POGLUT3作为胃肠道疾病生物标志物及其应用的制作方法

poglut3作为胃肠道疾病生物标志物及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及poglut3作为胃肠道疾病生物标志物及其应用。


背景技术：

2.胃肠道疾病，包括感染性胃肠道疾病和非感染性胃肠道疾病，是多种消化道炎症性疾病的总称。感染性胃肠道疾病包括细菌性肠炎、病毒性肠炎等；非感染性胃肠道疾病按照不同的分类角度，包括例如炎症性胃肠道疾病(例如炎症性肠病(inflammatory bowel disease,简称ibd)、过敏性胃肠道疾病(例如食物过敏性以及由此导致的胃肠道疾病如食物蛋白诱导的小肠结肠炎综合征，食物蛋白诱导的肠病，嗜酸性粒细胞食管炎，嗜酸性粒细胞性胃肠炎等)、和功能性胃肠道疾病(如脑肠互动异常导致的儿童功能性胃肠道疾病)等。上述胃肠道疾病可以影响包括婴幼儿在内的各个年龄阶段的人群，临床表现为反复的腹痛腹胀、呕血便血、腹泻便秘、食欲降低、营养不良、及各种全身并发症，严重时导致死亡的发生。
3.其中，炎症性肠病,是一组特定的肠道慢性疾病的统称，包括例如未分化(或未定性、或未定型)的结肠炎(undifferentiated colitis)、克罗恩病(crohn’s disease，简称cd)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，简称uc)的发病率在世界范围内逐年上升，而儿童中的炎症性肠病(pibd)，由于严重影响到儿童的生长发育和身体健康，越发被重视，其可造成组织损伤和胃肠道结构和功能的长期损伤，且通常是不可逆的。据统计，截至2015年，约有1.12亿人受到克罗恩氏病与溃疡性结肠炎的影响，此疾病在北美和欧洲更常见(disease g,b.d.et al.,2016,lancet 388,1545-602)。2018年初，发表于lancet的系统综述指出，欧洲和北美国家ibd的发病率趋于稳定，但由于发病率超过了0.3％，其疾病负担高，严重降低患者生活质量；同时，非洲、亚洲及南美一些新兴工业化国家ibd的患病率逐渐增高(disease,g.et al.,2018,lancet 392,1789-858)。
4.然而，炎症性肠病的病因并不明确，相关致病机理理论有饮食习惯、自身免疫病、遗传易感、肠道粘膜系统或菌群的改变、环境或炎症因素等。
5.其中，对于遗传易感，多个基因被证实与ibd的易感性相关，包括1.细菌识别相关易感基因，有nod2/card15、toll样受体4(tlr4)等(kennedy,n.a.et al.,2018,inflammatory bowel diseases24,583-92)；2.自噬相关的易感基因(hoefkens,e.et al.,2013,autophagy 9,2046-55)：atg16l1(murthy,a.et al.,2014,nature 506,456-62)、irgm(brest,p.et al.,2011,nature genetics 43,242-5)等；3.il-23/th17(brand,s.,2009,gut 58,1152-67)信号途径相关易感基因：il23r(momozawa,y.et al.,2011,nature genetics 43,43-7)、tnfsf15(richard,a.c.et al.,2018,plos genetics 14,e1007458)等；4.上皮屏障相关的易感基因：hnf4a(consortium,u.i.g.et al.,2009,nature genetics41,1330-4)等。这些易感基因不仅影响ibd患病风险，也与临床分型诊断、药物治疗效果相关。
