体。在某些实施方案中，该氟喹诺酮类选自下组：环丙沙星(ciprofloxacin)、吉米沙星(gemifloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、诺氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、曲伐沙星(rovafloxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、格雷沙星(grepafloxacin)、替马沙星(temafloxacin)、洛米沙星(lomefloxacin)、司帕沙星(sparfloxacin)、依诺沙星(enoxacin)和莫西沙星(moxifloxacin)。在一些实施方案中，该碳青霉烯类选自下组：亚胺培南(imipenem)、美罗培南(meropenem)、厄他培南(ertapenem)、多利培南(doripenem)、帕尼培南(panipenem)、比阿培南(biapenem)、阿祖培南(razupenem) (pz-601)、替比培南(tebipenem)、来那培南(lenapenem)、托莫培楠(tomopenem)和噻嗯培南(thienpenem) (噻烯霉素(thienamycin))。

17、在一方面，本公开提供一种用于选择表现出百日咳样症状的患者使用霍氏博德特氏菌-特异性抗体和额外的抑制副百日咳博德特氏菌的治疗剂治疗的方法，其包括：(a)使获自该患者的生物样品与下列接触：(i)扩增is481靶核酸的第一引物对，其包括与seq idno: 1或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸的；(ii)扩增is1001靶核酸的第二引物对，其包括与seq id no: 2或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸；(iii)扩增his1001靶核酸的第三引物对，其包括与seq id no: 3或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸；以在其中发生is481、is1001和his1001靶核酸(如果其存在于生物样品中的话)的扩增而不从该生物样品中提取该靶核酸的情况下产生反应-样品混合物；(b)使反应-样品混合物经受实时pcr条件，在该条件下扩增该生物样品中存在的各靶核酸以产生荧光信号；(c)检测由在步骤(b)中产生的各扩增的靶核酸生成的该荧光信号；和(d)如果检测到针对his1001靶核酸的荧光信号和针对is1001靶核酸的荧光信号，则选择患者使用霍氏博德特氏菌特异性抗体和额外的治疗剂治疗，其中该生物样品在扩增前不经提取或纯化步骤。

18、在一些实施方案中，额外的抑制副百日咳博德特氏菌的治疗剂是一种或多种选自下组的药剂：甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异噁唑、环丙沙星、吉米沙星、左氧氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、加替沙星、格雷沙星、替马沙星、洛米沙星、司帕沙星、依诺沙星和莫西沙星。

19、在一方面，本公开提供一种用于选择表现出百日咳样症状的患者使用抑制百日咳博德特氏菌的治疗剂和额外的抑制副百日咳博德特氏菌的治疗剂治疗的方法，其包括：(a)使获自该患者的生物样品与下列接触：(i)扩增is481的第一引物对，其包括与seq id no:1或其或互补序列至少85-95%相同的核苷酸；(ii)扩增is1001的第二引物对，其包括与seqid no: 2或其或互补序列至少85-95%相同的核苷酸；和(iii)扩增his1001的第三引物对，其包括与seq id no: 3或其或互补序列至少85-95%相同的核苷酸；以在其中发生is481、is1001和his1001靶核酸(如果其存在于生物样品中的话)的扩增而不从该生物样品中提取该靶核酸的情况下产生反应-样品混合物；(b)使反应-样品混合物经受实时pcr条件，在该条件下扩增该生物样品中存在的各靶核酸以产生荧光信号；(c)检测由在步骤(b)中产生的各扩增的靶核酸生成的该荧光信号；和(d)如果(i)检测到针对is481靶核酸的荧光信号和针对is1001靶核酸的荧光信号，且(ii)未检测到针对his1001靶核酸的荧光信号，则选择患者使用抑制百日咳博德特氏菌的治疗剂和额外的抑制副百日咳博德特氏菌的治疗剂治疗，其中该生物样品在扩增前不经提取或纯化步骤。

20、在该方法的一些实施方案中，其中额外的抑制副百日咳博德特氏菌的治疗剂是一种或多种选自下组的药剂：甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异噁唑、环丙沙星、吉米沙星、左氧氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、加替沙星、格雷沙星、替马沙星、洛米沙星、司帕沙星、依诺沙星和莫西沙星。

