一种修复绵羊小肠上皮细胞炎性损伤的柠条缩合单宁制剂及其有效浓度筛选方法

本发明属于反刍动物肠道健康与饲料生物，具体涉及一种修复绵羊小肠上皮细胞炎性损伤的柠条缩合单宁制剂及其有效浓度筛选方法。

背景技术：

1、绵羊规模化养殖过程中，应激刺激、高精料饲喂、致病菌感染等多种因素极易引发肠道炎症损伤，是导致绵羊生长性能下降、免疫力降低、养殖经济效益受损的核心问题。肠道上皮细胞作为绵羊肠道屏障的核心组成部分，承担着营养吸收、免疫防御、阻隔肠道内毒素入侵机体的关键功能。脂多糖（lps）作为革兰阴性菌细胞壁的核心毒性成分，是诱导反刍动物肠道上皮细胞氧化应激、炎症浸润、屏障结构破损的典型诱因，可激活tlr4/nf-κb炎症信号通路，引发炎症因子大量释放，破坏肠道紧密连接结构，造成肠道通透性升高，进而诱发全身性炎症反应，严重制约规模化养羊产业高质量发展。

2、目前行业内针对绵羊肠道炎症的防控手段仍存在明显短板，传统防控多依赖抗生素、化学抗炎药物，长期使用易造成动物机体耐药性残留、肠道菌群紊乱、畜产品安全不达标等问题，不符合绿色畜牧养殖发展要求。现有绿色替代方案中，各类植物提取物成为饲料添加剂研发热点，其中缩合单宁作为天然多酚类活性物质，具备抗炎、抗氧化、抑菌、修复肠道屏障的多重生物活性，在畜禽肠道健康调控中展现出良好应用潜力。

3、柠条作为我国西北荒漠地区广泛种植的灌木植物，资源储量大、可再生性强、种植成本低廉，其植株茎叶中富含高活性缩合单宁，是极具开发潜力的天然绿色饲料添加剂原料。现有研究仅停留在柠条单宁粗提物的基础功效验证层面，仅证实其可改善羔羊机体抗氧化能力、缓解外源应激导致的肝脏炎性损伤、提升肠道基础屏障功能，且现有试验载体多为小鼠异源细胞模型或活体羔羊整体表观试验，未聚焦绵羊小肠上皮细胞特异性损伤机制，存在明显技术空白与缺陷。一方面，现有技术未公开、未证实柠条缩合单宁对lps诱导的绵羊小肠上皮细胞特异性炎性、氧化性复合损伤的靶向修复作用，未明确其适配绵羊肠道细胞的抗炎、抗氧化、屏障修复的精准作用通路，核心技术机制模糊；另一方面，行业内无专属、标准化的柠条缩合单宁作用浓度筛选体系，现有饲料添加量均基于活体饲喂经验摸索，无体外细胞水平量化数据支撑，普遍存在浓度适配性差、低浓度无效、有效浓度区间模糊、高浓度细胞毒性突出、修复效果不稳定的技术痛点，无法实现精准应用。

4、同时，传统针对植物单宁饲料添加浓度的筛选手段均采用绵羊活体梯度饲喂试验，存在试验周期长、动物个体差异大、饲养环境干扰因素多、试验成本高昂、生化指标检测误差大、数据重复性与稳定性差的固有缺陷，无法快速、精准量化适配绵羊小肠上皮细胞损伤修复的最优有效浓度，导致柠条缩合单宁在绵羊肠道炎症精准防控、专用绿色饲料添加剂领域的产业化应用长期受阻。综上，目前行业内缺乏靶向lps诱导绵羊小肠上皮细胞损伤的柠条缩合单宁有效浓度的标准化筛选方法，且无基于绵羊同源永生化细胞模型的精准浓度筛选技术，是本领域亟待解决的核心技术难题。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的柠条缩合单宁无lps诱导绵羊小肠细胞损伤靶向修复的专属用途、作用机制未明确、无同源细胞精准筛选体系、浓度参数无量化标准、传统筛选方法精度低、产业化适配性差等核心技术痛点与空白，本发明提供一种修复绵羊小肠上皮细胞炎性损伤的柠条缩合单宁制剂及其有效浓度筛选方法，构建基于绵羊同源永生化小肠上皮细胞模型的标准化、可重复、量化的有效浓度筛选方法，精准限定最优作用浓度区间，兼顾损伤修复效率与细胞生物安全性。

2、为实现上述发明目的，本发明提供一种修复绵羊小肠上皮细胞炎性损伤的柠条缩合单宁制剂，活性成分为纯度≥95%的柠条缩合单宁；所述柠条缩合单宁由柠条茎叶经70%丙酮浸提、d101大孔树脂梯度洗脱纯化制得；所述制剂作用于永生化绵羊小肠上皮细胞的安全有效浓度为40 μg/ml；饲喂杜蒙羔羊日粮添加比例0.1%。

