一种靶向性纳米微粒在糖尿病足中的应用的制作方法

本发明属于生物医药，具体涉及一种靶向性纳米微粒在糖尿病足中的应用。

背景技术：

1、糖尿病足溃疡是糖尿病的严重并发症之一，是导致糖尿病患者致残、致死的主要原因。糖尿病患者因长期高血糖，常伴有周围神经病变和下肢血管病变。周围神经病变导致足部感觉减退或丧失、足底压力分布异常，轻微外伤、鞋袜摩擦或压力即可引发溃疡；下肢血管病变导致血流量减少、组织缺氧和营养成分供给不足，创面愈合能力严重受损。糖尿病足溃疡具有迁延不愈、易复发、致残率高、治疗周期长、医疗负担重等特点，是临床治疗的难点。

2、糖尿病足溃疡的愈合障碍涉及复杂的病理机制，与正常创面愈合过程存在显著差异。正常创面愈合是一个高度协调的过程，包括止血期、炎症期、增殖期和重塑期，但在糖尿病状态下，上述各阶段均出现异常。长期高血糖可促进晚期糖基化终末产物的形成，该产物在组织中蓄积后可通过与其受体结合，激活多条损伤性信号通路，增加氧化应激水平，导致细胞膜、蛋白质和dna受损。高血糖还可损害巨噬细胞从促炎表型向修复表型的极化，使创面长期处于慢性炎症状态，难以从炎症期过渡到增殖期。同时，糖尿病创面中基质金属蛋白酶活性升高，导致细胞外基质过度降解，新生组织无法稳定沉积。此外，高糖环境直接导致成纤维细胞和角质形成细胞的增殖与迁移能力下降，血管内皮功能障碍导致血管新生受损，创面长期处于缺血缺氧状态。上述多种病理因素相互关联、互为因果，形成恶性循环，导致创面愈合延迟甚至完全不愈合。

3、目前临床治疗糖尿病足溃疡的主要方法包括严格控制血糖、彻底清创、抗感染治疗、改善下肢血液循环、应用各种创面敷料以及生长因子治疗等。然而，现有治疗方法效果有限，难以满足临床需求。外源性生长因子在糖尿病高糖环境下半衰期短、易失活，难以持续发挥促愈合作用，且存在费用高昂、疗效不稳定等问题。创面敷料虽可提供适宜的愈合环境，但缺乏主动促进组织再生的能力。对于伴有严重下肢血管病变的患者，血运重建手术风险高、适应症有限。因此，开发新型、安全、有效的治疗策略对于改善糖尿病足溃疡的治疗效果具有重要意义。

4、近年来，外泌体作为一种新型无细胞治疗策略受到广泛关注。外泌体是由细胞分泌的纳米级囊泡，携带蛋白质、脂质、核酸等多种生物活性分子，介导细胞间通讯。外泌体具有低免疫原性、高生物相容性和良好的组织渗透性，可穿越生物屏障，是药物递送的理想载体，其本身也具有一定的组织修复功能。然而，现有外泌体治疗技术主要采用外源性负载方式将治疗分子装入外泌体，该方法存在负载效率低、外泌体膜完整性受损、潜在免疫原性、批次间稳定性差等缺陷。此外，现有外泌体疗法通常仅针对单一靶点，难以同时解决糖尿病足的多重病理问题，治疗效果有限。

5、因此，本领域亟需开发一种能够高效富集治疗性蛋白、保留其天然活性、同时具有多靶点调控能力的治疗策略，以满足糖尿病足溃疡临床治疗的迫切需求。

技术实现思路

1、针对上述不足，本发明提供了一种靶向性纳米微粒在糖尿病足中的应用。该靶向性纳米微粒为基因工程化外泌体，其表面高度富集重组xvii型全长人胶原蛋白。本发明采用内源性装载策略，通过分选信号肽引导目标蛋白自发富集于外泌体膜上，避免了外源性负载的缺陷。该靶向性纳米微粒能够多靶点调控创面修复过程，可有效用于糖尿病足溃疡的治疗。

