一种负载DKK3过表达MSCs成软骨球的水凝胶及其制备方法和应用与流程

本发明属于组织工程与再生医学和干细胞治疗，具体而言，涉及一种负载dkk3过表达mscs成软骨球的水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术：

1、关节软骨是一种覆盖于关节表面的高度特化结缔组织，主要由软骨细胞及其分泌的细胞外基质组成，在关节运动过程中发挥缓冲冲击、分散载荷和降低摩擦的重要作用。然而，由于关节软骨缺乏血管、神经和淋巴系统，其营养供应主要依赖滑液扩散，因此一旦受到创伤、运动损伤、退行性改变或疾病因素影响形成软骨缺损后，难以实现有效的自我修复。

2、软骨缺损是骨科和运动医学领域常见的临床问题，可由急性创伤、运动损伤、关节不稳定、骨软骨病变以及长期机械磨损等多种因素引起。未经有效治疗的软骨缺损可进一步导致软骨退变、骨软骨结构破坏、关节功能下降，严重时甚至进展为骨关节炎。因此，实现软骨组织的有效再生修复一直是再生医学和组织工程领域的重要研究方向。

3、目前临床上针对软骨缺损的治疗方法主要包括微骨折术、自体软骨移植术、自体软骨细胞移植术以及骨软骨移植术等。虽然上述方法在一定程度上能够改善患者的症状，但仍存在供体来源有限、手术创伤较大、修复组织力学性能不足以及长期疗效不稳定等问题。同时，新生组织往往以纤维软骨为主，难以恢复天然透明软骨的结构和功能。

4、近年来，基于间充质基质细胞（mesenchymal stromal cells，mscs）的组织工程软骨修复技术受到广泛关注。mscs具有来源广泛、自我更新能力强、多向分化潜能高及免疫原性低等优势，被认为是理想的软骨组织工程种子细胞。然而，不同组织来源mscs之间存在显著异质性，其软骨分化能力和修复效果差异较大。此外，移植后的mscs在损伤微环境中容易出现存活率降低、软骨表型不稳定以及修复效率不足等问题，限制了其临床应用。

5、dickkopf相关蛋白3（dickkopf-3，dkk3）是dickkopf家族成员之一，参与wnt/β-catenin信号通路调控、细胞增殖分化及组织再生等过程。已有研究表明dkk3与软骨形成及软骨稳态维持密切相关，但不同来源mscs中dkk3表达水平与软骨分化能力之间的关系尚未得到充分阐明。同时，如何通过调控dkk3表达提高mscs软骨形成能力，并结合适宜的生物材料构建稳定、高效的软骨修复体系，仍是当前软骨组织工程领域亟待解决的关键技术问题。

6、因此，开发一种具有高软骨形成能力的工程化mscs及其生物材料递送系统，对于促进软骨缺损修复和提高组织工程软骨再生效果具有重要的理论意义和临床应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种负载dkk3过表达mscs成软骨球的水凝胶及其制备方法和应用，以能够通过筛选高软骨分化潜能mscs亚群并结合dkk3基因调控技术获得具有增强软骨再生能力的工程化细胞，并进一步利用peg-sm@cd水凝胶构建细胞-生物材料复合体系，用于实现对促进软骨组织再生以及治疗骨关节炎、软骨缺损和其他退行性关节疾病的治疗。

2、本发明首先从不同来源mscs中筛选出具有最强软骨分化能力的mscs亚群，并通过基因及蛋白水平检测发现该亚群具有较高的dkk3表达水平。进一步通过基因工程技术构建dkk3过表达mscs，并进行三维成软骨诱导培养，获得具有增强软骨形成能力的工程化细胞。

3、在此基础上，将所述工程化细胞负载于peg-sm@cd水凝胶中，构建细胞-生物材料复合体系。所述水凝胶具有良好的生物相容性、可注射性、自修复能力及三维支撑作用，能够为细胞提供适宜的微环境，提高细胞存活率和软骨表型稳定性。

