一种前列腺素还原酶突变体及其在α,β-不饱和酮化合物不对称还原中的应用

本发明属于生物催化与绿色化学，具体涉及一种前列腺素还原酶突变体、该突变体构建方法、纯化方法、全细胞共表达菌株，以及该突变体在α,β-不饱和酮化合物不对称还原中的应用。

背景技术：

1、手性是自然界的基本属性，药用活性分子的不同对映异构体在生物体内往往表现出截然不同的药理活性、代谢过程及毒副作用。α,β-不饱和酮类化合物作为一类具有高反应活性的有机化合物，其共轭体系使其具备强亲电性，是开发共价抑制剂的重要药效团。同时，该类骨架广泛存在于姜黄素等天然产物中，对其碳碳双键进行精准的饱和化修饰，能够显著提升分子的代谢稳定性并衍生出具有差异化活性的手性药物中间体。

2、因此，开发高效、高选择性的α,β-不饱和酮不对称还原技术，已成为合成化学与药物研发领域的核心课题。目前，实现该类化合物不对称还原的方法主要包括化学催化法和光酶协同催化法。传统的化学还原常依赖贵金属催化剂，环境友好性较差；而新兴的光酶协同催化虽能实现复杂的自由基偶联，但针对α,β-不饱和酮骨架中碳碳双键的直接、高效不对称加氢研究仍相对有限。相比之下，生物催化凭借其极高的底物特异性、温和的反应条件以及卓越的立体选择性，在复杂分子的后期结构修饰中展现出巨大潜力。

3、前列腺素还原酶2（prostaglandin reductase 2, ptgr2）属于中链脱氢酶/还原酶（mdr）家族，在生物体内参与多种活性分子的代谢。然而，天然ptgr2在面对非天然的工业烯酮底物，特别是具有大体积侧链时，普遍存在催化活性低、底物耐受性差以及立体选择性难以精准调控等瓶颈。此外，酶催化过程对辅助因子（如nadph）的依赖导致成本较高，限制了其在大规模制备中的应用。因此，通过蛋白质工程手段对ptgr2进行理性设计与改造，重塑其活性口袋以提升对非天然α,β-不饱和酮底物的催化效能与立体选择性，并结合高效的辅因子原位再生系统构建高效的全细胞催化体系，不仅能为手性药物中间体的绿色合成提供新方法，也为复杂分子的立体化学多样性构建提供了强有力的技术方案。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决天然还原酶在催化大位阻非天然烯酮底物时活性受限、立体化学控制力不足及辅酶循环成本高的问题，提供一种前列腺素还原酶突变体及基于该前列腺素还原酶突变体与葡萄糖脱氢酶（gdh）的酶级联催化体系及其应用。本发明通过定点突变技术获得活性口袋经过空间重塑的ptgr2突变体，与gdh构建具备高效辅助因子原位再生能力的催化平台，利用突变体对底物结合构象的精准调控，实现了α,β-不饱和酮的高效不对称还原，并实现了对产物构型的高度立体选择性控制。本发明所述的催化体系具有转化率高、立体选择性优异、辅酶再生效率高且生产成本低等优点，为手性医药中间体及天然产物衍生物的绿色合成提供了一种高效的生物催化方案。

2、

3、本发明是通过以下技术方案实现的：

4、一方面，本发明对目标蛋白进行系统性定点突变，包括：将第51位酪氨酸(y51)、第54位半胱氨酸(c54)、第62位苏氨酸(t62)、第64位酪氨酸(y64)、第65位亮氨酸(l65)、第259位酪氨酸(y259)、第265位酪氨酸(y265)、第289位缬氨酸(v289)及第135位甲硫氨酸(m135)分别突变为甲硫氨酸(m)、丙氨酸(a)、苯丙氨酸(f)、色氨酸(w)、缬氨酸(v)、精氨酸(r)、亮氨酸(l)和异亮氨酸(i)，由此构建一系列用于功能表征的突变体组合。

