微流道芯片及其使用方法与流程

微流道芯片及其使用方法
【技术领域】
1.本发明涉及一种微流道芯片及其使用方法，特别涉及一种自动化检测生物液体样本中生物物质的微流道芯片及其使用方法。


背景技术：

2.许多研究指出癌症仍然难以早期诊断。目前检测癌症的方式主要是靠计算机断层扫描及超声波检查。然而，这些方式需要肿瘤有一定的大小时才能确定是癌变，尤其是几种常发生在人体深处而没有任何疼痛的癌症。
3.循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，ctc)已被广泛作为癌症诊断和预后的潜在工具，因为它们在血液中的存在可能暗示着转移性复发。然而，因为ctc会从原发性肿瘤脱落进入脉管系统中，并以非常低的浓度在血液中不规则地循环，造成难以将ctc从全血样品中分离出来，因此检测ctc仍然是一个挑战。目前已广泛分离ctc的方法中，ctc的回收率低且纯度不高，会回收大量的白血球。因此，为了检测血液样品中的稀有ctc，需要一种能够执行所有实验过程而无需任何人工干预的自动、快速且灵敏的系统。
4.本发明的申请人鉴于现有技术中的不足，经过悉心试验与研究，并本着锲而不舍的精神，终构思出本发明，能够克服先前技术的不足，以下为本发明的简要说明。


技术实现要素：

5.本发明提供的微流道芯片及其使用方法可以进行免疫磁技术从全血样品中捕获目标癌细胞。本发明的微流道芯片与使用传统抗体生物标记方法相比，本发明的微流道芯片可以在短时间内有效执行整个过程，而无需人工干预，达到高回收率、高纯度的结果。
6.因此，本发明提供一种检测生物液体样本中的生物物质的微流道芯片，包括：基板；流道层，具有底面且黏合于所述基板上，其中所述流道层的所述底面包括：第一凹槽，与所述基板间形成样本混合区；第一通孔，在所述基板上形成样本检测槽的底部；第一驱动膜，是所述第一凹槽的上表面；以及第一未黏合区，位于所述第一凹槽及所述第一通孔间，形成所述样本混合区与所述样本检测槽间的第一阀门；以及气道层，具有顶面与底面，且黏合于所述流道层上，其中所述气道层的所述底面包括：第二凹槽，位置与所述第一凹槽对应，且具有延伸至所述顶面的第一驱动膜控制气孔，其中所述第一驱动膜设置于所述第一凹槽与所述第二凹槽间，且所述第一驱动膜控制气孔用以控制所述第一驱动膜的上升及下压；第二通孔，位置与所述第一通孔对应，且与所述第一通孔共同形成所述样本检测槽；以及第一阀门控制槽，位置与所述第一阀门对应，且具有延伸至所述顶面的第一阀门控制气孔，用以控制所述第一阀门的打开及闭合；以及磁珠，与所述生物液体样本混合形成样本混合液，且所述样本混合液容置于所述样本检测槽中，其中经由控制所述第一驱动膜的上升及下压及所述第一阀门的打开及闭合使所述样本混合液反复进出所述样本混合区，以增加所述生物物质与所述磁珠的结合机率。
7.本发明另提出一种检测生物液体样本中的生物物质的方法，包括：提供本发明的
微流道芯片；将所述样本混合液容置于所述样本检测槽中；经由所述第一阀门控制气孔施加第一真空吸力于所述第一阀门控制槽，使所述第一阀门上升而打开；在所述第一阀门打开的状态下，经由所述第一驱动膜控制气孔施加第二真空吸力于所述第二凹槽，使所述第一驱动膜上升，进而促使所述样本混合液进入所述样本混合区中；在所述第一阀门打开的状态下，经由所述第一驱动膜控制气孔施加气体压力于所述第二凹槽，使所述第一驱动膜下压，进而促使所述样本混合液被推出所述样本混合区；反复执行所述第一驱动膜的上升及下压步骤，使所述样本混合液反复进出所述样本混合区，其中所述样本混合液进入所述样本混合区时，产生漩涡造成所述磁珠自旋，进而增加所述生物物质与所述磁珠的结合机率。
