一种从头合成乙基香兰素的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

本发明属于基因工程与微生物工程，涉及一种从头合成乙基香兰素的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。

背景技术：

1、乙基香兰素（ethyl vanillin），中文名称3-乙氧基-4-羟基苯甲醛，cas号121-32-4，是一种重要的香料化合物，其香气强度约为香兰素（3-甲氧基-4-羟基苯甲醛，cas号121-33-5）的3至4倍，具有用量少、性状稳定等特点，广泛应用于食品、日化及医药等领域，还可用作电镀增亮剂和饲料添加剂。

2、长期以来，乙基香兰素的工业生产主要依赖化学合成方法。传统化学合成工艺存在工艺链冗长、反应步骤多、副产物分离成本高、产率受限以及有机溶剂消耗量大、环境污染较为严重等问题。在生物合成方面，尽管有研究提示草莓等植物中可能存在天然来源的乙基香兰素，但其生物合成途径及代谢机制尚未明晰，难以直接用于微生物合成途径的构建。此外，与甲基化修饰相比，生物体内乙基化修饰的供体形式更为有限，如何在微生物胞内实现乙基供体的持续供给并将乙基定向转移至前体化合物的酚羟基上，是构建乙基香兰素从头生物合成途径面临的主要困难。因此，建立以廉价碳源为底物、条件温和且环境友好的乙基香兰素微生物合成方法，具有重要的技术意义。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是，针对现有乙基香兰素化学合成工艺存在的工艺链冗长、副产物分离成本高、产率受限、有机溶剂消耗量大及环境污染严重等缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种从头合成乙基香兰素的重组大肠杆菌及其构建方法与应用，实现以廉价葡萄糖为唯一碳源、以乙硫醇为乙基供体的乙基香兰素微生物发酵合成，为乙基香兰素的绿色工业化制备提供可行的技术支撑。为了达到该技术目的，本发明采用以下技术方案：

2、第一方面，本发明提供一种从头合成乙基香兰素的重组大肠杆菌的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：

3、s1.分别构建第一重组表达载体、第二重组表达载体、第三重组表达载体与第四重组表达载体，其中：

4、所述第一重组表达载体携带3-脱氢莽草酸脱氢酶编码基因；

5、所述第二重组表达载体携带羧酸还原酶编码基因与4′-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶编码基因；

6、所述第三重组表达载体携带儿茶酚-

o-甲基转移酶编码基因与甲硫氨酸腺苷转移酶编码基因；

7、所述第四重组表达载体携带

o-乙酰高丝氨酸巯化酶编码基因与酰基高丝氨酸转移酶编码基因；

8、s2.将所述第一重组表达载体导入大肠杆菌rare感受态细胞，筛选获得含第一重组表达载体的阳性菌株，再以该阳性菌株为宿主依次导入第二重组表达载体、第三重组表达载体与第四重组表达载体，每轮导入后均筛选阳性转化子；

9、s3.获得可以葡萄糖为碳源、乙硫醇为乙基供体从头合成乙基香兰素的重组大肠杆菌菌株。

10、进一步，在上述构建方法中，所述第一重组表达载体中，所述3-脱氢莽草酸脱氢酶编码基因为来源于苏云金芽孢杆菌（

bacillus thuringiensis）的

asbf基因，其核苷酸序列如seq id no:1所示。

11、进一步，在上述构建方法中，所述第二重组表达载体中，所述羧酸还原酶编码基因为来源于海洋分枝杆菌（

mycobacterium marinum）的

car基因，其核苷酸序列如seq id no:2所示；所述4′-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶编码基因为来源于枯草芽孢杆菌（

