AK6在制备尿毒症性心肌病治疗药物中的应用的制作方法

本发明属于生物医药，具体涉及一种用于治疗尿毒症性心肌病的基因治疗药物，尤其涉及ak6基因、ak6蛋白或ak6过表达构建体在制备尿毒症性心肌病治疗药物中的应用。

背景技术：

1、慢性肾脏病（chronic kidney disease, ckd）是全球范围内的重大公共卫生问题，其患病率持续上升，已成为导致心血管疾病发病和死亡的重要危险因素。流行病学研究显示，ckd患者的心血管死亡风险较普通人群显著升高，且心血管并发症是ckd患者最主要的死亡原因之一。作为心肾相互作用的重要表现，ckd继发的心脏结构和功能损害通常表现为左心室肥厚、心肌纤维化、心肌能量代谢障碍、线粒体功能异常及进行性心功能下降，临床将该表型定义为尿毒症性心肌病（uremic cardiomyopathy）。尿毒症性心肌病的发生发展机制极为复杂，涉及尿毒症毒素蓄积、持续炎症状态、氧化应激升高、线粒体结构和功能受损以及心肌细胞代谢重编程等多重因素的相互作用，最终导致心肌细胞损伤、心脏重构和心力衰竭。

2、目前，针对尿毒症性心肌病的临床治疗策略主要包括控制血压、纠正贫血、改善容量负荷、调节矿物质代谢紊乱以及肾脏替代治疗（血液透析、腹膜透析或肾移植）等支持性措施。上述方法均属于间接干预手段，主要着眼于缓解尿毒症状态下的全身性病理生理紊乱，而非直接针对心肌细胞的损伤机制进行干预。现有治疗方案虽然能够在一定程度上延缓疾病进展，但难以有效逆转已经发生的心肌损伤和心脏重构。更为关键的是，目前尚缺乏能够直接保护心肌细胞、改善线粒体功能并减轻心脏重构的靶向干预手段。因此，寻找尿毒症性心肌病的关键致病分子靶点，并开发能够精准递送至心肌组织的干预策略，具有重要的科学意义和临床转化价值。

3、近年来，基因治疗在心血管疾病领域取得了显著进展。腺相关病毒（adeno-associated virus, aav）因其具有良好的安全性、低免疫原性以及能够在非分裂细胞中实现长期基因表达等优势，已成为心血管疾病基因治疗中最具应用前景的递送载体。其中，aav9血清型可通过静脉注射实现高效的全身性递送，并能够优先转导心肌组织。为降低肝脏等非靶器官的脱靶表达风险，通常采用心肌特异性启动子（如心肌肌钙蛋白t启动子，ctnt）驱动治疗基因在心肌细胞中选择性表达。基于上述技术策略，已有研究者开发了针对不同心脏疾病类型的aav9介导基因治疗方案。例如，有研究采用aav9-ctnt-aralar通过改善线粒体功能治疗心力衰竭，有研究采用aav9-ctnt-acly通过调控蛋白乙酰化治疗心肌病，也有研究采用aav9-ctnt-ogn通过调节线粒体动力学预防心肌缺血再灌注损伤。上述方案均采用aav9-ctnt载体系统，但靶点基因均为已知与心脏功能或线粒体代谢相关的分子。

4、ak6（adenylate kinase 6，又称hcinap）是一种非典型腺苷酸激酶家族成员，在结构上与典型的腺苷酸激酶存在差异。现有研究表明，ak6主要参与细胞能量和核苷酸代谢调控，涉及atp与amp之间的磷酸转移反应。目前对ak6功能的认识主要集中在肿瘤细胞的增殖调控、早期胚胎发育以及炎症信号通路调节等方面，已有研究报道ak6在肺癌、结直肠癌等多种肿瘤中异常表达，并参与肿瘤细胞的能量代谢重编程。然而，迄今为止，尚未有任何研究报道ak6与心脏疾病（特别是尿毒症性心肌病）之间的关联，也未有任何研究提示ak6可作为心肌保护的干预靶点。 关于ak6在心肌细胞线粒体功能调控中的作用，以及其过表达是否能够改善尿毒症应激下的心肌损伤，现有技术中完全缺乏相关记载。

5、综上所述，现有技术主要存在以下缺陷：第一，尿毒症性心肌病的治疗缺乏能够直接靶向心肌细胞线粒体损伤和代谢紊乱的有效干预手段，现有治疗方案均为间接支持性措施，难以逆转或阻止心肌损伤的进展；第二，虽然aav9-ctnt载体系统在心脏基因治疗领域已有应用，但其所靶向的分子均为已知的心脏功能相关基因；第三，ak6作为尿毒症性心肌病治疗靶点的价值，以及通过aav9介导ak6心肌过表达治疗尿毒症性心肌病的可行性，在现有技术中完全未被提及或启示。

技术实现思路

1、针对尿毒症性心肌病的治疗缺乏有效精准干预靶点、现有治疗手段均为间接支持性措施而难以直接保护心肌细胞线粒体功能的缺陷，本发明提供了ak6基因、ak6蛋白或ak6过表达构建体在制备尿毒症性心肌病治疗药物中的应用。本发明通过腺相关病毒9（aav9）介导的ak6心肌特异性过表达系统，首次证实ak6作为尿毒症性心肌病精准靶点的核心价值。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了ak6基因、ak6蛋白或ak6过表达构建体在制备尿毒症性心肌病治疗药物中的应用。

