一种高效液相色谱法检测乌布吉泮及其对映体和非对映体杂质的方法与流程

1.本发明属于药物分析领域，具体涉及一种高效液相色谱法检测乌布吉泮及其对映体和非对映体杂质的方法。


背景技术：

2.乌布吉泮（ubrogepant）是由美国默克公司研发的一款治疗偏头痛的口服药，其作用机制是降钙素基因相关肽受体拮抗剂，该药物于2019年在美国上市。乌布吉泮的结构如式（i）所示：（i）目前暂无文献报道乌布吉泮及其对映体和非对映体杂质的分析方法。乌布吉泮对映体及非对映体结构式分别如式（ii）和式（iii）所示：


技术实现要素：

3.本发明提供一种高效液相色谱法检测乌布吉泮及其对映体和非对映体杂质的方法。本发明使用大赛璐ox-3r反相手性色谱柱，可以分离对映体和非对映体，试剂便宜易得，成本更低，操作更方便、安全。而常规色谱柱无法分离。
4.本发明采用的技术方案如下：一种高效液相色谱法检测式（i）结构及其对映体和非对映体杂质的方法，式（i）结构如下：（i）
其特征在于：1）色谱条件：色谱柱为大赛璐ox-3r，150*4.6mm，3μm；流动相及比例为乙酸铵水溶液：乙腈=（50~60）：（40~50），乙酸铵水溶液浓度为5~20mm；检测波长为275~285nm；柱温为20~30℃，流动相流速为0.3～0.8ml/min；2）供试品溶液的配置：将样品用乙腈溶解，再用水稀释；3）测定：精密量取供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。
5.本方法所述乙酸铵水溶液浓度5mm、10mm或20mm。
6.本方法所述乙酸铵水溶液浓度10mm。
7.本方法所述流动相10mm乙酸铵水溶液与乙腈比例为（55：45）、（50：50）或（40：60）。
8.本方法所述检测波长为275nm、280nm、285nm。
9.本方法所述柱温为20℃、25℃或30℃。
10.本方法所述流动相流速为0.3ml/min、0.5ml/min和0.8ml/min。
11.本方法所述流动相为10mm乙酸铵：乙腈=55：45。
12.本方法所述色谱柱为大赛璐ox-3r，150*4.6mm，3μm；流动相及比例为10mm乙酸铵：乙腈=55：45；检测波长为280nm；柱温为25℃，流动相流速为0.5ml/min。
13.本方法进一步包括所述供试品浓度为1.0mg/ml。
14.本发明提供的高效液相色谱法检测乌布吉泮及其对映体和非对映体杂质的方法可实现乌布吉泮与其对映体和非对映体杂质完全分离，6份加标供试品溶液测得对映体和非对映体杂质含量rsd≤2.0%，重复性良好，方法耐用性好，可用于乌布吉泮的质量控制。
15.本发明所述任意数字区间范围包含端点值及中间任意值。如0.3～0.8包含0.3、0.4、0.5、0.6、0.7和0.8等。
附图说明
16.图1实施例1-c所述方法的检测图谱。
17.图2实施例1-q所述方法的检测图谱。
具体实施方式
18.实施例1：色谱条件的筛选 通过色谱柱、流动相、波长、流速等进行筛选确定色谱条件。
19.实施例1-a色谱柱：大赛璐odh250*4.6mm，5μm；柱温：25℃；稀释剂：乙醇溶解，流动相稀释；检测波长：210nm；流速：0.5ml/min；样品配制：1.0mg/ml；进样量：10μl；流动相：正己烷：乙醇=90：10，按照0 min、60min等度洗脱；结论：主成分和对映体杂质峰出峰较晚，60min内未出峰。
20.实施例1-b色谱柱：大赛璐ic 250*4.6mm，5μm；柱温：25℃；稀释剂：乙醇溶解，流动相稀释；检测波长：210nm；流速：0.5ml/min；样品配制：1.0mg/ml；进样量：10μl；
流动相：100%乙醇，按照0 min、60min等度洗脱；结论：采用ic柱及中性体系，对映体和对非对映体杂质与主成分未完全分离。
21.实施例1-c色谱柱：大赛璐ic 250*4.6mm，5μm；柱温：25℃；稀释剂：乙醇溶解，流动相稀释；检测波长：210nm；流速：0.5ml/min；样品配制：1.0mg/ml；进样量：10μl；流动相：正己烷：乙醇=20：80，按照0 min、60min等度洗脱；结论：对映体/非对映体杂质与主成分未完全分离。