8.本发明再提出一种微流道芯片，包括：基板；样本检测槽，设置于所述基板上；样本混合区，设置于所述基板上；阀门，设置于所述样本检测槽与所述样本混合区之间，其中所述阀门于常压下与所述基板接触形成闭合状态；阀门控制槽，设置于所述阀门上，用以控制所述阀门的开合，其中当第一真空吸力施加于所述阀门控制槽时，所述阀门控制槽使所述阀门上升而打开；作动组件，形成所述样本混合区的上表面，其中所述作动组件于所述常压下处于平坦状态；作动控制槽，设置于所述作动组件上，用以控制所述作动组件的上升及下压，其中当第二真空吸力施加于所述作动控制槽时，所述作动控制槽形成负压而使所述作动组件上升，且当气体压力施加于所述作动控制槽时，所述作动控制槽形成正压而使所述作动组件下压；以及磁珠，与液体样本混合形成样本混合液，并容置于所述样本检测槽中，其中在所述阀门打开的状态下，所述作动组件反复的上升及下压使所述样本混合液反复进出所述样本混合区，以增加所述液体样本中的物质与所述磁珠的结合机率。
9.本发明又提出一种微流道芯片，包括：样本检测槽；样本混合区；阀门，设置于所述样本检测槽与所述样本混合区之间；作动组件，形成所述样本混合区的上表面，其中所述作动组件于常压下处于平坦状态；作动控制槽，设置于所述作动组件上，用以控制所述作动组件的上升及下压，其中当真空吸力施加于所述作动控制槽时，所述作动控制槽形成负压而使所述作动组件上升，且当气体压力施加于所述作动控制槽时，所述作动控制槽形成正压而使所述作动组件下压；以及磁珠，与液体样本混合形成样本混合液，并容置于所述样本检测槽中，其中在所述阀门打开的状态下，所述作动组件反复的上升及下压使所述样本混合液反复进出所述样本混合区，以增加所述液体样本中的物质与所述磁珠的结合机率。
【附图说明】
10.本发明的上述目的及优点在参阅以下详细说明及附随附图之后对那些所属技术领域中的普通技术人员将变得更立即地显而易见。[图1]为本发明的微流道芯片的立体示意图。[图2]为本发明的微流道芯片的俯视示意图。[图3]为本发明的微流道芯片的爆炸示意图。[图4]为本发明的微流道芯片的流道层黏合于基板后的立体示意图。[图5a～图5c]为本发明的微流道芯片中样本检测槽与样本混合区的截面示意图。[图6]为本发明第一驱动单元的压力与样本混合液的进样体积的关系图。[图7]为本发明磁珠使用量与肿瘤细胞的回收率的关系图。
[图8]为显微镜下肿瘤细胞上吸附磁珠的影像图。[图9]为肿瘤细胞数与回收率的关系图。[图10]为混合时间与肿瘤细胞的回收率的关系图。[图11]为利用本发明的微流道芯片检测生物液体样本中的生物物质的方法流程图。[图12]为本发明的检测方法中的清洗步骤流程图。[图13]为本发明的检测方法中的反应步骤流程图。[图14]为本发明的微流道芯片的荧光显微镜影像图。【实施方式】
[0011]
以下在实施方式中详细叙述本发明的详细特征以及优点，其内容足以使任何本领域技术人员了解本发明的技术内容并据以实施，且根据本说明书所公开的内容、申请专利范围及附图，任何本领域技术人员可轻易地理解本发明相关的目的及优点。以下的实施方案为进一步详细说明本发明的观点，但不以任何观点限制本发明的范围。
[0012]
本发明的微流道芯片可以用于检测生物液体样本中的生物物质。在优选实施方案中，生物液体样本可以是体液或菌液，体液包括血液、脑脊髓液、各种消化液、精液、唾液、汗液、尿液、阴道分泌液或是含有生物物质的溶液，生物物质可以是ctc、ctc循环干细胞(例如肿瘤干细胞、肝脏干细胞及骨髓干细胞)、胎儿细胞、细菌、病毒、上皮细胞、内皮细胞或其他生物物质。
[0013]
