一种检测牛结节性皮肤病病毒的试剂盒及其应用

本发明涉及生物检测，具体涉及一种检测牛结节性皮肤病病毒的试剂盒及其应用。

背景技术：

1、牛结节性皮肤病（lumpy skin disease, lsd）是由牛结节性皮肤病病毒（lumpyskin disease virus, lsdv）引起的牛的一种高度传染性病毒性疾病，被世界动物卫生组织列为必须报告的传染病。近年来，lsd从非洲扩散至欧洲和亚洲多个国家，给畜牧业造成巨大经济损失。lsdv与同属山羊痘病毒属的山羊痘病毒（gtpv）、绵羊痘病毒（sppv）基因组同源性高达96%，且血清学交叉保护，临床上常用gtpv或sppv弱毒疫苗免疫牛预防lsd，因此检测方法需具备高特异性以区分疫苗株与野毒株。

2、目前lsdv的检测方法主要包括病毒分离、血清学试验和分子生物学检测。病毒分离耗时长，血清学方法无法区分病毒属，常规pcr和qpcr虽广泛应用于实验室，但需要大型仪器，不适用于现场快速检测。等温扩增技术如重组酶聚合酶扩增（rpa）和环介导等温扩增（lamp）虽可实现现场检测，但存在与gtpv、sppv的交叉反应，灵敏度也有待提高。因此，开发一种便携、超灵敏、高特异性且能区分lsdv与疫苗株（gtpv或sppv弱毒疫苗）的检测试剂盒具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种检测牛结节性皮肤病病毒的试剂盒及其应用，灵敏度高、特异性好、便于现场应用。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种检测牛结节性皮肤病病毒的试剂盒，包括crrna、cas12a蛋白、报告分子和引物对；所述crrna的核苷酸序列如seq id no：1所示；所述引物对包括f2和r2，f2的核苷酸序列如seq id no：2所示，r2的核苷酸序列如seq id no：3所示。

4、在本发明中，所述报告分子的核苷酸序列为5'-tttttttttttt-3'，5'端标记有羧基荧光素，3'端标记有bhq1。

5、在本发明中，所述报告分子的核苷酸序列为5'-nnnnnnnnnnnnn-3'，5'端标记有digoxin，3'端标记有biotin。

6、本发明还提供以非诊断为目的采用所述试剂盒检测牛结节性皮肤病病毒的方法，包括如下步骤：

7、（1）提取待测样品的dna；

8、（2）以提取的dna为模板，采用f2和r2为引物进行pcr或raa扩增，获得扩增产物；

9、（3）在微孔板中加入4 μl步骤（2）所得扩增产物、10 μl 10×nebuffer 2.1、1 μlcrrna、0.5 μl cas12a蛋白、1 μl报告分子、1 μl rnase抑制剂，加无核酸酶水至100 μl，在37℃孵育；以无核酸酶水为阴性对照；

10、（4）结果判定：当待测样品荧光信号强度大于等于阴性对照荧光信号强度的5倍，判为阳性；否则判为阴性。

11、本发明还提供以非诊断为目的采用所述试剂盒检测牛结节性皮肤病病毒的方法，包括如下步骤：

12、（1）提取待测样品的dna；

13、（2）以提取的dna为模板，采用f2和r2为引物进行pcr或raa扩增，获得扩增产物；

14、（3）将步骤（3）所得4 μl扩增产物与0.25 μl cas12a蛋白、0.5 μl crrna、0.5 μl报告分子在96孔微孔板中混合，在 37℃孵育90 min；

15、（4）结果判定。

16、在本发明中，步骤（3）反应结束后的反应液10 μl滴加到侧向流试纸条的样品垫上，室温层析，若检测线出现荧光条带且质控线出现荧光条带，判为阳性；若仅质控线出现荧光条带，判为阴性；若质控线无条带，判为无效。

17、在本发明中，取步骤（3）反应结束后的反应液在紫外灯照射下，有绿色荧光，则为阳性。

18、本发明的有益效果在于：

19、（1）首次将crispr-cas12a系统应用于lsdv检测，利用crrna特异性识别lsdvorf013区域，该区域在山羊痘病毒和绵羊痘病毒中存在多个缺失突变，因此能有效区分lsdv与gtpv、sppv疫苗株，避免交叉反应。

20、（2）结合预扩增技术（pcr或raa），检测灵敏度达到1拷贝/反应，远高于现有方法，适用于早期感染检测。

21、（3）提供三种信号读取方式（荧光读数、紫外目视、侧向流试纸条），可根据应用场景灵活选择，实现实验室高通量检测或现场快速筛查。

22、（4）整个检测过程可在5小时内完成，成本低（1.7-9.6美元/测试），具有良好的推广应用前景。

1.一种检测牛结节性皮肤病病毒的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括crrna、cas12a蛋白、报告分子和引物对；所述crrna的核苷酸序列如seq id no：1所示；所述引物对包括f2和r2，f2的核苷酸序列如seq id no：2所示，r2的核苷酸序列如seq id no：3所示。

2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述报告分子的核苷酸序列为5'-tttttttttttt-3'，5'端标记有羧基荧光素，3'端标记有bhq1。

3.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述报告分子的核苷酸序列为5'-nnnnnnnnnnnnn-3'，5'端标记有digoxin，3'端标记有biotin。

4.以非诊断为目的采用权利要求1所述试剂盒检测牛结节性皮肤病病毒的方法，其特征在于包括如下步骤：

5.以非诊断为目的采用权利要求1所述试剂盒检测牛结节性皮肤病病毒的方法，其特征在于包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于步骤（3）反应结束后的反应液10 μl滴加到侧向流试纸条的样品垫上，室温层析，若检测线出现荧光条带且质控线出现荧光条带，判为阳性；若仅质控线出现荧光条带，判为阴性；若质控线无条带，判为无效。

7.根据权利要求5所述方法，其特征在于取步骤（3）反应结束后的反应液在紫外灯照射下，有绿色荧光，则为阳性。