4、为此，本发明提供如下技术方案。

5、本发明的第一个方面提供了一种负载dkk3过表达mscs成软骨球的水凝胶，包括：

6、（1）水凝胶载体；以及

7、（2）负载于所述水凝胶载体中的dkk3高表达成软骨诱导间充质基质细胞。

8、在本发明的一个优选实施例中，所述水凝胶载体由四臂聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯、四臂聚乙二醇-氨基以及负载有软骨损伤修复药物的β-环糊精衍生物经交联反应形成。

9、在本发明的一个优选实施例中，所述间充质基质细胞来源于人骨髓间充质基质细胞、脂肪间充质基质细胞、脐带间充质基质细胞或蜕膜间充质基质细胞中的任一种。经筛选获得成软骨分化能力最强的亚型，且mscs中dkk3蛋白表达水平显著高于其他mscs亚型。

10、在本发明的一个优选实施例中，所述dkk3高表达通过病毒载体、质粒载体、转座子系统或基因编辑技术中的任一种实现。经过dkk3基因过表达后，其成软骨分化能力进一步增强。

11、在本发明的一个优选实施例中，所述dkk3过表达成软骨诱导间充质基质细胞是通过基因工程技术构建dkk3过表达间充质基质细胞后，再经三维成软骨诱导培养获得。

12、在本发明的一个优选实施例中，所述水凝胶载体中负载有软骨修复药物的β-环糊精衍生物的终浓度为20～50 nm。

13、在本发明的一个优选实施例中，所述水凝胶载体中负载有软骨修复药物的β-环糊精衍生物的终浓度为30 nm。

14、在本发明的一个优选实施例中，所述水凝胶载体中四臂聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯和四臂聚乙二醇-氨基的质量浓度各自为10%～20%（w/v）。

15、在本发明的一个优选实施例中，所述水凝胶载体中四臂聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯和四臂聚乙二醇-氨基的质量浓度各自为10%（w/v）。

16、在本发明的一个优选实施例中，所述水凝胶载体中负载的dkk3高表达成软骨诱导间充质基质细胞浓度为1×105～1×108cells/ml。

17、在本发明的一个优选实施例中，所述水凝胶载体中负载的dkk3高表达成软骨诱导间充质基质细胞浓度为1×107cells/ml。

18、在本发明的一个优选实施例中，所述水凝胶载体具有三维多孔网络结构，孔径为50～200 μm。

19、在本发明的一个优选实施例中，所述dkk3过表达成软骨诱导间充质基质细胞中dkk3蛋白表达量提高2～10倍，sox9表达水平提高1.5～3倍，col2a1表达水平提高2～4倍。

20、本发明的第二个方面提供了一种如前所述的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

21、（1）采用基因工程技术将dkk3过表达载体导入间充质基质细胞中，筛选获得稳定过表达dkk3的间充质基质细胞；

22、（2）将所得dkk3过表达间充质基质细胞进行三维成软骨诱导培养，获得dkk3过表达成软骨诱导间充质基质细胞；

23、（3）制备水凝胶前驱体溶液；

24、（4）将dkk3过表达成软骨诱导间充质基质细胞与水凝胶前驱液混合，交联形成负载dkk3过表达mscs成软骨球的水凝胶。

25、在本发明的一个优选实施例中，步骤（1）中，所述基因工程技术为慢病毒介导的基因转染。

26、在本发明的一个优选实施例中，步骤（2）中，所述三维成软骨诱导培养为将p3~p7代之间的间充质基质细胞接种至超低黏附孔板中，细胞接种量不少于1万每孔，总接种量不少于40万；待铺板后的细胞成球后，于成软骨分化液中诱导培养21-28天。

27、在本发明的一个优选实施例中，所述软骨分化相关指标包括：alcian blue染色检测糖胺聚糖沉积、elisa检测软骨生成相关分泌因子comp和tsp-2、western blot检测软骨相关蛋白sox9和col2a1。