请参阅图1～3，其分别为本发明的微流道芯片的立体示意图、俯视示意图及爆炸示意图。本发明的微流道芯片10包括芯片本体20及磁珠(未示出)，芯片本体20包括三层组件，其为基板100、流道层200及气道层300。流道层200会黏合于基板100上，气道层300黏合于流道层200上，故微流道芯片10由下而上依序为基板100、流道层200及气道层300。基板100为透明且硬材质的材料，可以是玻璃、压克力(pmma)、聚碳酸酯(pc)、聚苯乙烯(ps)、工程塑料(abs)、聚二甲硅氧烷(pdms)或其他聚合塑料。流道层200及气道层300是软材质的材料，可以是聚二甲硅氧烷(pdms)，且气道层300的厚度大于流道层200的厚度。在本发明的实施方案中，微流道芯片10的基板100的厚度为1mm以上，流道层200的厚度为0.2～1mm，以及气道层300的厚度为0.5～8mm。更优选地，本发明的微流道芯片10的基板100的厚度为1mm，流道层200的厚度为1mm，以及气道层300的厚度为8mm。
[0014]
请参阅图1～4，流道层200具有底面201及上表面202，底面201黏合于基板100上。流道层200的底面201具有朝向上表面202延伸的第一凹槽210、第一通孔220、及位于第一凹槽210与第一通孔220之间的通道凹槽230。当流道层200黏合于基板100后，第一凹槽210与基板100间形成样本混合区410，其中流道层200的第一凹槽210并未形成穿孔，而与上表面202间留有一层比流道层还薄的薄膜，使薄膜形成第一凹槽210的上表面，称为驱动膜240(或称为作动组件)；第一通孔220与基板100间形成样本检测槽420的底部421；以及通道凹槽230与基板100间形成连接样本检测槽420与样本混合区410的信道430，其中信道凹槽230具有非凹槽部231，非凹槽部231在流道层200黏合于基板100后，不会黏合在基板100上，为未黏合区232，使非凹槽部231在常压下会与基板100形成闭合状态，形成在样本检测槽420与样本混合区410之间的阀门233。在本发明实施方案中，样本混合区410为圆形，但不限于圆形，可以是方形、五边形、六边形等其他形状。
[0015]
请参阅图1～4，气道层300具有顶面301与底面302，底面302黏合于流道层200的上表面202上。气道层300的底面302包括朝向顶面301延伸的第二凹槽310、第二通孔320及位于第二凹槽310与第二通孔320之间的阀门控制槽330。第二凹槽310、第二通孔320及阀门控制槽330的位置分别对应于第一凹槽210、第一通孔220及阀门233。第二凹槽310具有延伸至顶面301的驱动膜控制气孔311，且阀门控制槽330具有延伸至顶面301的阀门控制气孔331。当气道层300黏合于流道层200后，第二凹槽310会位于第一凹槽210的上方，且第一凹槽210与第二凹槽310之间隔有驱动膜240，故第二凹槽310亦称为作动控制槽，而气动式泵(未示出)可以经由驱动膜控制气孔311及第二凹槽310控制驱动膜240的上升及下压。第一凹槽210、驱动膜240、第二凹槽310及驱动膜控制气孔311形成第一驱动单元510。驱动膜240在常压下处于平衡点位置，为平坦状态(如图5a所示)，当气动式泵经由驱动膜控制气孔311施加真空吸力于第二凹槽310时，会使第二凹槽310形成负压，进而使驱动膜240上升(如图5b所示)，当气动式泵经由驱动膜控制气孔311施加气体压力于第二凹槽310时，会使第二凹槽310形成正压，进而使驱动膜240下压(如图5c所示)。当气道层300黏合于流道层200后，第二通孔320会与第一通孔220共同形成样本检测槽420。当气道层300黏合于流道层200后，阀门控制槽330会位于阀门233的上方，且气动式泵可以经由阀门控制气孔331及阀门控制槽330控制阀门233的打开及闭合。阀门233、阀门控制槽330与阀门控制气孔331形成阀门单元332。阀门233在常压下处于闭合状态(如图5a所示)，当气动式泵经由阀门控制气孔331施加真空吸力于阀门控制槽330时，会使阀门控制槽330形成负压，进而使阀门233上升而打开(如图5b所示)，当阀门控制槽330回复常压或当气动式泵经由阀门控制气孔331施加气体压力于阀门控制槽330时，阀门233下降回复闭合状态(如图5a所示)。因此，在样本检测槽420中具有液体且阀门233是打开的状态下，当驱动膜240上升时，会使样本检测槽420中的液体被吸入样本混合区410中(如图5b所示)，而当驱动膜240下压，会使样本混合区410中的液体被推出样本混合区410(如图5c所示)。
