一种乳腺癌尿液代谢物快速检测试纸条的制作方法

本发明属于体外诊断，尤其涉及一种基于适配体-胶体金技术的乳腺癌尿液代谢物快速检测试纸条。

背景技术：

1、乳腺癌是全球女性发病率最高的恶性肿瘤，早期诊断是提高治愈率、降低死亡率的关键。现有临床筛查手段如乳腺超声、钼靶、mri等存在诸多局限：超声依赖操作者经验，微小病灶漏诊率高；钼靶有辐射损伤，对致密型乳腺筛查效果不佳；mri价格昂贵，难以大规模普及。因此，开发无创、便捷、低成本的早期筛查技术具有重要临床需求。

2、代谢组学研究证实，乳腺癌患者尿液中8-羟基-2'-脱氧鸟苷（8-ohdg）、高香草酸等代谢标志物含量显著异常，可作为乳腺癌早期诊断的潜在靶点。而尿液样本具有无创、易获取、制备简单的优势，因此基于尿液标志物的检测技术成为研究热点。

3、现有尿液代谢物检测技术多依赖高效液相色谱、质谱等大型设备，操作复杂、检测周期长、成本高，无法满足现场快速检测需求。胶体金技术因具备可视化、快速、低成本的特点，已广泛应用于快速检测领域，但传统胶体金技术多采用抗体作为识别元件，针对小分子代谢物的抗体存在制备难度大、特异性差、稳定性不足等问题。适配体作为新型识别元件，具有特异性强、亲和力高、制备简便、稳定性好等优势，可有效弥补抗体的缺陷，但目前尚未有将适配体-胶体金技术应用于乳腺癌尿液多代谢标志物同步检测的成熟产品。

4、因此，开发一种基于适配体-胶体金技术，可同步检测乳腺癌尿液中多种核心代谢标志物，且操作简便、灵敏度高、特异性强的快速检测试纸条，对于填补现有技术空白、推动乳腺癌早期筛查普及具有重要意义。

技术实现思路

1、针对以上现有技术中的不足，本发明旨在提供一种乳腺癌尿液代谢物快速检测试纸条，以实现对尿液中8-ohdg、高香草酸的同步检测及肌酐内参校正，解决现有检测技术操作复杂、成本高、特异性差等问题，为乳腺癌早期筛查提供便捷、准确的检测工具。

2、为实现上述技术目的，本发明采用了以下技术方案：

3、本发明目的之一是提供一种适配体组合，所述适配体组合包括：

4、用于识别并结合8-羟基-2'-脱氧鸟苷的第一适配体对，其由序列如seq id no.1所示的检测适配体和序列如seq id no.2所示的捕获适配体组成；

5、用于识别并结合高香草酸的第二适配体对，其由序列如seq id no.3所示的检测适配体和序列如seq id no.4所示的捕获适配体组成；以及

6、用于识别并结合肌酐的第三适配体对，其由序列如seq id no.5所示的检测适配体和序列如seq id no.6所示的捕获适配体组成。

7、本发明目的之二是提供所述适配体组合在制备乳腺癌尿液代谢物快速检测产品中的应用。

8、本发明目的之三是提供一种采用所述适配体组合制备乳腺癌尿液代谢物快速检测试纸条的方法，包括以下步骤：

9、步骤一、制备胶体金颗粒：采用柠檬酸三钠还原法制备粒径为20-40 nm的胶体金颗粒；

10、步骤二、制备胶体金-适配体偶联物：将步骤一所得胶体金颗粒分别与所述8-羟基-2'-脱氧鸟苷的检测适配体、所述高香草酸的检测适配体、所述肌酐的检测适配体进行偶联，得到胶体金-适配体偶联物；

11、步骤三、预处理样品垫：将样品垫浸泡于预处理液中，烘干备用；所述预处理液为含0.5-1.0% tween-20、0.1-0.2 m nacl的ph 7.2-7.6 pbs缓冲液；

12、步骤四、制备结合垫：将步骤二所得胶体金-适配体偶联物喷涂于结合垫上，烘干；

13、步骤五、处理硝酸纤维素膜：在硝酸纤维素膜上依次设置检测线t1、检测线t2、检测线t3和质控线c，将所述8-羟基-2'-脱氧鸟苷的捕获适配体包被于检测线t1，将所述高香草酸的捕获适配体包被于检测线t2，将所述肌酐的捕获适配体包被于检测线t3；其中，所述检测线t1上的捕获适配体用于捕获由步骤二中8-羟基-2'-脱氧鸟苷检测适配体与靶标形成的复合物，所述检测线t2上的捕获适配体用于捕获由步骤二中高香草酸检测适配体与靶标形成的复合物，所述检测线t3上的捕获适配体用于捕获由步骤二中肌酐检测适配体与靶标形成的复合物；将抗适配体抗体包被于质控线c；

