一种基于OpenHLA泛修饰免疫肽的开放式检索方法与流程

一、本发明涉及免疫肽组学质谱数据分析，尤其涉及一种面向hla呈递肽段数据的开放修饰数据库检索方法。更具体地，本发明涉及在非酶切免疫肽数据库检索场景下，融合de novo序列信息、tag索引、ion索引、开放修饰候选生成以及专用重打分模型，以提高修饰免疫肽鉴定灵敏度、准确性和计算效率的检索方法。

背景技术：

0、二、背景技术

1、（一）现有技术状况

2、免疫肽组学主要研究由主要组织相容性复合体相关hla分子呈递至细胞表面的肽段。该类肽段通常具有非酶切、长度分布较宽、来源蛋白复杂、修饰类型多样以及样本特异性较强等特点。质谱技术是识别hla呈递肽段的重要技术手段，数据库检索则是质谱数据解析中最常用的计算方法之一。

3、现有免疫肽数据库检索方法通常以参考蛋白数据库为基础，在限定肽段长度、质量容差和少量可变修饰条件下生成候选肽，并将候选肽理论碎片离子与实验ms/ms谱图进行匹配评分。该类方法在修饰种类较少、候选空间较受控时具有较高的计算效率。

4、传统开放搜索或大质量偏移搜索方法通过放宽前体质量差限制，以发现未知或未预设修饰。de novo测序方法能够从ms/ms谱图直接推断局部序列片段，为数据库检索提供潜在序列线索。percolator等重打分方法则通常基于目标-诱饵策略和机器学习模型，对候选肽谱匹配结果进行再排序，以改善目标肽与诱饵肽之间的区分能力。

5、（二）现有技术存在的问题

6、第一，常规免疫肽数据库检索通常仅支持有限数量的可变修饰。当同时引入大量修饰时，候选肽组合数量迅速增加，容易产生组合爆炸，导致搜索时间、内存消耗和假阳性风险显著上升。

7、第二，传统开放搜索方法多侧重前体质量偏移匹配，未能充分利用免疫肽场景中的局部序列信息、de novo片段信息以及碎片离子索引信息，导致候选空间裁剪效率不足。

8、第三，hla呈递肽段通常不符合胰蛋白酶酶切肽段的经典规则，具有非酶切、长度变化大和修饰位置不固定等特点。若直接沿用常规蛋白质组学候选生成和评分逻辑，容易造成候选生成不充分、评分特征失配或结果可信度下降。

9、第四，通用percolator或通用重打分模块通常基于常规蛋白质组学特征体系构建，未充分考虑免疫肽开放修饰检索中大量修饰候选、特殊候选生成来源、修饰定位证据、tag支持度和ion覆盖特征等因素，导致target与decoy分离能力受限。

10、因此，需要一种专门面向hla免疫肽开放修饰检索的方法，使其能够在扩大修饰搜索空间的同时控制候选复杂度，提高搜索效率，并通过适配免疫肽开放修饰特征的重打分机制提升鉴定准确性。

技术实现思路

0、三、 技术实现要素：

1、（一）发明目的

2、本发明的目的在于提供一种基于openhla泛修饰免疫肽的开放式检索方法，以解决现有技术在hla免疫肽开放修饰搜索中存在的修饰搜索能力有限、候选空间膨胀、检索效率低、通用评分模型适配不足以及鉴定可信度受限等问题。

3、本发明通过在数据库检索框架下融合de novo序列信息、tag索引和ion索引，并构建面向open hla开放修饰免疫肽场景的专用percolator重打分模块，实现搜索深度、鉴定准确性和计算效率之间的平衡。

4、（二）技术方案

5、为实现上述目的，本发明提供一种基于openhla泛修饰免疫肽的开放式检索方法，所述方法包括以下步骤：

6、s1：获取免疫肽组学质谱数据并进行预处理。所述质谱数据可包括原始质谱文件、mzml文件、mgf文件或其他可用于数据库检索的谱图数据。预处理可包括谱图去噪、峰筛选、前体质量校正、碎片离子质量校正、谱图质量控制、峰强度归一化以及适于后续de novo分析和数据库检索的格式标准化。

7、s2：构建目标数据库、诱饵数据库及修饰规则集合。目标数据库可包括参考蛋白数据库、样本特异蛋白数据库、变异蛋白数据库、转录组翻译数据库或其组合。诱饵数据库可通过反转、随机化或其他诱饵生成策略获得。修饰规则集合可包含多个可变修饰，所述修饰可按氨基酸位点、肽段n端或c端、蛋白n端或c端、质量偏移范围、化学类别、是否允许组合修饰等规则组织。