5、进一步地，所述定点突变，具体包括：将第64位酪氨酸分别突变为苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸（y64f、y64l、y64v、y64i）；将第135位甲硫氨酸分别突变为丙氨酸和苯丙氨酸（m135a、m135f）；将第259位酪氨酸突变为丙氨酸（y259a）；将第265位酪氨酸分别突变为色氨酸、亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸（y265w、y265l、y265v、y265i）；以及将第289位缬氨酸突变为丙氨酸（v289a）。

6、进一步地，所述定点突变是指组合突变，具体包括：将第51位酪氨酸与第265位酪氨酸同时突变为丙氨酸（y51a/y265a）；将第259位酪氨酸与第265位酪氨酸同时突变为丙氨酸（y259a/y265a）；将第51位酪氨酸突变为甲硫氨酸，同时将第265位酪氨酸突变为精氨酸（y51m/y265r）；将第51位、第259位及第265位酪氨酸同时突变为丙氨酸（y51a/y259a/y265a）；将第51位酪氨酸突变为苯丙氨酸，同时将第62位苏氨酸突变为苯丙氨酸（y51f/t62f）；在此基础上进一步将第265位酪氨酸突变为丙氨酸（y51f/t62f/y265a）；将第51位酪氨酸与第265位酪氨酸同时突变为苯丙氨酸和丙氨酸（y51f/y265a）；将第62位苏氨酸与第265位酪氨酸分别突变为苯丙氨酸和丙氨酸（t62f/y265a）；将第51位、第259位及第265位酪氨酸分别突变为苯丙氨酸、丙氨酸和丙氨酸（y51f/y259a/y265a）；将第51位酪氨酸突变为丙氨酸，同时将第62位苏氨酸突变为苯丙氨酸（y51a/t62f）；将第62位苏氨酸与第259位酪氨酸分别突变为苯丙氨酸和丙氨酸（t62f/y259a）；将第64位与第265位酪氨酸同时突变为苯丙氨酸（y64f/y265f）；将第62位苏氨酸、第259位酪氨酸及第265位酪氨酸分别突变为苯丙氨酸、丙氨酸和丙氨酸（t62f/y259a/y265a）；将第51位与第259位酪氨酸分别突变为苯丙氨酸和丙氨酸（y51f/y259a）；将第62位苏氨酸与第259位酪氨酸同时突变为苯丙氨酸（t62f/y259f）；将第51位与第265位酪氨酸同时突变为苯丙氨酸（y51f/y265f）；将第51位与第64位酪氨酸同时突变为苯丙氨酸（y51f/y64f）；将第64位酪氨酸突变为苯丙氨酸，同时将第265位酪氨酸突变为丙氨酸（y64f/y265a）；将第64位与第259位酪氨酸分别突变为苯丙氨酸（y64f/y259f）；将第62位苏氨酸与第64位酪氨酸同时突变为苯丙氨酸（t62f/y64f）；将第62位与第265位分别突变为苯丙氨酸（t62f/y265f）；将第51位酪氨酸、第62位苏氨酸及第64位酪氨酸同时突变为苯丙氨酸（y51f/t62f/y64f）；将第51位、第62位及第265位同时突变为苯丙氨酸（y51f/t62f/y265f）；将第51位、第64位及第265位酪氨酸同时突变为苯丙氨酸（y51f/y64f/y265f）；将第62位苏氨酸、第64位及第265位酪氨酸同时突变为苯丙氨酸（t62f/y64f/y265f）；将第62位苏氨酸及第64位酪氨酸突变为苯丙氨酸，第265位酪氨酸突变为丙氨酸（t62f/y64f/y265a）；将第51位酪氨酸突变为丙氨酸，第265位酪氨酸突变为苯丙氨酸（y51a/y265f）；将第51位、第64位酪氨酸突变为苯丙氨酸，第265位酪氨酸突变为丙氨酸（y51f/y64f/y265a）；将第51位酪氨酸突变为丙氨酸，第64位酪氨酸突变为苯丙氨酸（y51a/y64f）；将第259位与第265位酪氨酸同时突变为苯丙氨酸（y259f/y265f）；将第51位酪氨酸突变为苯丙氨酸，第62位苏氨酸突变为色氨酸，第64位酪氨酸突变为色氨酸，第265位酪氨酸突变为苯丙氨酸（y51f/t62w/y64w/y265f）；将第51位酪氨酸突变为苯丙氨酸，第54位半胱氨酸突变为色氨酸（y51f/c54w）；将第62位苏氨酸突变为色氨酸，第64位酪氨酸突变为苯丙氨酸（t62w/y64f）；以及将第51位酪氨酸突变为苯丙氨酸，第62位苏氨酸突变为色氨酸，第265位酪氨酸突变为苯丙氨酸（y51f/t62w/y265f）。