3、进一步地，所述制剂为粉剂，辅料为玉米淀粉/麸皮载体，单宁有效成分质量分数5%~10%。

4、进一步地，所述柠条缩合单宁纯化工艺为料液比1:15、50℃浸提2h，d101树脂水洗除杂后70%丙酮洗脱。

5、以自主构建的永生化绵羊小肠上皮细胞为筛选模型，lps构建炎性损伤模型，设置梯度制剂干预，通过细胞活性、炎症因子、抗氧化、紧密连接基因四维指标定量评价制剂修复效果，快速筛选无细胞毒性、修复效果最优的制剂使用浓度，可用于制剂新品研发、批量产品出厂质控，大幅替代活体动物试验。

6、本发明还提供一种修复绵羊小肠上皮细胞炎性损伤的柠条缩合单宁制剂及其有效浓度筛选方法，包括以下步骤：

7、（1）将永生化绵羊小肠上皮细胞以1×105个/ml的密度接种于培养板，培养12h至完全贴壁；

8、（2）除空白对照组外，加入终浓度1μg/ml的大肠杆菌lps干预24h，构建炎性-氧化复合损伤模型；

9、（3）弃去lps培养基，加入含梯度浓度柠条缩合单宁的完全培养基干预24h，所述梯度浓度分别为5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml；

10、（4）采用cck-8法检测细胞活性，elisa法检测炎症因子tnf-α、il-6及抗氧化指标sod、gsh-px、mda，qpcr法检测紧密连接基因occludin、zo-1的表达；

11、（5）综合步骤（4）的检测结果，筛选出显著提升细胞存活率、降低炎症因子、改善抗氧化能力、上调紧密连接基因表达且无细胞毒性的浓度，确定为最优体外有效安全浓度。

12、进一步地，步骤（2）中所述lps为大肠杆菌o55:b5来源的脂多糖。

13、进一步地，步骤（4）中所述炎症因子tnf-α、il-6采用双抗体夹心elisa法定量检测；所述抗氧化指标sod活性、gsh-px活性及mda含量采用elisa试剂盒检测；所述紧密连接基因occludin、zo-1的相对表达量采用实时荧光定量qpcr法检测。

14、进一步地，步骤（5）中所述最优体外有效安全浓度为40μg/ml。

15、进一步地，所述永生化绵羊小肠上皮细胞通过以下步骤构建：

16、选取健康新生羔羊空肠组织，剥离浆膜层及肌肉层，用pbs冲洗后剪成1mm3碎块，经0.25%胰蛋白酶-edta消化20-30min，过滤、离心获得原代细胞；

17、采用慢病毒转染法导入人端粒酶逆转录酶htert基因，转染后经400μg/ml g418筛选10-14d，挑取单克隆扩增培养，连续传代30代以上，获得永生化绵羊小肠上皮细胞系。

18、进一步地，所述柠条缩合单宁的提取纯化工艺包括：采用体积分数70%丙酮水溶液，按料液比1∶15（g∶ml），在50℃下浸提2h，离心收集粗提液；采用d101大孔吸附树脂，以2.0ml/min上样，3.0ml/min超纯水洗脱除杂，再用70%丙酮水溶液以1.5ml/min梯度洗脱，收集洗脱液经减压浓缩、真空干燥，得到纯度≥95%的柠条缩合单宁。

19、进一步地，步骤（4）中所述cck-8法检测细胞活性的具体操作为：每孔加入10μlcck-8试剂，避光孵育2h，检测450nm波长吸光度值，计算细胞存活率。

20、所述柠条缩合单宁为从柠条茎叶中经丙酮浸提、大孔树脂纯化得到的天然多酚类物质，其纯度不低于95%。

21、所述方法为非治疗目的的体外制剂功效与使用浓度筛选评价方法。

22、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

23、（1）本发明制剂单宁纯度稳定≥95%，去除刺激性杂质，相比粗提物细胞毒性更低、肠道修复效率更高；粉剂剂型流动性好，适配饲料厂混合加工，储存运输便捷；明确细胞、活体两级标准化添加剂量，解决行业无量化添加标准的痛点。

24、（2）采用绵羊同源永生化小肠上皮细胞模型，试验特异性强；四维指标联合评价，结果精准；标准化操作流程，试验重复性≥95%；相比活体饲喂筛选，周期缩短 60% 以上，试验成本降低 70%。

25、（3）实现 “原料纯化→制剂制备→体外功效筛选质控→活体养殖应用” 完整产业链技术闭环，既保护终端饲料添加剂产品，又保护配套体外评价筛选工艺，专利保护范围全面，产业化落地价值高。