8、s3：对ms/ms谱图执行de novo分析。针对每张ms/ms谱图，获得一个或多个候选序列片段、局部氨基酸标签、氨基酸质量路径、局部置信度分数或可信位置片段。de novo结果不直接替代数据库检索结果，而是作为后续候选召回、候选排序和候选筛选的先验约束信息。

9、s4：基于de novo结果构建或提取tag信息，并建立tag索引。所述tag可为连续氨基酸片段、允许部分质量容差的局部序列模式、含修饰容忍的序列标签或其组合。利用tag索引，可从数据库中快速召回与谱图局部序列一致或近似一致的候选区域，以缩小全库搜索范围。

10、s5：建立ion索引。所述ion索引针对数据库候选肽、候选片段或理论碎片离子进行预先编码和组织。在谱图匹配时，可根据实验谱图中观察到的碎片离子峰快速定位潜在候选肽、候选片段或修饰位置区域。所述ion索引可支持b离子、y离子、中性丢失离子、不同电荷态离子以及与修饰相关的偏移离子。

11、s6：融合de novo信息、tag索引和ion索引生成开放修饰候选肽。在数据库检索框架下，可先利用de novo结果和tag索引召回与谱图局部序列一致的候选区域，再利用ion索引进行快速匹配、打分和筛选，随后在大修饰空间下进行候选肽修饰赋值、修饰定位和理论谱计算，得到开放修饰候选肽谱匹配结果。候选召回顺序不限于上述顺序，也可采用ion索引先行召回、多路并行召回或分阶段召回方式。

12、s7：对开放修饰候选肽进行初评分。初评分可综合前体质量误差、碎片离子匹配数量、碎片离子强度解释度、连续离子覆盖长度、修饰定位合理性、修饰质量偏移一致性、denovo一致性、tag匹配一致性、ion索引召回强度、候选肽长度、候选肽电荷态以及候选生成来源等特征。

13、s8：构建并应用专门适配open hla的percolator重打分模块。所述重打分模块针对免疫肽开放修饰搜索特点设计特征集，并利用目标-诱饵策略训练或应用分类模型，对候选psm、肽段和/或修饰位点进行重打分，输出用于结果排序的判别分数。

14、s9：进行fdr控制并输出结果。根据目标-诱饵策略，在psm层面、肽段层面、蛋白来源层面、修饰层面和/或修饰位点层面对结果进行阈值控制，输出最终免疫肽开放修饰识别结果。输出结果可包括谱图编号、候选肽序列、修饰类型、修饰位置、质量偏移、初评分、重打分分数、fdr或q值、目标/诱饵标记以及候选生成来源。

15、进一步地，所述专门适配open hla的percolator重打分模块的输入特征至少可包括开放修饰候选数、修饰定位特征、非酶切序列特征、de novo支持度、tag支持度、ion覆盖度、前体质量误差、碎片质量误差、修饰数目、修饰类别、候选肽长度、候选肽电荷态、目标/诱饵分布相关特征以及候选生成来源特征中的一种或多种。

16、进一步地，所述方法还可包括对修饰质量偏移进行聚类归并、对候选肽进行二阶段精筛、按肽段长度区间或修饰类别进行分组评分、对percolator重打分结果进行稳定性约束、采用多模型融合进行结果排序，或者结合样本hla分型信息对候选免疫肽进行后处理过滤。

17、（三）有益效果

18、提高修饰搜索能力。与仅支持有限修饰的常规免疫肽搜库方法相比，本发明能够在更大的修饰空间下识别hla呈递肽段，有利于发现更多修饰免疫肽。

19、提高搜索效率。通过融合de novo结果、tag索引与ion索引，可在扩大搜索空间的同时减少无效候选比较，降低计算复杂度。

20、提高免疫肽场景适配性。本发明针对hla肽非酶切、长度变化大和修饰多样的特点设计候选生成和评分特征，比常规蛋白质组学流程更适合免疫肽数据分析。

21、提高鉴定准确性。专用percolator重打分模块能够利用开放修饰候选、修饰定位、tag支持、ion覆盖和de novo一致性等特征，提高target与decoy的分离能力。

22、兼顾搜索深度与计算成本。本发明通过多级候选约束和索引策略，在不显著牺牲可计算性的前提下实现更深层次的开放修饰搜索。

23、具有较好的可扩展性。本发明可扩展至不同hla类别、不同物种数据库、不同修饰规则集、不同质谱平台及不同数据分析流程。