[0016]
使用于本发明的磁珠是微米级且具有磁性，在本发明的实施方案中，磁珠的直径为约4.5μm。磁珠的表面上会先涂布生物标记，生物标记可以辨认生物物质上的标靶，当磁珠上的生物标记与生物物质上的标靶接触，即生物标记会与标靶结合而使磁珠捕捉生物物质。生物物质上的标靶可以是离子、小分子化合物、多肽、蛋白质、核酸、脂类、多糖等，且生物标记可以例如是可捕捉生物物质的抗体、适体、短链胜肽类或糖类等。因此，针对要抓取的对象不同，磁珠表面上涂布的生物标记也不同。在检测时，磁珠会与生物液体样本混合形成样本混合液，并容置于样本检测槽420中。经由驱动膜240的反复上升及下压，样本混合液会反复的进出样本混合区410。当样本混合液因驱动膜240的上升而进入样本混合区410时，会产生2个漩涡，漩涡可以造成磁珠及生物物质的自旋。由于生物液体样本中的生物物质的数量非常少，且磁珠上的生物标记及生物物质上的标靶分布不一，仅是简单的混合无法让磁珠捕捉到所有的生物物质，故利用漩涡所造成的磁珠及生物物质的自旋，让磁珠与生物物质在旋转时可以增加生物标记接触标靶的机会，以提高生物物质与磁珠的结合机率。因此，在阀门233打开的状态下，将第二凹槽310反复地处于负压及正压，使驱动膜240反复地上升及下压，进而使样本混合液反复地进出样本混合区410，以利于生物物质与磁珠的结合。在本发明的实施方案中，生物液体样本为血液，生物物质微循环肿瘤细胞(ctc)，以及磁珠上包覆的生物标记是上皮细胞黏着分子(epithelial cell adhesion molecule，epcam)
的抗体。本发明的磁珠表面还会涂布亲疏水性化学物质，以降低磁珠与白血球的非特异性结合。
[0017]
气动式泵对第二凹槽310施加的真空吸力或气体压力会影响样本混合液进出样本混合区410的体积。请参阅图6，其为第一驱动单元510的压力与样本混合液的进样体积的关系图。在图6中，芯片1及芯片2的差别在于驱动膜的厚度，从图6可知，样本混合液的进样体积可以随着真空吸力或气体压力的变化而有不同的体积。因此，气动式泵可以藉由控制对第二凹槽310施加的真空吸力及气体压力而微调样本混合液进出样本混合区410的体积。本发明实施方案中，在真空吸力及气体压力为1～6
±
psi下，第一驱动单元510每次可以使230～400ml的样本混合液进出样本混合区410。
[0018]
磁珠使用量会影响生物物质的回收率。将100个肿瘤细胞分别与1～4μl磁珠混合，在本发明的微流道芯片10中混合，再经由试剂的反应后，计算肿瘤细胞的回收率，其结果如图7所示。从图7可以看出，当磁珠使用量为2μl时，有最佳的肿瘤细胞的回收率。在此磁珠使用量下，每个肿瘤细胞会吸附大约20颗磁珠(如图8所示)，可使肿瘤细胞更能被磁力固定于样本检测槽420的底部421，且在混合时不会破坏肿瘤细胞。
[0019]
生物物质的数量不影响生物物质的回收率。将50、100、200及500个尖峰细胞(spiking cell)与2μl磁珠混合，并将样本混合液容置于本发明的微流道芯片10的样本检测槽420中，第一驱动单元510将样本混合液拉入样本混合区410并停留1秒后，再将样本混合液推出样本混合区410，如此循环混合5分钟，混合完后尖峰细胞的回收结果如图9所示。从图9可以看出，50、100、200及500个尖峰细胞皆有大约80％的回收率，故本发明的微流道芯片10可以在短时间回收高量的癌细胞。
[0020]