6.对于肠道粘膜系统或菌群环境，机体的胃肠道粘膜持续暴露于大量的食物抗原和复杂多样的肠道微生物的刺激之下，因此完整有效的肠道粘膜系统对于维持机体的健康非常重要。肠道粘膜系统根据结构和定位大体分为以下3个部分：第1部分是位于肠腔内的共生微生物群，包括细菌、真菌、病毒和寄生虫等，它们通过代谢不能吸收的食物组分及产生维生素、短链脂肪酸等物质促进机体生长。同时阻止致病菌的定植，保护机体不被疾病困扰(ley r,e.et al.,2008,science 320,1647-51)。第2部分是肠上皮及其分泌的黏液层所构成的上皮屏障。黏液层主要是由肠上皮内的杯状细胞分泌的粘液素构成。它将大量的肠道细菌与肠上皮隔离开(johansson,m.et al.,2008,proceedings of the national academy of sciences of the united states of america 105,15064-9)。黏液层下方则是紧密连接在一起的肠上皮各群细胞，包括杯状细胞、潘氏细胞、吸收性肠细胞和肠内分泌细胞。肠细胞行使消化功能，肠内分泌细胞分泌激素调节消化功能。这些上皮细胞通过紧密连接排列，与黏液层一起构成理化屏障将肠腔内的细菌与宿主隔离开，防止其损伤上皮细胞或激活免疫细胞。除了屏障功能，肠上皮还可以通过感知细菌信号和介导免疫调节功能，维持肠道粘膜稳态(yang,z.,et al.,2007,gastroenterology 133,1510-1521；kim,h.s.et al.,2013,gastroenterology 145,1392-1403)。第3部分为粘膜固有层内的各群固有免疫细胞和适应性免疫细胞以及肠上皮内淋巴细胞。这些免疫细胞通过精确调节免疫反应，保持对肠道共生菌和食物抗原的耐受状态，同时针对病原微生物仍能产生快速有效的应答。其中固有免疫细胞包括固有淋巴细胞、中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞。这些细胞可以通过分泌炎性细胞因子和炎性趋化因子介导炎症反应清除入侵的微生物(farache,j.et al.,2013,immunity 38,581-95；coombes,j.et al.,2008,nature review immunology 8,435-46；zheng,y.et al.,2008,nature medicine 14,282-9；qiu,j.et al.,2012,immunity 36,92-104)。
7.对于炎症的方面，当上皮屏障完整性被破坏，肠道菌群可以从肠腔入侵到肠道组织，上皮细胞可以分泌大量促炎介质和募集免疫细胞。此时，肠道功能失调，导致营养物质和水的吸收功能减弱，产生黏膜炎症，最后导致疾病发生。如果这种炎症状态持续发生，可导致损伤修复功能失调，最后引发炎症性肠病甚至向癌症转化，其中以肠道、肝脏和胆管癌风险为最高,也有血癌和皮肤癌等其他癌症风险。综上所述，肠道共生菌通过肠上皮细胞直接或间接调节黏膜免疫反应，黏膜免疫系统通过肠上皮细胞调节菌群稳态，因此，在肠道黏膜系统的3个组分中，肠上皮是关键(pott,j.et al.,2012,embo rep 13:684-98)。通常，ibd的病理表现为黏液层或上皮屏障的破损，导致上皮细胞与肠道微生物的直接接触从而触发免疫反应。notch信号通路对肠道上皮屏障的正常发育至关重要。notch信号途径主要有两个作用：1、维持肠道干细胞干性；2、在细胞分化中，高notch前体细胞将分化为吸收型肠细胞(absorptive)，而低notch前体细胞将被相邻的高notch细胞驱动并分化为分泌型肠细胞(secretory)，该过程被称为侧向抑制(lateral inhibition)，该模式促进前体细胞单方向分化，调控分泌型和吸收型上皮细胞的平衡。由于notch信号通路在肠道干细胞干性维持以及上皮细胞的分化上都起到重要作用，因此其调控影响到机体对炎症的敏感性和损伤修复的能力，notch信号通路中关键分子的突变或缺失都将影响到分泌型上皮细胞的数量和功能，从而导致上皮屏障的完整性被破坏，最终引起炎症反应。
8.前文提及，如果炎症状态持续发生，可引发炎症性肠病甚至向癌症转化，其中，尤
