一种来源于亚洲象粪便宏基因组的β-甘露聚糖酶及其制备方法和应用
本发明属于基因工程，具体涉及一种来源于亚洲象粪便宏基因组的β-甘露聚糖酶及其制备方法和应用。
背景技术：
1、β-甘露聚糖是植物半纤维素的重要组成成分，广泛存在于软木、植物果实、种子及魔芋、棕榈仁饼、豆粕等农林副产物中，其主链由β-1,4-甘露糖苷键连接而成，是自然界中储量丰富的可再生多糖资源。β-甘露聚糖酶（ec 3.2.1.78）为内切型水解酶，可以切割β-甘露聚糖主链的β-1,4-糖苷键，生成不同聚合度的甘露寡糖（mannooligosaccharides,mos），是实现甘露聚糖降解的核心功能酶。
2、甘露寡糖（mos）作为优质益生元，具有调节肠道微生态、促进有益菌增殖、抑制致病菌定殖、增强机体免疫与抗氧化等多种生理功能，在功能性食品、饲料添加剂、生物医药等领域应用前景广阔。当前，酶法制备mos因条件温和、绿色环保、产物纯度高、聚合度可控等优势，逐步替代传统酸解法、碱解法，成为工业化生产mos的主流技术路线。然而，现有β-甘露聚糖酶普遍存在催化效率偏低、温度与ph稳定性不足、底物谱窄、对魔芋葡甘聚糖、瓜尔豆胶、棕榈仁饼等常用底物水解效率不高等问题，难以满足规模化制备mos的产业需求，亟需挖掘新型高性能β-甘露聚糖酶资源。
3、传统功能酶筛选依赖微生物纯培养技术，而自然界中超过99%的微生物为不可培养微生物，导致大量新型酶基因无法被发掘，筛选周期长、成功率低、基因资源覆盖范围有限，制约着β-甘露聚糖酶的创新与应用拓展。随着高通量测序技术的快速发展，宏基因组学技术无需分离培养微生物，可直接从环境样品中获取全部微生物基因组信息，高效挖掘未培养微生物的功能基因，显著提升功能酶基因筛选的广泛性和有效性，为发掘新型β-甘露聚糖酶基因提供了新的研究策略与技术路径。
4、亚洲象为大型植食性动物，长期取食高纤维植物，其消化道内富集大量能够降解木质纤维素的共生微生物，形成独特的微生物群落与丰富的碳水化合物活性酶（cazymes）系统，是挖掘新型半纤维素降解酶的天然资源库。亚洲象粪便宏基因组中蕴含大量未被开发的糖苷水解酶基因，目前基于亚洲象粪便宏基因组挖掘新型β-甘露聚糖酶的研究尚未见报道，相关酶基因资源、编码基因及应用技术有待探究。
5、综上，挖掘来源于亚洲象粪便宏基因组的新型β-甘露聚糖酶，突破传统纯培养技术局限，获得良好活性的β-甘露聚糖酶基因资源，对推动寡糖生产、农林副产物高值化利用及酶制剂产业升级具有重要应用价值。
6、需要说明的是，在上述背景技术部分公开的信息仅用于加强对本公开的背景的理解，因此可以包括不构成对本领域普通技术人员已知的现有技术的信息。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种来源于亚洲象粪便宏基因组的β-甘露聚糖酶及其制备方法和应用，解决了现有β-甘露聚糖酶催化效率偏低、温度与ph稳定性不足的问题，本发明的β-甘露聚糖酶具有高催化活性、良好ph适应性与热稳定性，可高效降解多种来源的β-甘露聚糖，用于制备甘露寡糖，具备良好的产业应用潜力。
2、为了达到上述目的，本发明提供了一种来源于亚洲象粪便宏基因组的β-甘露聚糖酶，该β-甘露聚糖酶的氨基酸序列如seq id no.4所示。
3、本发明的第二目的是提供所述的β-甘露聚糖酶的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
4、本发明的第三目的是提供包含所述编码基因的重组质粒。
5、优选地，所述重组质粒选自原核质粒。
6、更优选地，所述原核质粒选自pbe-s质粒。
7、本发明的第四目的是提供包含所述编码基因的重组菌。
8、优选地，所述重组菌选自枯草芽孢杆菌。
9、本发明的第五目的是提供所述的β-甘露聚糖酶，或所述的编码基因，或所述的重组质粒，或所述的重组菌在甘露寡糖合成中的应用。
10、优选地，所述应用中，β-甘露聚糖酶的底物选自瓜尔豆胶、角豆胶和魔芋胶中至少一种。
11、优选地，所述应用中，酶解的ph为4~8。更优选地，酶解的ph为4~7。
12、优选地，所述应用中，酶解的温度为40~65℃。更优选地，酶解的温度为50~60℃。
13、本发明的第六目的是提供所述的β-甘露聚糖酶的制备方法，该方法包含：
14、将所述的重组菌进行发酵培养，离心后收集上清，获得所述β-甘露聚糖酶的粗酶液；
15、将所述粗酶液经镍亲和层析柱纯化获得含目标蛋白的洗脱组分，再经透析脱盐与渗透浓缩处理，获得精制酶液，向透析浓缩完成的精制酶液中加入无菌脱脂奶粉，以脱脂奶粉作为酶蛋白的冻干保护剂与载体，经冷冻干燥，制得β-甘露聚糖酶纯酶酶粉。
16、优选地，所述无菌脱脂奶粉在体系中的终浓度为10%。
17、本发明的来源于亚洲象粪便宏基因组的β-甘露聚糖酶及其制备方法和应用，解决了现有β-甘露聚糖酶催化效率偏低、温度与ph稳定性不足的问题，具有以下优点：
18、（1）本发明从亚洲象粪便宏基因组中筛选得到新型β-甘露聚糖酶的编码基因，将其构建到重组质粒并转化宿主菌获得重组表达工程菌，经诱导表达、分离纯化得到β-甘露聚糖酶，实现了该酶的异源活性表达。本发明的β-甘露聚糖酶具有催化效率高、ph适应范围广、热稳定性好、底物谱宽泛的优势，对瓜尔豆胶、魔芋胶、角豆胶等多种常见底物都有良好的水解活性，可用于绿色高效合成甘露寡糖，能满足工业化生产的需求，为甘露寡糖的制备提供了优质的酶资源，也为农林副生物质的高值化利用提供了新的技术支撑；
19、（2）本发明的β-甘露聚糖酶acuman1487，在50~65℃下，ph为4.0~10.0范围内具有良好稳定性，其ph稳定性和温度稳定性更好，具有良好的胃-胰蛋白酶耐受性，最佳反应底物为魔芋胶。
1.一种来源于亚洲象粪便宏基因组的β-甘露聚糖酶，其特征在于，该β-甘露聚糖酶的氨基酸序列如seq id no.4所示。
2.如权利要求1所述的β-甘露聚糖酶的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
3.重组质粒，其特征在于，包含如权利要求2所述的编码基因。
4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒选自原核质粒。
5.根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述原核质粒选自pbe-s质粒。
6.重组菌，其特征在于，包含如权利要求2所述的编码基因。
7.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌选自枯草芽孢杆菌。
8.如权利要求1所述的β-甘露聚糖酶，或如权利要求2所述的编码基因，或如权利要求3~5中任意一项所述的重组质粒，或如权利要求6或7所述的重组菌在甘露寡糖合成中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用中，β-甘露聚糖酶的底物选自瓜尔豆胶、角豆胶和魔芋胶中至少一种；
10.如权利要求1所述的β-甘露聚糖酶的制备方法，其特征在于，该方法包含：