22.实施例1-d色谱柱：大赛璐ic 250*4.6mm，5μm；柱温：25℃；稀释剂：乙醇溶解，流动相稀释；检测波长：210nm；流速：0.5ml/min；样品配制：1.0mg/ml；进样量：10μl；流动相：正己烷：乙醇=50：50，按照0 min、60min等度洗脱；结论：对映体/非对映体杂质与主成分分离稍有改善，但峰型较差，且主成分与对映体杂质峰分离不佳。
23.实施例1-e色谱柱：大赛璐odrh 150*4.6mm，5μm；柱温：25℃；稀释剂：乙醇溶解，流动相稀释；检测波长：210nm；流速：0.5ml/min；样品配制：1.0mg/ml；进样量：10μl；流动相：10mm磷酸氢二铵ph6.5：乙腈=60：40；按照0 min、60min等度洗脱；结论：换用odrh柱，流动相采用中性体系，主成分与对映体基本分离，但对映体和非对映体两个峰未分离。
24.实施例1-f色谱柱：大赛璐ie 250*4.6mm，5μm；柱温：25℃；稀释剂：乙醇溶解，流动相稀释；检测波长：210nm；流速：0.5ml/min；样品配制：1.0mg/ml；进样量：10μl；流动相：正己烷：乙醇=50：50；按照0 min、60min等度洗脱；结论：使用ie柱，主成分与对映体出峰较晚，60min内未出峰。
25.实施例1-g色谱柱：大赛璐ojrh 150*4.6mm，5μm；柱温：25℃；稀释剂：乙醇溶解，流动相稀释；检测波长：210nm；流速：0.5ml/min；样品配制：1.0mg/ml；进样量：10μl；流动相：10mm磷酸氢二铵ph6.5：乙腈=60：40；按照0 min、60min等度洗脱；结论：使用ojrh柱，主成分与对映体出峰较早，分离不佳。
26.实施例1-h色谱柱：大赛璐ojh 250*4.6mm，5μm；柱温：25℃；稀释剂：乙醇溶解，流动相稀释；检测波长：210nm；流速：0.5ml/min；样品配制：1.0mg/ml；进样量：10μl；流动相：正己烷：乙醇=50：50；按照0 min、60min等度洗脱；
结论：使用ojh柱，对映体和非对映体峰型较差。
27.实施例1-i色谱柱：大赛璐id 150*4.6mm，5μm；柱温：25℃；稀释剂：乙醇溶解，流动相稀释；检测波长：210nm；流速：0.5ml/min；样品配制：1.0mg/ml；进样量：10μl；流动相：10mm磷酸氢二铵ph6.5：乙腈=70：30；按照0 min、60min等度洗脱；结论：使用id柱，主成分与对映体出峰较晚，60min内未出峰。
28.实施例1-j色谱柱：大赛璐ojrh 150*4.6mm，5μm；柱温：25℃；稀释剂：乙醇溶解，流动相稀释；检测波长：210nm；流速：0.5ml/min；样品配制：1.0mg/ml；进样量：10μl；流动相：10mm磷酸氢二铵ph6.5：乙腈=70：30；按照0 min、60min等度洗脱；结论：主成分和对映体未完全分离。
29.实施例1-k色谱柱：大赛璐ic 250*4.6mm，5μm；柱温：25℃；稀释剂：乙醇溶解，流动相稀释；检测波长：210nm；流速：0.5ml/min；样品配制：1.0mg/ml；进样量：10μl；流动相：正己烷：乙醇=40：60；按照0 min、60min等度洗脱；结论：主成分与对映体峰型改善，但对映体和主成分分离无改善。
30.实施例1-l色谱柱：大赛璐ic 250*4.6mm，5μm；柱温：25℃；稀释剂：乙醇溶解，流动相稀释；检测波长：210nm；流速：0.5ml/min；样品配制：1.0mg/ml；进样量：10μl；流动相：正己烷：乙醇：异丙醇=40：50：10；按照0 min、60min等度洗脱；结论：主成分与对映体峰型变差，分离无改善。
31.实施例1-m色谱柱：大赛璐ic 250*4.6mm，5μm；柱温：25℃；稀释剂：乙醇溶解，流动相稀释；检测波长：210nm；流速：0.5ml/min；样品配制：1.0mg/ml；进样量：10μl；流动相：正己烷：乙醇=45：55；按照0 min、60min等度洗脱；结论：主成分与对映体分离度小于1.0，峰型也较差。