其是长期的慢性的炎症性肠病会更容易导致结肠上皮细胞转化为结肠腺癌细胞，从而导致结直肠癌，而结直肠癌是一种适合于筛查的恶性疾病，早期诊断、早期治疗可从总体上提高其5年生存率。因此，针对ibd的诊断和/或治疗方法，也可从炎症性肠病的诊疗方法中得到借鉴。
9.治疗ibd患者的主要目标为控制疾病活动，达到缓解状态，次要目标是保持这种缓解状态，然而截止目前，仍没有能够彻底治愈ibd的药物，一般均是应用糖皮质激素、免疫抑制剂及生物制剂等抑制炎症反应。这些药物长期服用，可能导致影响脏器功能的毒副作用，感染风险增加，以及可能诱发如淋巴瘤等恶性肿瘤的风险。特别是对于儿童患者来说，这些风险对处于生长发育期的儿童影响尤其显著。
10.综上，ibd、过敏性胃肠道疾病、结直肠癌等胃肠道疾病的病因目前并不十分明确，所以，新的发病机理的发现，包括进一步探究其他与ibd易感性相关的单基因，以及早期的筛查和治疗，将有助于我们了解胃肠道疾病的发生发展，以开发药物和提出新的治疗方案，治愈疾病。目前未见poglut3基因与ibd等胃肠道疾病相关的报道。
11.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

12.本发明的第一目的在于提供检测poglut3基因或poglut3蛋白的试剂在制备诊断胃肠道疾病的产品中的应用。
13.本发明的第二目的在于提供一种胃肠道疾病的生物标志物。
14.本发明的第三目的在于提供一种胃肠道疾病的诊断引物和/或检测探针。
15.本发明的第四目的在于提供一种用于诊断胃肠道疾病的试剂盒。
16.本发明的第五目的在于提供降低poglut3基因或其蛋白表达的试剂在制备预防和/或治疗胃肠道疾病的药物中的用途。
17.为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
18.检测poglut3基因或poglut3蛋白的试剂在制备诊断胃肠道疾病的产品中的应用；
19.其中，所述产品包括试剂盒、诊断试剂、检测试剂、基因芯片或蛋白质芯片；
20.进一步地，所述poglut3基因或poglut3蛋白表达水平升高，则诊断为胃肠道疾病；
21.进一步地，所述poglut3基因带有955c》t突变和/或848t》g突变，或所述poglut3蛋白带有l283》r突变和/或r319*突变，其中*为终止密码子，则诊断为胃肠道疾病阳性。
22.一种胃肠道疾病的生物标志物，所述生物标志物为突变的poglut3基因或poglut3蛋白，所述突变使得poglut3基因或poglut3蛋白的表达水平升高；
23.进一步地，所述突变为带有955c》t和/或848t》g突变的poglut3基因，或所述突变为带有l283》r突变和/或r319*突变的poglut3蛋白，其中*为终止密码子。
24.一种胃肠道疾病的诊断引物和/或检测探针，所述引物为能够扩增poglut3基因的序列，所述检测探针为能够检测poglut3基因的955c》t和/或848t》g突变的探针；
25.进一步地，所述引物为能够扩增覆盖poglut3基因的955c》t和/或848t》g突变的引物；
26.进一步地，引物序列如seq id no.1和seq id no.2所示：
27.poglut3-f：5'gaagcctgctatcttgggatt 3'(seq id no.1)；
28.poglut3-r：5'caacgacacccactgaaataga 3'(seq id no.2)。
29.一种用于诊断胃肠道疾病的试剂盒，含有上述诊断引物和/或检测探针；和/或还含有样品的处理试剂，包括但不限于样品裂解试剂、样品纯化试剂和/或样品核酸提取试剂；和/或还含有dna提取试剂、dntp、dna聚合酶、双链特异性荧光染料以及水中的一种或多种。
30.降低poglut3基因或其蛋白表达的试剂在制备预防和/或治疗胃肠道疾病的药物中的用途。