样本混合液在第一驱动单元510与样本检测槽420之间混合的时间会影响生物物质的回收率。将100个肿瘤细胞与2μl磁珠混合，并将样本混合液容置于本发明的微流道芯片10的样本检测槽420中，第一驱动单元510将样本混合液拉入样本混合区410并停留20秒后，再将样本混合液推出样本混合区410，如此分别循环混合2.5、5、10、20、40及80分钟，混合完后肿瘤细胞的回收结果如图10所示。从图10可以看出，混合2.5～20分钟可以有80％以上的回收率，其中以混合5分钟的回收率最佳，达95％。因此，本发明的微流道芯片在短混合时间对癌细胞的回收率较高。
[0021]
再从图9～10可以看出，第一驱动单元510将样本混合液拉入样本混合区410后，在样本混合区410停留20秒的回收率会比在样本混合区410只停留1秒的回收率更好。
[0022]
本发明的微流道芯片10的流道层200及气道层300可以包括更多的凹槽、通孔及阀门以执行其他功能。例如本发明的微流道芯片10可以还包括第二驱动单元520、复数个试剂槽450a～450d(统称试剂槽450)、清洗液槽460、废液槽470及复数个阀门单元530a～530g。
[0023]
请参阅图1～4，第二驱动单元520包括在流道层200中从底面201朝向上表面202延伸的第三凹槽250及形成第三凹槽250上表面的驱动膜260、以及在气道层300中从底面302朝向顶面301延伸的第四凹槽340及从第四凹槽340延伸至顶面301的驱动膜控制气孔341。当流道层200黏合于基板100后，第三凹槽250与基板100间形成试剂混合区440。同样地，当气道层300黏合于流道层200后，第四凹槽340会位于第三凹槽250的上方，且第三凹槽250与第四凹槽340之间隔有驱动膜260，而气动式泵可以经由驱动膜控制气孔341控制驱动膜260的上升及下压。
[0024]
请参阅图1～4，复数个试剂槽450a～450d的每一个试剂槽(图1～4中以试剂槽450b为例)包括在流道层200中从底面201朝向上表面202延伸的第三通孔270、以及在气道层300中从底面302朝向顶面301延伸的第四通孔350。当流道层200黏合于基板100后，第三通孔270与基板100间形成试剂槽450的底部451。当气道层300黏合于流道层200后，第三通孔270会与第四通孔350共同形成试剂槽450。
[0025]
请参阅图1～4，清洗液槽460包括在流道层200中从底面201朝向上表面202延伸的清洗液通孔280、以及在气道层300中从底面302朝向顶面301延伸的清洗液凹槽360，清洗液凹槽360上具有供清洗液注入的开口361。当流道层200黏合于基板100后，清洗液通孔280与基板100间形成清洗液槽460的底部461。当气道层300黏合于流道层200后，清洗液凹槽360会覆盖于清洗液通孔280的上方，并与清洗液通孔280共同形成清洗液槽460。
[0026]
请参阅图1～4，废液槽470包括在流道层200中从底面201朝向上表面202延伸的废液通孔290、以及在气道层300中从底面302朝向顶面301延伸的废液凹槽370，废液凹槽370上具有废液槽气孔371。当流道层200黏合于基板100后，废液通孔290与基板100间形成废液槽470的底部471。当气道层300黏合于流道层200后，废液凹槽370会覆盖于废液通孔290的上方，并与废液通孔290共同形成废液槽470。气动式泵可以经由废液槽气孔371施加真空吸力于废液槽470，使废液槽470形成负压或真空状态。
[0027]