7、另一方面，本发明提供了一种前列腺素还原酶（ptgr2）突变体的设计与构建方法。

8、1.分子对接虚拟筛选：使用autodock vina软件，对ptgr2野生型蛋白晶体结构（pdb id: 2zb3）在辅因子nadph附近的活性口袋定义搜索框架，进行分子对接虚拟筛选。以计算所得的结合自由能（

δg_bind）作为对接构象的综合评价依据，设定

δg_bind<-6.5kcal·mol-1为有效结合的阈值，通过对符合条件的构象进行能量排序，筛选出能量最低的优势结合构象，锁定氨基酸残基位点。

9、2.突变体库构建：提取ptgr2原始模板质粒，设计带有目标突变位点的特异性引物，通过pcr反应进行全质粒扩增。扩增产物经dpni限制性内切酶消化处理以去除原始甲基化模板质粒，并通过琼脂糖凝胶电泳验证pcr产物条带。

10、3.质粒转化与验证：将消化后的产物通过热激发方法导入

e. coli dh5α感受态细胞中进行重组环化。提取质粒并进行序列测定，筛选测序正确的突变体质粒。

11、另一方面，本发明提供了上述ptgr2突变体的蛋白表达、纯化及酶反应验证方法。

12、进一步地，所述蛋白表达与验证通过以下步骤实施：

13、1.异源表达：将测序正确的突变体质粒通过热激发导入

e. coli bl21(de3)感受态细胞。在含相应抗性的培养基中培养，通过加入iptg低温诱导突变体蛋白表达。

14、2.蛋白纯化与鉴定：离心收集菌体并进行超声破碎，利用亲和层析技术纯化目标蛋白。纯化后的蛋白经超滤浓缩，并通过sds-page蛋白电泳确定目标蛋白的相对分子质量及纯度。

15、3.双酶联用反应：采用纯化后的ptgr2突变体蛋白与gdh蛋白联用构建酶级联还原体系。反应结束后，利用气质联用（gc-ms）测定产物的产率与高效液相色谱（hplc）对映体过量值（

ee），评估突变体的催化活性与立体选择性。

16、再一方面，本发明还提供所述前列腺素还原酶突变体及酶级联还原体系在催化α,β-不饱和酮进行不对称还原反应中的应用。

17、本发明的有益效果为：

18、本发明通过对前列腺素还原酶2（ptgr2）进行两轮定向进化与空间重塑，构建了针对α,β-不饱和酮的高效生物催化平台，具有以下显著的有益效果：

19、1.实现了催化性能与立体选择性的跨越式提升：本发明通过半理性设计锁定活性口袋核心残基，构建突变库。筛选获得的高性能突变体y51f/t62f/y265f解决了野生型酶在非天然底物上活性低、选择性差的痛点：以模型底物1a为例，产率从30%大幅提升至87%；立体选择性（

ee值）由6%（

s构型）提升至80%（

s构型），实现了催化效能的突破。

20、2.构建了高效低成本的辅因子再生循环系统：本发明采用了ptgr2与gdh双酶级联体系。利用廉价的葡萄糖驱动nadph再生，有效规避了昂贵辅酶的直接添加，大幅降低了催化反应成本。同时，通过优化筛选指标，实现了对底物1a产率与立体选择性的双重同步优化，提升了级联体系的整体协同效应。