21、在该方法的一些实施方案中，其中抑制百日咳博德特氏菌的治疗剂是一种或多种选自下组的药剂：全细胞(wp)百日咳博德特氏菌疫苗、非细胞百日咳博德特氏菌疫苗、泰利霉素和大环内酯类抗生素。在某些实施方案中，该大环内酯类抗生素选自下组：阿奇霉素(azithromycin) (希舒美(zithromax))、克拉霉素(clarithromycin) (biaxin)、红霉素(erythromycin) (e-mycin、eryc、ery-tab、pce、pediazole、无味红霉素(ilosone))和罗红霉素(roxithromycin)。

22、在另一方面中，本公开提供包含寡核苷酸的试剂盒，所述寡核酸酸可为用于进行如本文所述的扩增的引物或探针。

23、具体地，本发明包括但不限于如下各项：

24、1. 一种用于检测生物样品中至少一种致病性博德特氏菌属菌种(bordetellaspecies)的存在的方法，其包括：

25、(a) 使该生物样品与下列接触：

26、i. 扩增is481靶核酸的第一引物对，其包括与seq id no: 1或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸；

27、ii. 扩增is1001靶核酸的第二引物对，其包括与seq id no: 2或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸；和

28、iii. 扩增his1001靶核酸的第三引物对，其包括与seq id no: 3或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸；

29、以在其中发生is481、is1001和his1001靶核酸(如果其存在于生物样品中的话)的扩增而不从该生物样品中提取该靶核酸的情况下产生反应-样品混合物；

30、(b) 使所述反应-样品混合物经受实时pcr条件，在该条件下扩增该生物样品中存在的各靶核酸以产生荧光信号;

31、(c) 检测由在步骤(b)中产生的各扩增的靶核酸生成的荧光信号；和

32、(d) 通过评估各靶核酸的荧光信号来检测该生物样品中至少一种致病性博德特氏菌属菌种的存在，由此

33、i. 当检测到针对his1001靶核酸的荧光信号时，在该生物样品中检测到霍氏博德特氏菌(b. holmesii)；

34、ii. 当检测到针对is1001靶核酸的荧光信号时，在该生物样品中检测到副百日咳博德特氏菌(b. parapertussis)；和

35、iii. 当检测到针对is481靶核酸的荧光信号且未检测到针对his1001的荧光信号时，在该生物样品中检测到百日咳博德特氏菌(b. pertussis)；

36、其中该致病性博德特氏菌属菌种是百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和霍氏博德特氏菌中的一种或多种；和

37、其中该生物样品在扩增前不经提取或纯化步骤。

38、2. 项1的方法，其中该第一引物对由包含5’ ccataagcatgcccgatt 3’ (seq idno: 11)的第一正向引物和包含5’ cgcttcaggcacacaaact 3’ (seq id no: 10)的第一反向引物对组成。

39、3. 项1或项2的方法，其中该第二引物对由包含5’ cggctcgacgaattgc 3’ (seqid no: 7)的第二正向引物和包含5’ agttcgtcacgcaggacat 3’ (seq id no: 8) 的第二反向引物组成。

40、4. 项1-3任一项的方法，其中该第三引物对由包含5’ ggcacggatcgaggttttt 3’(seq id no: 4)的第三正向引物和包含5’ tacggccgtgaagtgataga 3’ (seq id no: 5)的第三反向引物组成。

41、5. 项1-4任一项的方法，其进一步包括使该生物样品与能够特异性杂交至seq idno: 1的is481靶核酸的区段的第一核酸探针接触，其中该第一核酸探针是可检测标记的且包含5’ tcaattgctggaccatttcgagtcgac 3’ (seq id no: 12)。

42、6. 项5的方法，其中该第一核酸探针是用fam荧光团可检测标记的。

43、7. 项1-6任一项的方法，其进一步包括使该生物样品与能够特异性杂交至seq idno: 2的is1001靶核酸的互补物的区段的第二核酸探针接触，其中该第二核酸探针是可检测标记的且包含5’ caaccagccgctgctgacggtc 3’ (seq id no: 9)。

44、8. 项7的方法，其中该第二核酸探针是用cfr610荧光团可检测标记的。

45、9. 项1-8任一项的方法，其进一步包括使该生物样品与能够特异性杂交至seq idno: 3的his1001靶核酸的区段的第三核酸探针接触，其中该第三核酸探针是可检测标记的且包含5’ agtcgctggctactgctgcgca 3’ (seq id no: 6)。

46、10. 项9的方法，其中该第三核酸探针是用joe荧光团可检测标记的。

47、11. 项1-10任一项的方法，其进一步包括使该生物样品与扩增seq id no: 20的对照靶核酸的第四引物对接触。

48、12. 项11的方法，其中该第四引物对由包含5’ gcttcagtaccttcggcttg 3’ (seqid no: 17)的第四正向引物和包含5’ ttgcaggcatctctgacaac 3’ (seq id no: 18)的第四反向引物组成。