14、步骤六、组装：将步骤三所得样品垫、步骤四所得结合垫、步骤五所得硝酸纤维素膜以及吸水垫依次搭接固定在pvc底板上，即得。

15、进一步的，所述步骤二中胶体金-适配体偶联物的制备条件为：ph 7.0-7.5，适配体与胶体金的质量比为1：50-1：80，室温孵育20-30 min后用牛血清白蛋白封闭。

16、进一步的，所述步骤五中，检测线t1、t2、t3的捕获适配体包被浓度均为0.5-1.0mg/ml，所述质控线c的抗适配体抗体包被浓度为0.8-1.2 mg/ml；所述硝酸纤维素膜的孔径为80-120 μm，检测线与质控线之间的间距为0.5-0.8 cm。

17、本发明目的之四是提供一种乳腺癌尿液代谢物快速检测试纸条，所述乳腺癌尿液代谢物快速检测试纸条包括pvc底板，以及依次搭接固定在所述pvc底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；

18、所述结合垫吸附有胶体金-适配体偶联物，所述胶体金-适配体偶联物包含胶体金颗粒、以及与胶体金颗粒偶联的8-羟基-2'-脱氧鸟苷检测适配体、高香草酸检测适配体和肌酐检测适配体；

19、所述硝酸纤维素膜上依次设置有用于检测8-羟基-2'-脱氧鸟苷的检测线t1、用于检测高香草酸的检测线t2、用于检测肌酐的检测线t3以及质控线c；

20、所述检测线t1包被有8-羟基-2'-脱氧鸟苷捕获适配体，所述检测线t2包被有高香草酸捕获适配体，所述检测线t3包被有肌酐捕获适配体，所述质控线c包被有抗适配体抗体。

21、进一步的，所述8-羟基-2'-脱氧鸟苷的检测适配体序列如seq id no.1所示，捕获适配体序列如seq id no.2所示；所述高香草酸的检测适配体序列如seq id no.3所示，捕获适配体序列如seq id no.4所示；所述肌酐的检测适配体序列如seq id no.5所示，捕获适配体序列如seq id no.6所示。

22、进一步的，所述胶体金颗粒的粒径为20-40 nm；所述样品垫为经预处理液浸泡后烘干的玻璃纤维垫，所述预处理液为含0.5-1.0% tween-20、0.1-0.2 m nacl的ph 7.2-7.6pbs缓冲液。

23、进一步的，所述硝酸纤维素膜的孔径为80-120 μm，所述检测线t1、t2、t3与质控线c之间的间距为0.5-0.8 cm；所述检测线t1、t2、t3的捕获适配体包被浓度均为0.5-1.0 mg/ml，所述质控线c的抗适配体抗体包被浓度为0.8-1.2 mg/ml。

24、本发明目的之五是提供所述适配体组合、所述方法或所述试纸条在制备乳腺癌早期筛查产品中的应用。

25、本发明基于双适配体夹心-胶体金信号放大原理，具体过程如下：

26、1）将尿液样本滴加至样品垫，样本在毛细作用下依次迁移经过结合垫、nc膜；

27、2）样本到达结合垫时，溶解胶体金-适配体偶联物，若样本中存在8-ohdg、高香草酸或肌酐，其分别与对应的检测适配体特异性结合，形成“胶体金-检测适配体-靶标”复合物；

28、3）复合物迁移至nc膜时，分别被对应检测线上的捕获适配体特异性捕获，形成夹心结构，胶体金聚集呈现红色条带；未结合靶标的偶联物继续迁移至质控线，被抗适配体抗体捕获形成红色质控条带；

29、4）通过肌酐检测线的显色强度校正尿液浓度差异，结合8-ohdg和高香草酸检测线的显色情况实现乳腺癌相关代谢标志物的定性/半定量检测。

30、与现有技术相比，本发明具有以下的有益效果：

31、1）采用适配体作为识别元件，相比传统抗体，具有特异性强、亲和力高、制备成本低、稳定性好等优势，有效提高检测的准确性和重复性；

32、2）设计三检测线+一质控线的结构，可同步检测8-ohdg、高香草酸两种乳腺癌核心代谢标志物，并通过肌酐内参校正尿液浓度差异，显著提升检测结果的可靠性；

33、3）检测过程无需复杂设备和专业操作，5-10分钟即可完成检测，实现可视化判读，适合基层医疗机构、大规模人群筛查及家庭自我监测；

34、4）整体结构设计合理，原材料易得，制备工艺简单，成本低廉，易于规模化生产和推广应用。