请参阅图1～4，样本检测槽420与第二驱动单元520之间、复数个试剂槽450a～450d与第二驱动单元520之间、样本检测槽420与废液槽470之间、以及第一驱动单元510与清洗液槽460之间皆具有阀门单元530a～530g。每一个阀门单元(图1～4中以阀门单元530f为例)的结构与第一驱动单元510及样本检测槽420之间的阀门单元332的结构相同，在流道层200中具有从底面201朝向上表面202延伸的通道凹槽531，当流道层200黏合于基板100后，通道凹槽531与基板100间形成连接槽与槽/槽与单元之间的信道532，信道凹槽531具有非凹槽部533，非凹槽部533在流道层200黏合于基板100后，不会黏合在基板100上，为未黏合区534，非凹槽部533在常压下会与基板100形成闭合状态，形成在槽与槽/槽与单元之间的阀门535；以及在气道层300中具有从底面302朝向顶面301延伸的阀门控制槽541、以及从阀门控制槽541延伸至顶面301的阀门控制气孔542，同样地，当气道层300黏合于流道层200后，阀门控制槽541会位于阀门535的上方，且气动式泵可以经由阀门控制气孔542及阀门控制槽541控制阀门535的打开及闭合。
[0028]
第二驱动单元520会与复数个试剂槽450a～450d经由其之间的通道532而连接，且第二驱动单元520会与样本检测槽420经由其之间的通道532而连接，复数个试剂槽450a～450d用于容置如酶、染色剂等反应试剂，第二驱动单元520可以藉由驱动膜260的上升及下压将复数个试剂槽450～450d中的试剂一起或分别传送至样本检测槽420中，使试剂与磁珠上的生物物质进行反应。在本发明的实施方案中，微流道芯片10具有4个试剂槽450，可以容纳至少一种试剂，但不限于4个，可以更多或更少。复数个试剂槽450a～450d的大小可以不同，以容纳需要不同体积量的试剂。同样地，气动式泵可以藉由控制对第四凹槽340施加的真空吸力及气体压力而微调试剂进入样本检测槽420的体积。在本发明的实施方案中，在真空吸力及气体压力为1～3psi的条件下，试剂槽450a每次可提供40～120μl的试剂、试剂槽450b每次可提供50～90μl的试剂、试剂槽450c每次可提供50～90μl的试剂、以及试剂槽450d每次可提供60～120μl的试剂。
[0029]
第一驱动单元510会与清洗液槽460经由其之间的通道532而连接，清洗液槽460用于容置如磷酸盐缓冲生理盐水(pbs)的清洗液，第一驱动单元510可以藉由驱动膜240的上升及下压将清洗液槽460中的清洗液传送至样本检测槽420中，以清洗样本检测槽420。样本检测槽420会与废液槽470经由其之间的通道532而连接，当废液槽470为负压状态且其之间的通道532为打开状态时，样本检测槽420中的废液会被吸入废液槽470中。
[0030]
本发明的微流道芯片为自动化的芯片，可以透过气动式泵控制驱动膜的上升及下压与阀门的打开与闭合，来自动地进行对生物液体样本进行混合、清洗、染色、排除废液等动作，以检测生物液体样本中的生物物质。
[0031]
请配合参阅图1～4及图11，利用本发明的微流道芯片10来检测生物液体样本中的生物物质的方法包括以下步骤：
[0032]
步骤601：提供本发明的微流道芯片10。
[0033]
步骤602：将磁珠与生物液体样本混合的样本混合液容置于样本检测槽420中。在本发明的实施方案中，样本混合液的注入体积为300μl。
[0034]
步骤603：经由阀门控制气孔331施加真空吸力于阀门控制槽330，使阀门控制槽330形成负压而使阀门233上升而打开。在本发明的实施方案中，将阀门233打开的真空吸力为12psi以上。
[0035]
步骤604：在阀门233打开的状态下，经由驱动膜控制气孔311施加真空吸力于第二凹槽310，使第二凹槽310形成负压而使驱动膜240上升，进而促使样本混合液进入样本混合区410中。在另一实施方案中，阀门233可以与驱动膜240同时打开及上升。
[0036]
步骤605：在阀门233打开的状态下，经由驱动膜控制气孔311施加气体压力于第二凹槽310，使第二凹槽310形成正压而使驱动膜240下压，进而促使样本混合液被推出样本混合区410。
[0037]