49、13. 项11或12的方法，其进一步包括使该生物样品与第四核酸探针接触，该第四核酸探针是可检测标记的且包含5’tggctcttggcggtccagatg 3’ (seq id no: 19)。

50、14. 项13的方法，其中该第四核酸探针是用q670荧光团可检测标记的。

51、15. 项1-14任一项的方法，其中实时pcr扩增在与集成的热循环仪协作的直接扩增盘中进行。

52、16. 项1-15任一项的方法，其中该生物样品是鼻咽(np)抽吸物或洗涤物、鼻拭子或细菌分离物。

53、17. 一种用于检测生物样品中至少一种致病性博德特氏菌属菌种的存在的试剂盒，其包括：

54、a. 扩增seq id no: 1的is481靶核酸或其互补物的第一引物对；

55、b. 扩增seq id no: 2的is1001靶核酸或其互补物的第二引物对；和

56、c. 扩增seq id no: 3的his1001靶核酸或其互补物的第三引物对；

57、18. 项17的试剂盒，其进一步包括扩增seq id no: 20的对照靶核酸的第四引物对。

58、19. 项17或18的试剂盒，其中该第一引物对能够与is481靶核酸特异性杂交，所述is481靶核酸包括与seq id no: 1或其互补物至少85-95%相同的核苷酸。

59、20. 项17-19任一项的试剂盒，其中该第二引物对能够与is1001靶核酸特异性杂交，所述is1001靶核酸包括与seq id no: 2或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸。

60、21. 项17-20任一项的试剂盒，其中该第三引物对能够与his1001靶核酸特异性杂交，所述his1001靶核酸包括与seq id no: 3或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸。

61、22. 项17-21任一项的试剂盒，其中该第一引物对由包含5’ ccataagcatgcccgatt3’ (seq id no: 11)的第一正向引物和包含5’ cgcttcaggcacacaaact 3’ (seq id no:10)的第一反向引物组成。

62、23. 项17-22任一项的试剂盒，其中该第二引物对由包含5’ cggctcgacgaattgc3’ (seq id no: 7)的第二正向引物和包含5’ agttcgtcacgcaggacat 3’ (seq id no: 8)的第二反向引物组成。

63、24. 项17-23任一项的试剂盒，其中该第三引物对由包含5’ggcacggatcgaggttttt 3’ (seq id no: 4)的第三正向引物和包含5’tacggccgtgaagtgataga 3’ (seq id no: 5)的第三反向引物组成。

64、25. 项17-24任一项的试剂盒，其中该试剂盒进一步包括能够与seq id no: 1的is481靶核酸的区段或其互补物特异性杂交的第一核酸探针，其中该第一核酸探针是可检测标记的。

65、26. 项25的试剂盒，其中该第一核酸探针包含5’ tcaattgctggaccatttcgagtcgac3’ (seq id no: 12)，或其互补物。

66、27. 项26的试剂盒，其中该第一核酸探针是用fam荧光团可检测标记的。

67、28. 项17-27任一项的试剂盒，其中该试剂盒进一步包括能够与seq id no: 2的is1001靶核酸的区段或其互补物特异性杂交的第二核酸探针，其中该第二核酸探针是可检测标记的。

68、29. 项28的试剂盒，其中该第二核酸探针包含5’ caaccagccgctgctgacggtc 3’(seq id no: 9)，或其互补物。

69、30. 项29的试剂盒，其中该第二核酸探针是用cfr610荧光团可检测标记的。

70、31. 项17-30任一项的试剂盒，其中该试剂盒进一步包括能够与seq id no: 3的his1001靶核酸的区段或其互补物特异性杂交的第三核酸探针，其中该第三核酸探针是可检测标记的。

71、32. 项31的试剂盒，其中该第三核酸探针包含5’ agtcgctggctactgctgcgca 3’(seq id no: 6)，或其互补物。

72、33. 项32的试剂盒，其中该第三核酸探针是用joe荧光团可检测标记的。

73、34. 一种用于选择表现出百日咳样症状的患者使用抑制霍氏博德特氏菌的治疗剂治疗的方法，其包括：

74、(a) 使获自该患者的生物样品与下列接触：

75、(i) 扩增is481靶核酸的第一引物对，其包括与seq id no: 1或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸；