28、在本发明的一个优选实施例中，步骤（3）中，所述水凝胶前驱体溶液的制备方法包括以下步骤：

29、将软骨损伤修复药物与β-环糊精衍生物混合，获得包合物溶液；

30、将四臂聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯溶液、四臂聚乙二醇-氨基溶液和包合物溶液混合，形成水凝胶前驱体溶液。

31、在本发明的一个优选实施例中，所述软骨损伤修复药物与β-环糊精衍生物的摩尔比为1:1～1:3。

32、在本发明的一个优选实施例中，所述软骨损伤修复药物与β-环糊精衍生物的摩尔比为1:2。

33、在本发明的一个优选实施例中，所述四臂聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯溶液和四臂聚乙二醇-氨基溶液的质量浓度均为10%～20%（w/v）。

34、在本发明的一个优选实施例中，所述四臂聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯溶液和四臂聚乙二醇-氨基溶液的质量浓度均为10%（w/v）。

35、在本发明的一个优选实施例中，所述四臂聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯溶液和四臂聚乙二醇-氨基溶液的体积比为1:1。

36、在本发明的一个优选实施例中，步骤（4）中，所述dkk3过表达成软骨诱导间充质基质细胞的负载浓度为1×105～1×108cells/ml。

37、本发明的第三个方面提供了一种如前所述的水凝胶在制备促进骨损伤修复药物中的应用。

38、在本发明的一个优选实施例中，所述骨损伤包括骨关节炎、创伤性/局灶性软骨缺损、退行性软骨病变、关节软骨损伤或其他退行性关节疾病。

39、在本发明的一个优选实施例中，所述药物的给药方式包括关节腔注射、软骨缺损填充或组织工程移植。

40、本发明的水凝胶能够促进软骨细胞外基质形成，提高col2a1及sox9表达水平、抑制mmp9、mmp13介导的软骨基质降解；在体外il-1β诱导的软骨损伤模型中表现出显著的软骨保护和修复效果，并可抑制il-1β诱导的软骨基质降解；改善炎症微环境并促进软骨组织再生。

41、借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点：

42、（1）本发明首次从不同组织来源的mscs中筛选获得高软骨形成潜能mscs亚群（dmscs），建立了mscs软骨分化能力与dkk3表达水平之间的关联，为高功能mscs筛选提供了新的理论依据和技术路径。

43、（2）本发明通过dkk3基因过表达技术显著增强mscs的软骨分化能力，提高sox9、col2a1等软骨特异性基因表达，促进细胞外基质合成和软骨表型维持，有效解决了mscs软骨分化效率低下的问题。

44、（3）本发明采用三维成软骨诱导培养方式获得稳定表达软骨表型的工程化mscs，相比传统二维培养更能模拟体内软骨发育微环境，提高了细胞的软骨形成能力及治疗效果。

45、（4）本发明利用peg-sm@cd可注射水凝胶构建细胞递送平台，该水凝胶具有良好的生物相容性、可注射性、自修复能力、三维多孔结构及适宜的降解性能，能够为细胞提供良好的三维微环境，提高细胞存活率、定植能力及组织修复效率。

46、（5）本发明将小分子药物sm04690负载于水凝胶中，通过sm04690的wnt信号通路抑制作用与dkk3的协同效应，进一步增强复合体系的软骨修复能力。

47、（6）在il-1β诱导的软骨损伤模型中，本发明的细胞-水凝胶复合体系能够有效抑制炎症反应及软骨基质降解（mmp9/mmp13），促进软骨再生和功能恢复，表现出优异的抗炎及软骨保护作用。

48、（7）本发明实现了“高功能种子细胞筛选+基因增强策略+小分子药物调控+生物材料递送体系”的有机结合，形成了具有协同修复作用的组织工程软骨构建体系。

49、（8）本发明所构建的细胞-生物材料复合体系具有良好的生物相容性、安全性及临床转化潜力，可广泛应用于骨关节炎、创伤性软骨缺损、退行性软骨病变及其他关节疾病的治疗。

50、上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例详细说明如后。