4、进一步地，所述ak6基因的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述ak6蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。

5、进一步地，所述ak6过表达构建体为重组腺相关病毒载体。腺相关病毒具有安全性好、免疫原性低、可在心肌细胞中长期稳定表达等优势，适合作为基因递送载体。

6、进一步地，所述重组腺相关病毒载体的血清型为aav9。aav9血清型经静脉注射后可高效转导心肌组织，具有良好的心脏靶向递送特性。

7、进一步地，所述重组腺相关病毒载体包含心肌特异性启动子。采用心肌特异性启动子可驱动ak6基因仅在心肌细胞中表达，避免肝脏等非靶器官的脱靶表达风险。

8、进一步地，所述心肌特异性启动子为心肌肌钙蛋白t启动子。该启动子在心肌细胞中具有高度特异性的转录激活活性。

9、进一步地，所述ak6过表达载体为aav9-ctnt-ak6表达载体，包含编码ak6的核苷酸序列（seq id no:1）和心肌肌钙蛋白t启动子。

10、进一步地，所述尿毒症性心肌病治疗药物具有如下至少一种用途：（1）改善尿毒症性心肌病心功能；（2）减轻左心室壁增厚，抑制心肌细胞肥大及心肌纤维化；（3）减轻线粒体超微结构损伤，恢复氧化磷酸化相关蛋白表达，提高线粒体呼吸功能并降低线粒体活性氧水平。

11、具体地，所述改善尿毒症性心肌病心功能包括提高射血分数和短轴缩短率。所述恢复氧化磷酸化相关蛋白表达包括恢复atp5a1、uqcrc2、sdhb、mtco2和ndufb8中至少一种蛋白的表达水平。所述提高线粒体呼吸功能包括提高基础耗氧率和/或最大耗氧率。

12、上述效果已在5/6肾切除小鼠模型中得到验证：aav9-ctnt-ak6尾静脉注射后，小鼠射血分数和短轴缩短率显著升高，左心室壁厚度降低；心肌纤维化、心肌细胞肥大及组织结构损伤明显减轻；同时，线粒体肿胀、嵴紊乱等超微结构损伤显著改善，atp5a1、uqcrc2、sdhb、mtco2及ndufb8等氧化磷酸化相关蛋白表达恢复，线粒体耗氧率提高，活性氧水平降低。

13、进一步地，所述尿毒症性心肌病是由慢性肾脏病继发的心肌损伤，涉及尿毒症毒素蓄积引起的线粒体结构和功能障碍。

14、第二方面，本发明还提供了一种用于治疗尿毒症性心肌病的药物组合物，包含上述ak6基因、ak6蛋白或ak6过表达构建体，以及药学上可接受的载体、稀释剂、缓冲体系或稳定剂中的至少一种。

15、进一步地，所述ak6过表达构建体为重组腺相关病毒载体aav9-ak6，包含编码ak6的核苷酸序列和心肌特异性启动子，所述编码ak6的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述心肌特异性启动子为心肌肌钙蛋白t启动子。

16、进一步地，所述药物组合物的剂型为注射剂，给药途径为静脉注射。静脉注射可实现aav9载体向心脏的高效递送。

17、与现有技术相比，本发明具有如下突出的有益效果：

18、（1）首次证实ak6可作为尿毒症性心肌病的精准治疗靶点。现有技术中ak6仅涉及肿瘤、早期胚胎发育和炎症反应等领域，其在心脏疾病中的功能研究尚属空白。本发明首次发现ak6在尿毒症心肌中显著下调，并通过aav9介导的心肌过表达实现了对尿毒症性心肌病的靶向保护。

19、（2）本发明提供了“表达下调-过表达保护-敲除加重”的完整正反向遗传学证据链。不仅在5/6肾切除小鼠模型中证实了ak6过表达可改善心功能、减轻病理损伤和线粒体功能障碍，还通过心肌细胞特异性ak6敲除小鼠模型进一步验证了ak6缺失会加重尿毒症性心肌病表型，为ak6作为治疗靶点提供了坚实的遗传学依据。

20、（3）本发明首次揭示ak6过表达通过三维协同机制发挥心肌保护作用——同时恢复氧化磷酸化相关蛋白（atp5a1、uqcrc2、sdhb、mtco2、ndufb8）表达、提高线粒体呼吸功能和降低线粒体活性氧水平。该机制组合未被现有技术公开或启示。

21、（4）本发明采用aav9-ctnt载体系统实现ak6基因的心肌特异性递送和表达，既保证了治疗基因在靶器官心肌中的有效富集，又降低了非靶器官的脱靶风险，具有良好的安全性和临床转化潜力。

22、（5）本发明填补了尿毒症性心肌病基因治疗领域的空白。现有针对尿毒症性心肌病的治疗方案均为控制血压、纠正贫血、肾脏替代治疗等间接支持性措施，缺乏直接靶向心肌细胞线粒体损伤的干预手段。本发明为尿毒症性心肌病的治疗提供了以ak6为精准靶点的全新基因治疗策略。

23、综上所述，本发明提供了一种以ak6基因、ak6蛋白或ak6过表达构建体为核心的尿毒症性心肌病靶向治疗方案，具有明确的靶点基础、完整的实验证据支持和良好的临床转化前景。