76、(ii) 扩增is1001靶核酸的第二引物对，其包括与seq id no: 2或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸；和

77、(iii) 扩增his1001靶核酸的第三引物对，其包括与seq id no: 3或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸；

78、以在其中发生is481、is1001和his1001靶核酸(如果其存在于生物样品中的话)的扩增而不从该生物样品中提取该靶核酸的情况下产生反应-样品混合物；

79、(b) 使所述反应-样品混合物经受实时pcr条件，在该条件下扩增该生物样品中存在的各靶核酸以产生荧光信号；

80、(c) 检测由在步骤(b)中产生的各扩增的靶核酸生成的该荧光信号；和

81、(d) 如果检测到针对his1001靶核酸的荧光信号，则选择患者使用抑制霍氏博德特氏菌的治疗剂治疗，

82、其中该生物样品在扩增前不经提取或纯化步骤。

83、35. 项34的方法，其中该第一引物对由包含5’ ccataagcatgcccgatt 3’ (seq idno: 11)的第一正向引物和包含5’ cgcttcaggcacacaaact 3’ (seq id no: 10)的第一反向引物组成。

84、36. 项34或项35的方法，其中该第二引物对由包含5’ cggctcgacgaattgc 3’(seq id no: 7)的第二正向引物和包含5’ agttcgtcacgcaggacat 3’ (seq id no: 8)的第二反向引物组成。

85、37. 项34-36任一项的方法，其中该第三引物对由包含5’ ggcacggatcgaggttttt3’ (seq id no: 4)的第三正向引物和包含5’ tacggccgtgaagtgataga 3’ (seq id no:5)的第三反向引物组成。

86、38. 项34-37任一项的方法，其进一步包括使该生物样品与能够特异性杂交至seqid no: 1的is481靶核酸的区段的第一核酸探针接触，其中该第一核酸探针是可检测标记的且包含5’ tcaattgctggaccatttcgagtcgac 3’ (seq id no: 12)。

87、39. 项38的方法，其中该第一核酸探针是用fam荧光团可检测标记的。

88、40. 项34-39任一项的方法，其进一步包括使该生物样品与能够特异性杂交至seqid no: 2的is1001靶核酸的互补物的区段的第二核酸探针接触，其中该第二核酸探针是可检测标记的且包含5’ caaccagccgctgctgacggtc 3’ (seq id no: 9)。

89、41. 项40的方法，其中该第二核酸探针是用cfr610荧光团可检测标记的。

90、42. 项34-41任一项的方法，其进一步包括使该生物样品与能够特异性杂交至seqid no: 3的his1001靶核酸的区段的第三核酸探针接触，其中该第三核酸探针是可检测标记的且包含5’ agtcgctggctactgctgcgca 3’ (seq id no: 6)。

91、43. 项42的方法，其中该第三核酸探针是用joe荧光团可检测标记的。

92、44. 项34-43任一项的方法，其进一步包括使该生物样品与扩增seq id no: 20的对照靶核酸的第四引物对接触。

93、45. 项44的方法，其中该第四引物对由包含5’ gcttcagtaccttcggcttg 3’ (seqid no: 17)的第四正向引物和包含5’ ttgcaggcatctctgacaac 3’ (seq id no: 18)的第四反向引物组成。

94、46. 项44或45的方法，其进一步包括使该生物样品与第四核酸探针接触，其中该第四核酸探针是可检测标记的且包含5’ tggctcttggcggtccagatg 3’ (seq id no: 19)。

95、47. 项46的方法，其中该第四核酸探针是用q670荧光团可检测标记的。

96、48. 项34-47任一项的方法，其中实时pcr扩增是在与集成的热循环仪协作的直接扩增盘中进行。

97、49. 项34-48任一项的方法，其中该生物样品是鼻咽(np)抽吸物或洗涤物、鼻拭子或细菌分离物。

98、50. 项34-49任一项的方法，其中抑制霍氏博德特氏菌的治疗剂是一种或多种选自下组的药剂：氟喹诺酮类、碳青霉烯类、甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异噁唑和霍氏博德特氏菌-特异性抗体。

99、51. 项50的方法，其中该氟喹诺酮类选自下组：环丙沙星、吉米沙星、左氧氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星(rovafloxacin)、加替沙星、格雷沙星、替马沙星、洛米沙星、司帕沙星(sparfloxacin)、依诺沙星(enoxacin)和莫西沙星。