bacillus

subtilis）的

sfp基因，其核苷酸序列如seq id no:3所示。

12、进一步，在上述构建方法中，所述第三重组表达载体中，所述儿茶酚-

o-甲基转移酶编码基因为来源于沟鼠（

rattus norvegicus）的

comty200l基因，其核苷酸序列如seq idno:4所示；所述甲硫氨酸腺苷转移酶编码基因为来源于智人（

homo sapiens）的

mat2ai322v基因，其核苷酸序列如seq id no:5所示。

13、进一步，在上述构建方法中，所述第四重组表达载体中，所述

o-乙酰高丝氨酸巯化酶编码基因为来源于谷氨酸棒杆菌（

corynebacterium glutamicum）的

mety基因或来源于酿酒酵母（

saccharomyces cerevisiae）的

met17基因，所述

mety基因的核苷酸序列如seqid no:6所示，所述

met17基因的核苷酸序列如seq id no:7所示；

14、所述酰基高丝氨酸转移酶编码基因为来源于蜡样芽孢杆菌（

bacillus cereus）的

metxbc基因或来源于迈氏钩端螺旋体（

leptospira meyeri）的

metxlmmut基因，所述

metxbc基因的核苷酸序列如seq id no:8所示，所述

metxlmmut基因的核苷酸序列如seq id no:9所示。

15、进一步，在上述构建方法中，各编码基因均经大肠杆菌密码子优化。

16、进一步，在上述构建方法中，所述第一重组表达载体以ptac15k为基础载体，所述第二重组表达载体以pbbr1tac为基础载体，所述第三重组表达载体以ptrc99a为基础载体，所述第四重组表达载体以pcdftac为基础载体。

17、第二方面，本发明提供一种从头合成乙基香兰素的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌通过如上所述的构建方法构建而成。

18、进一步，所述重组大肠杆菌分别含有：携带

asbf基因的ptac15k衍生质粒、携带

car基因和

sfp基因的pbbr1tac衍生质粒、携带

comty200l基因和

mat2ai322v基因的ptrc99a衍生质粒、以及携带

o-乙酰高丝氨酸巯化酶编码基因（选自

mety或

met17）和酰基高丝氨酸转移酶编码基因（选自

metxbc或

metxlmmut）的pcdftac衍生质粒。

19、第三方面，本发明请求保护如上所述的重组大肠杆菌在发酵制备乙基香兰素中的应用。

20、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

21、本发明通过在大肠杆菌中引入异源合成基因并进行模块化组合，搭建了完整的乙基香兰素从头生物合成通路，实现了以廉价葡萄糖为唯一碳源、以乙硫醇为乙基供体的乙基香兰素从头合成。经摇瓶发酵验证，包含完整合成途径的重组大肠杆菌在添加终浓度为1mm乙硫醇的条件下，乙基香兰素产量可达7.3mg/l；在以l-乙硫氨酸为乙基供体的对照体系中，添加终浓度为5mm l-乙硫氨酸时乙基香兰素产量可达8.5mg/l，证明了所构建代谢通路的有效性。

22、在各功能模块层面，上游原儿茶醛合成模块表现出较高的催化效率，其中仅过表达3-脱氢莽草酸脱氢酶的重组菌株可积累709.0mg/l的原儿茶酸，进一步引入羧酸还原酶系后可将原儿茶酸完全转化为原儿茶醛，产量达310.7mg/l且无原儿茶酸残留，为下游乙基化反应提供了充足的前体底物。下游乙基转移系统模块同样得到验证，在以l-乙硫氨酸为乙基供体并外源添加原儿茶醛的条件下，重组菌株可将底物转化为22.8mg/l的乙基香兰素；在以乙硫醇为乙基供体的条件下，四种不同基因组合的重组菌株均能实现乙基香兰素的合成，产量范围为4.7mg/l至6.9mg/l，表明

o-乙酰高丝氨酸巯化酶与酰基高丝氨酸转移酶的组合能够有效将乙硫醇转化为胞内乙基供体。

23、此外，本发明以微生物发酵为核心替代传统化学合成工艺，生产过程无需消耗大量有机溶剂，可有效缓解传统工艺路线长、副产物分离成本高及环境污染严重等问题，具有原料成本低廉、反应条件温和、环境友好等特点，具备工业化大规模生产的潜力，同时也为后续构建更高产的乙基香兰素工程菌株提供了可行的技术基础与研究方向。