32.实施例1-n色谱柱：大赛璐ic 250*4.6mm，5μm；柱温：25℃；稀释剂：乙醇溶解，流动相稀释；检测波长：210nm；流速：0.8ml/min；样品配制：1.0mg/ml；进样量：10μl；流动相：正己烷：乙醇=45：55；按照0 min、60min等度洗脱；结论：主峰、杂质峰型较差，分离无改善。
33.实施例1-o色谱柱：大赛璐ox-3r 150*4.6mm，3μm；
柱温：25℃；稀释剂：乙醇溶解，流动相稀释；检测波长：210nm；流速：0.5ml/min；样品配制：1.0mg/ml；进样量：10μl；流动相：10mm磷酸氢二铵ph6.5：乙腈=70：30；按照0 min、60min等度洗脱；结论：换用ox-3r柱，主成分和对映体2h内未出峰，在最后冲洗程序中疑似依次洗脱出，有分离迹象。
34.实施例1-p色谱柱：大赛璐ox-3r 150*4.6mm，3μm；柱温：25℃；稀释剂：乙醇溶解，流动相稀释；检测波长：280nm；流速：0.5ml/min；样品配制：1.0mg/ml；进样量：10μl；流动相：10mm乙酸铵：乙腈=50：50；按照0 min、60min等度洗脱；结论：主成分与对映体出峰适宜，基本分离。
35.实施例1-q色谱柱：大赛璐ox-3r 150*4.6mm，3μm；柱温：25℃；稀释剂：乙醇溶解，流动相稀释；检测波长：280nm；流速：0.5ml/min；样品配制：1.0mg/ml；进样量：10μl；流动相：10mm乙酸铵：乙腈=55：45；按照0 min、45min等度洗脱；结论：主成分、对映体和非对映体出峰适宜，完全分离，无干扰。
36.实施例2：重复性试验取6份加标供试品溶液，连续进样，记录色谱图，结果如下：（1）乌布吉泮对映体保留时间：27.747；峰面积：4.2385；对映体含量：0.39%；乌布吉泮非对映体保留时间：25.953；峰面积：1.4617；非对映体含量：0.13%。
37.（2）乌布吉泮对映体保留时间：27.700；峰面积：4.2586；对映体含量：0.39%；乌布吉泮非对映体保留时间：25.907；峰面积：1.4648；非对映体含量：0.13%。
38.（3）乌布吉泮对映体保留时间：27.683；峰面积：4.2279；对映体含量：0.39%；乌布吉泮非对映体保留时间：25.923；峰面积：1.4578；非对映体含量：0.13%。
39.（4）乌布吉泮对映体保留时间：27.677；峰面积：4.3186；对映体含量：0.40%；乌布吉泮非对映体保留时间：25.903；峰面积：1.4709；非对映体含量：0.14%。
40.（5）乌布吉泮对映体保留时间：27.620；峰面积：4.2967；对映体含量：0.39%；乌布吉泮非对映体保留时间：25.840；峰面积：1.4709；非对映体含量：0.13%。
41.（6）乌布吉泮对映体保留时间：27.653；峰面积：4.2156；对映体含量：0.38%；乌布吉泮非对映体保留时间：25.850；峰面积：1.4503；非对映体含量：0.13%。
42.重复性实验结果显示：6份加标供试品溶液连续进样，主成分及对映体/非对映体保留时间rsd分别为0.16%，0.16%和0.17%，均远低于2.0%。对映体/非对映体含量rsd分别为0.98%和1.03%，也远低于2.0%，实验方法重复性好。
43.实施例3：耐用性实验通过将色谱条件的流速、流动相比例、柱温、波长等进行调整，测定结果不受影响的承受程度。
44.实施例3-a、流动相不同比例耐用性实验色谱条件如下：
色谱柱：大赛璐ox-3r 150*4.6mm，3μm；柱温：25℃；稀释剂：用乙腈溶解，再用水稀释；检测波长：280nm；流速：0.5ml/min；样品配制：1.0mg/ml；进样量：10μl；按照0 min、45min等度洗脱；结果如下：1）10mm乙酸铵：乙腈=55：45，主成分与非对映体峰分离度为6.71，非对映体与对映体分离度1.42。