100、52. 项50的方法，其中该碳青霉烯类选自下组：亚胺培南、美罗培南、厄他培南(ertapenem)、多利培南、帕尼培南、比阿培南、阿祖培南(razupenem) (pz-601)、替比培南、来那培南、托莫培楠(tomopenem)和噻嗯培南(thienpenem) (噻烯霉素(thienamycin))。

101、53. 一种用于选择表现出百日咳样症状的患者使用霍氏博德特氏菌-特异性抗体和额外的抑制副百日咳博德特氏菌的治疗剂治疗的方法，其包括：

102、(a) 使获自该患者的生物样品与下列接触：

103、(i) 扩增is481靶核酸的第一引物对，其包括与seq id no: 1或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸的；

104、(ii) 扩增is1001靶核酸的第二引物对，其包括与seq id no: 2或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸；和

105、(iii) 扩增his1001靶核酸的第三引物对，其包括与seq id no: 3或其互补序列至少85-95%相同的核苷酸；

106、以在其中发生is481、is1001和his1001靶核酸(如果其存在于生物样品中的话)的扩增而不从该生物样品中提取该靶核酸的情况下产生反应-样品混合物；

107、(b) 使反应-样品混合物经受实时pcr条件，在该条件下扩增该生物样品中存在的各靶核酸以产生荧光信号；

108、(c) 检测由在步骤(b)中产生的各扩增的靶核酸生成的该荧光信号；和

109、(d) 如果检测到针对his1001靶核酸的荧光信号和针对is1001靶核酸的荧光信号，选择患者使用霍氏博德特氏菌特异性抗体和额外的治疗剂治疗，

110、其中该生物样品在扩增前不经提取或纯化步骤。

111、54. 项53的方法，其中该额外的抑制副百日咳博德特氏菌的治疗剂是一种或多种选自下组的药剂：甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异噁唑、环丙沙星、吉米沙星、左氧氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星(rovafloxacin)、加替沙星、格雷沙星、替马沙星、洛米沙星、司帕沙星(sparfloxacin)、依诺沙星和莫西沙星。

112、55. 一种用于选择表现出百日咳样症状的患者使用抑制百日咳博德特氏菌的治疗剂和额外的抑制副百日咳博德特氏菌的治疗剂治疗的方法，其包括：

113、(a) 使获自该患者的生物样品与下列接触：

114、(i) 扩增is481的第一引物对，其包括与seq id no: 1或其或互补序列至少85-95%相同的核苷酸；

115、(ii) 扩增is1001的第二引物对，其包括与seq id no: 2或其或互补序列至少85-95%相同的核苷酸；和

116、(iii) 扩增his1001的第三引物对，其包括与seq id no: 3或其或互补序列至少85-95%相同的核苷酸；

117、以在其中发生is481、is1001和his1001靶核酸(如果其存在于生物样品中的话)的扩增而不从该生物样品中提取该靶核酸的情况下产生反应-样品混合物；

118、(b) 使反应-样品混合物经受实时pcr条件，在该条件下扩增该生物样品中存在的各靶核酸以产生荧光信号；

119、(c) 检测由在步骤(b)中产生的各扩增的靶核酸生成的该荧光信号；和

120、(d) 如果(i)检测到针对is481靶核酸的荧光信号和针对is1001靶核酸的荧光信号，且(ii)未检测到针对his1001靶核酸的荧光信号，则选择患者使用抑制百日咳博德特氏菌的治疗剂和额外的抑制副百日咳博德特氏菌的治疗剂治疗，

121、其中该生物样品在扩增前不经提取或纯化步骤。

122、56. 项55的方法，其中该额外的抑制副百日咳博德特氏菌的治疗剂是一种或多种选自下组的药剂：甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异噁唑、环丙沙星、吉米沙星、左氧氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星(rovafloxacin)、加替沙星、格雷沙星、替马沙星、洛米沙星、司帕沙星(sparfloxacin)、依诺沙星和莫西沙星。

123、57. 项55或56的方法，其中抑制百日咳博德特氏菌的治疗剂是一种或多种选自下组的药剂：全细胞(wp)百日咳博德特氏菌疫苗、非细胞百日咳博德特氏菌疫苗、泰利霉素和大环内酯类抗生素。

124、58. 项57的方法，其中该大环内酯类抗生素选自下组：阿奇霉素(希舒美(zithromax))、克拉霉素(biaxin)、红霉素(e-mycin、eryc、ery-tab、pce、pediazole、无味红霉素(ilosone))和罗红霉素。