步骤606：反复执行步骤604及步骤605，使驱动膜240反复的上升及下压，进而使样本混合液反复进出样本混合区410，以增加生物液体样本中生物物质与磁珠的结合机率。
[0038]
步骤607：当混合完后，且样本混合液位于样本检测槽420中，先将阀门控制槽330通大气而回复常压而关闭阀门233，或经由阀门控制气孔331施加气体压力于阀门控制槽330，使阀门控制槽330形成正压而使阀门233下降而关闭阀，再提供磁场，使磁珠被磁力固定于样本检测槽420的底部421。
[0039]
步骤608：进行清洗步骤，其是将清洗液槽460中的清洗液透过驱动膜240依序的上升及下压而经由样本混合区410进入样本检测槽420，以清洗样本检测槽420，再透过废液槽470的负压将样本检测槽420中的废液吸入废液槽470中。此清洗步骤是用于清洗样本检测槽420中未被磁珠抓住的白血球及其他杂质。请配合参阅图1～4及图12，详细的清洗步骤包括：利用与步骤603相同的方式将清洗液槽460与第一驱动单元510之间的阀门535打开(步骤701)；利用驱动膜240的上升将清洗液槽460中的清洗液传送至样本混合区410中(步骤702)；关闭清洗液槽460与第一驱动单元510之间的阀门535，并打开样本检测槽420与第一驱动单元510之间的阀门233(步骤703)；利用驱动膜240的下压将样本混合区410中的清洗液传送至样本检测槽420(步骤704)，以清洗样本检测槽420；关闭样本检测槽420与第一驱动单元510之间的阀门233，并打开样本检测槽420与废液槽470之间的阀门535(步骤705)；透过废液槽470的负压将样本检测槽420中的废液吸入废液槽470中(步骤706)；以及关闭样
本检测槽420与废液槽470之间的阀门535(步骤707)。在优选实施方案中，可以多次执行步骤701～707以更完整的清洗样本检测槽420。
[0040]
步骤609：进行反应步骤，其是将复数个试剂槽450中的至少一个试剂透过驱动膜260依序的上升及下压而经由试剂混合区440进入样本检测槽420，以使至少一个试剂与生物物质反应。请配合参阅图1～4及图13，在一个实施方案中，以试剂槽450a为例，详细的反应步骤包括：利用与步骤603相同的方式将试剂槽450a与第二驱动单元520之间的阀门535打开(步骤801)；利用驱动膜260的上升将试剂槽450a中的试剂传送至试剂混合区440中(步骤802)；关闭试剂槽450a与第二驱动单元520之间的阀门535，并打开样本检测槽420与第二驱动单元520之间的阀门535(步骤803)；利用驱动膜260的下压将试剂混合区440中的试剂传送至样本检测槽420(步骤804)，以使试剂与磁珠上的生物物质反应；关闭样本检测槽420与第二驱动单元520之间的阀门535，并打开样本检测槽420与废液槽470之间的阀门535(步骤805)；透过废液槽470的负压将样本检测槽420中的废液吸入废液槽470中(步骤806)；以及关闭样本检测槽420与废液槽470之间的阀门535(步骤807)。
[0041]
步骤610：再次进行如步骤608的清洗步骤。此清洗步骤是用于清洗样本检测槽420中未与生物物质反应的试剂。
[0042]
若有1个以上的试剂，可以视需要重复步骤609～610。在本发明中，复数个试剂槽450a～450d可以根据要抓取的生物物质的种类，容置所需的试剂，且可以依需要分开或同时将试剂输送至样本检测槽420中。因此，在本发明实施方案中，当要抓取血液中的循环肿瘤细胞，复数个试剂槽450a～450d分别容置triton x-100、cd45-pe、细胞角蛋白(cytokeratin，ck)及hoechest33342试剂。执行步骤609，triton x-100会先由第二驱动单元520从试剂槽450a输送至样本检测槽420，triton x-100会增加细胞的通透性，使后续的试剂可以进入细胞中。