45.2）流动相：10mm乙酸铵：乙腈=50：50，主成分与非对映体峰分离度为6.03，非对映体与对映体分离度1.31。
46.3）流动相：10mm乙酸铵：乙腈=60：40，主成分与非对映体峰分离度为7.2，非对映体与对映体分离度1.56。
47.结论：耐用性流动相不同比例的测试结果显示：本测试方法的流动相比例10mm乙酸铵：乙腈=（50-60）：（40-50）之间变化，对测定结果影响不大，表明本方法的耐用性良好。
48.实施例3-b、不同柱温耐用性实验色谱柱：大赛璐ox-3r 150*4.6mm，3μm；稀释剂：用乙腈溶解，再用水稀释；检测波长：280nm；流速：0.5ml/min；样品配制：1.0mg/ml；进样量：10μl；流动相：10mm乙酸铵：乙腈=55：45；按照0 min、45min等度洗脱；结果如下：1）柱温25℃，主成分与非对映体峰分离度为6.71，非对映体与对映体分离度1.42。
49.2）柱温30℃，主成分与非对映体峰分离度为7.03，非对映体与对映体分离度1.48。
50.3）柱温20℃，主成分与非对映体峰分离度为6.27，非对映体与对映体分离度1.35。
51.结论：耐用性不同柱温的测试结果显示：本测试方法的柱温在20-30℃之间变化，对测定结果影响不大，表明本方法的耐用性良好。
52.实施例3-c、不同流速耐用性实验色谱柱：大赛璐ox-3r 150*4.6mm，3μm；柱温：25℃；稀释剂：用乙腈溶解，再用水稀释；检测波长：280nm；样品配制：1.0mg/ml；进样量：10μl；流动相：10mm乙酸铵：乙腈=55：45；按照0 min、45min等度洗脱；结论：主成分、对映体和非对映体出峰适宜，完全分离，无干扰。
53.结果如下：1）流速：0.5ml/min；主成分与非对映体峰分离度为6.71，非对映体与对映体分离度1.42。
54.2）流速：0.8ml/min；主成分与非对映体峰分离度为6.06，非对映体与对映体分离度1.26。
55.3）流速：0.3ml/min；主成分与非对映体峰分离度为7.18，非对映体与对映体分离度1.6。
56.结论：耐用性不同流速的测试结果显示：本测试方法的流速在0.3-0.8 ml/min之间变化，对测定结果影响不大，表明本方法的耐用性良好。
57.实施例3-d、不同检测波长耐用性实验色谱柱：大赛璐ox-3r 150*4.6mm，3μm；柱温：25℃；稀释剂：用乙腈溶解，再用水稀释；流速：0.5ml/min；样品配制：1.0mg/ml；进样量：10μl；流动相：10mm乙酸铵：乙腈=55：45；按照0 min、45min等度洗脱；结果如下：1）检测波长：280nm；主成分与非对映体峰分离度为6.71，非对映体与对映体分离度1.42。
58.2）检测波长：275nm；主成分与非对映体峰分离度为6.76，非对映体与对映体分离度1.42。
59.3) 检测波长：285nm；主成分与非对映体峰分离度为6.76，非对映体与对映体分离度1.42。
60.结论：耐用性不同检测波长的测试结果显示：本测试方法的检测波长在275-285 nm之间变化，对测定结果影响不大，表明本方法的耐用性良好。
61.实施例3-e、流动相水相中不同缓冲盐浓度耐用性实验色谱柱：大赛璐ox-3r 150*4.6mm，3μm；柱温：25℃；稀释剂：用乙腈溶解，再用水稀释；检测波长：280nm；流速：0.5ml/min；样品配制：1.0mg/ml；进样量：10μl；流动相：乙酸铵水溶液：乙腈=55：45；按照0 min、45min等度洗脱；结果如下：1）乙酸铵水溶液浓度为10mm，主成分与非对映体峰分离度为6.71，非对映体与对映体分离度1.42。
62.2）乙酸铵水溶液浓度为5mm，主成分与非对映体峰分离度为6.97，非对映体与对映体分离度1.49。
63.3）乙酸铵水溶液浓度为20mm，主成分与非对映体峰分离度为6.96，非对映体与对映体分离度1.47。
64.结论：耐用性流动相水相中不同缓冲盐浓度的测试结果显示：本测试方法的乙酸铵水溶液浓度在5-20 mm之间变化，对测定结果影响不大，表明本方法的耐用性良好。