2、本发明的技术方案为：

3、一方面，本发明提供了一种靶向性纳米微粒在制备用于治疗糖尿病足的药物中的应用，所述靶向性纳米微粒包括重组xvii型全长人胶原蛋白；

4、所述重组xvii型全长人胶原蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

5、具体地，所述重组xvii型全长人胶原蛋白通过分选信号肽引导富集于所述靶向性纳米微粒的表面。

6、优选地，所述分选信号肽包含seq id no.2所示的氨基酸序列。

7、具体地，所述靶向性纳米微粒可以选自外泌体或微囊泡。

8、具体地，所述靶向性纳米微粒来源于经工程化改造的宿主细胞，所述宿主细胞表达所述重组xvii型全长人胶原蛋白。

9、进一步具体地，所述宿主细胞可以是真核细胞。

10、优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。

11、进一步优选地，所述宿主细胞为293t细胞。

12、具体地，所述靶向性纳米微粒通过以下方式制备获得：

13、（1）构建表达载体，所述表达载体包含编码seq id no.1所示氨基酸序列的核苷酸序列及分选信号肽编码序列；

14、（2）将所述表达载体转染至宿主细胞；

15、（3）培养所述宿主细胞，并分离纯化所述靶向性纳米微粒。

16、具体地，所述药物的剂型选自凝胶、喷雾、软膏、敷料、冻干粉针或注射剂。

17、具体地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

18、进一步具体地，所述药学上可接受的辅料选自赋形剂、缓冲剂、稳定剂、防腐剂、抗氧化剂、增稠剂、乳化剂或溶剂。

19、优选地，所述赋形剂选自甘露醇、海藻糖、蔗糖、乳糖或葡萄糖；

20、所述缓冲剂选自磷酸盐缓冲液、枸橼酸盐缓冲液或tris缓冲液；

21、所述稳定剂选自人血清白蛋白、明胶或聚乙二醇；

22、所述防腐剂选自苯甲醇、苯扎氯铵或硫柳汞；

23、所述抗氧化剂选自维生素e、维生素c或亚硫酸氢钠；

24、所述增稠剂选自羧甲基纤维素钠、羟丙甲纤维素或卡波姆。

25、又一方面，本发明提供了一种治疗糖尿病足的方法，包括向受试者施用有效量的靶向性纳米微粒；

26、所述靶向性纳米微粒的表面富集有重组xvii型全长人胶原蛋白；

27、所述重组xvii型全长人胶原蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

28、本发明的有益效果为：

29、（1）本发明靶向性纳米微粒表面高度富集重组xvii型全长人胶原蛋白。通过分选信号肽引导，重组xvii型全长人胶原蛋白自发富集于纳米微粒膜上避免了外源性负载效率低、膜完整性受损等缺陷。

30、（2）本发明靶向性纳米微粒能够显著加速糖尿病足创面愈合。小鼠背部全层皮肤缺损伤口模型实验表明，本发明靶向性纳米微粒治疗组小鼠伤口愈合速度显著优于模型对照组，至第14天伤口基本接近完全闭合。

31、（3）本发明靶向性纳米微粒能够促进创面再上皮化、胶原沉积与有序排列、血管新生及细胞增殖。组织学染色结果显示，本发明靶向性纳米微粒能促进新生表皮形成、胶原纤维有序排列、诱导微血管重建及促进细胞增殖。

32、（4）本发明靶向性纳米微粒能够抑制创面局部炎症反应。免疫组化结果显示，本发明靶向性纳米微粒能显著抑制促炎因子tnf-α和il-6的表达，促进创面从炎症期向修复期转变。

1.一种靶向性纳米微粒在制备用于治疗糖尿病足的药物中的应用，其特征在于，所述靶向性纳米微粒包括重组xvii型全长人胶原蛋白；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组xvii型全长人胶原蛋白通过分选信号肽引导富集于所述靶向性纳米微粒的表面。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述分选信号肽包含seq id no.2所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述靶向性纳米微粒选自外泌体或微囊泡。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述靶向性纳米微粒来源于经工程化改造的宿主细胞，所述宿主细胞表达所述重组xvii型全长人胶原蛋白。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述宿主细胞为真核细胞。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述宿主细胞为293t细胞。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述靶向性纳米微粒通过以下方式制备获得：

10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型选自凝胶、喷雾、软膏、敷料、冻干粉针或注射剂。

11.一种治疗糖尿病足的方法，其特征在于，包括向受试者施用有效量的靶向性纳米微粒；