triton x-100反应完后，将triton x-100吸入废液槽470中，并执行步骤610的清洗步骤。再执行一次或多次步骤609，以依序或同时将cd45-pe、细胞角蛋白(cytokeratin，ck)及hoechest33342从试剂槽450b～450d输送至样本检测槽420，以分别将白血球、循环肿瘤细胞及细胞核进行染色。cd45-pe、细胞角蛋白(cytokeratin，ck)及hoechest33342反应完后，将cd45-pe、细胞角蛋白(cytokeratin，ck)及hoechest33342吸入废液槽470中，并执行一次或多次步骤610的清洗步骤。在另一实施方案中，步骤610可以在每一次步骤609后执行，或是在多次步骤609后执行。
[0043]
因此，经过上述步骤601～610，被磁珠抓到的生物物质会在样品检测槽中与试剂反应而发光或呈色，利于观察、计算或进行更进一步的试验。
实施例
[0045]
将含100个肿瘤细胞的血液与2μl磁珠混合，并将样本混合液容置于本发明的微流道芯片的样本检测槽中进行混合，混合完后再经由triton x-100、cd45-pe、细胞角蛋白(cytokeratin，ck)及hoechest33342试剂的反应，以荧光显微镜观察并计算抓取纯度，荧光显微镜观察结果如图14所示。
[0046]
ck及hoechest33342有染出颜色且位置一致表示磁珠抓取到癌细胞，cd45-pe及hoechest33342有染出颜色且位置一致表示磁珠抓取到白血球。从图14的(a)～(c)可以看出，本发明的微流道芯片可以抓取到癌细胞。图14的(a)中，本发明的微流道芯片虽然有抓
取到白血球，但仅抓到少量白血球，根据纯度公式：癌细胞数/抓取总数*100％计算，本发明的微流道芯片抓取癌细胞的纯度达90％。因此，本发明的微流道芯片透过混合结构、混合方式及磁珠设计可以更专一的与癌细胞结合，增加癌细胞的回收率及纯度。
[0047]
综合上述，本发明的微流道芯片的结构可以增加磁珠与生物物质的自旋，进而增加两者的结合机会，且可以自动化地从生物液体样本中分离出生物物质(如癌细胞)，并减少误抓白血球的数量，以利于用户更准确地识别目标癌细胞。因此，本发明实现使用微流道装置及生物标记包覆的磁珠来抓取不同生物物质(如细菌、病毒、癌细胞、糖化血色素等)，来检测疾病，特别是可以用于ctc的分离和检测，以用于癌症的早期诊断和预后。
[0048]
本发明实属难能的创新发明，深具产业价值，援依法提出申请。此外，本发明可以由所属技术领域中的普通技术人员做任何修改，但不脱离如所附申请专利范围所要保护的范围。【附图标记说明】
[0049]
10:微流道芯片20:芯片本体100:基板200:流道层201:底面202:上表面210:第一凹槽220:第一通孔230:通道凹槽231:非凹槽部232:未黏合区233:阀门240:驱动膜250:第三凹槽260:驱动膜270:第三通孔280:清洗液通孔290:废液通孔300:气道层301:顶面302:底面310:第二凹槽311:驱动膜控制气孔320:第二通孔330:阀门控制槽331:阀门控制气孔332:阀门单元
340:第四凹槽341:驱动膜控制气孔350:第四通孔360:清洗液凹槽361:开口370:废液凹槽371:废液槽气孔410:样本混合区420:样本检测槽421:底部430:通道440:试剂混合区450:试剂槽450a～450d:试剂槽451:底部460:清洗液槽461:底部470:废液槽471:底部510:第一驱动单元520:第二驱动单元530a～530g:阀门单元531:通道凹槽532:通道533:非凹槽部534:未黏合区535:阀门541:阀门控制槽542:阀门控制气孔s601-s610:步骤s701-s707:步骤s801-s807:步骤