31.上述应用、生物标志物、诊断引物、试剂盒或用途，所述胃肠道疾病为感染性胃肠道疾病或非感染性胃肠道疾病；所述感染性胃肠道疾病优选为细菌性肠炎；所述非感染性胃肠道疾病为炎症性肠病、过敏性胃肠道疾病、功能性胃肠道疾病和/或结直肠癌；所述炎症性肠病为结肠炎，优选为未定性的结肠炎、溃疡性结肠炎或克罗恩病；所述过敏性胃肠道疾病为嗜酸性粒细胞引起的，包括食物过敏相关的食管炎和胃肠炎。上述应用或试剂盒，产品的检测样本或试剂盒的受试样本包括来自待测对象的血液、体液、尿液、组织和细胞样品中的一种或多种，优选外周血或结肠粘膜组织。
32.上述应用、生物标志物、诊断引物和/或检测探针、试剂盒或用途，样本来自的待测对象或用药对象为成人或儿童，优选为儿童。
33.上述应用、生物标志物、诊断引物和/或检测探针、或试剂盒，所述试剂、生物标志物、诊断引物和/或检测探针、或试剂盒，是用于执行以下检测方法中的一种或多种：聚合酶链反应、微数字聚合酶链反应、荧光聚合酶链反应、环介导等温扩增反应、核苷酸或氨基酸序列测序法、变性梯度凝胶电泳、核酸分型芯片检测、高效液相色谱法、原位杂交、生物质谱法、高分辨率溶解曲线分析、单链构象异构多态分析或探针扩增阻滞突变系统分析。
34.上述用途，所述降低poglut3基因或其蛋白表达的试剂包括如下任一种：
35.(a)靶向结合poglut3基因或蛋白的药物，包括小分子化学药物、多肽、蛋白质、抗体或聚糖药物；
36.(b)干扰或沉默poglut3的核酸分子，包括能够靶向poglut3基因全长或截短序列的sirna、shrna或sgrna。
37.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
38.发明人通过研究发现，患者带有的poglut3基因罕见突变955c》t和/或848t》g(相应的蛋白突变为poglut3蛋白带有l283》r突变和/或r319位发生终止突变)，导致poglut3基因表达与健康人群相比，显著升高，是胃肠道疾病的又一单基因突变致病因素；敲低或敲除poglut3基因的表达，使得结肠炎动物模型的疾病症状减轻、恢复时间缩短、有利于体内抗菌肽的表达、增加微生物的多样性、有效地抑制细菌性肠炎的发生或发展，并且进一步验证了notch信号通路在结肠炎患者结肠组织中普遍异常激活，同时验证了poglut3及其突变与notch信号通路活化相关。所以，poglut3基因或其蛋白，可以作为包括ibd、细菌性肠炎、过敏性胃肠道疾病、结直肠癌等胃肠道疾病的生物标志物用于预防、诊断或治疗。上述发现为胃肠道疾病的发病机理提供了新的理论基础，该poglut3或突变表型亦可作为胃肠道疾病的生物标志物，用于早期筛查与预防。本发明的技术方案也为胃肠道疾病的治疗提供了新的方向和治疗靶点。
附图说明
39.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
40.图1为实施例1中儿童ibd样本存在notch信号通路激活的检测结果；
41.图2为实施例2中ibd患儿发现poglut3罕见突变的检测结果；
42.图3为实施例3中poglut3罕见突变伴随notch信号通路激活的检测结果；
43.图4为实施例4中poglut3在人结肠上皮细胞系和小鼠各组织的表达谱；
44.图5为实施例5中poglut3上皮特异性缺失的小鼠dss模型的检测结果；
45.图6为实施例6中rnaseq检测poglut3上皮特异性缺失的小鼠肠道抗菌肽检测结果；
46.图7a为实施例7造模方案；
47.图7b为实施例7模型各时间点两种基因型小鼠的结肠长度；
48.图7c为实施例7模型各时间点两种基因型小鼠的结肠病理表现；
49.图7d为实施例7模型各时间点两种基因型小鼠的肠道微生物的主坐标分析；
50.图7e为实施例7恢复阶段poglut3
fl/fl villin-cre

小鼠结肠较poglut3
fl/fl villin-cre-小鼠结肠微生物多样性高；
51.图7f为实施例7门(phylum)水平上各时间点两种基因型小鼠的肠道微生物的分布；
52.图7g为实施例7在科(family)水平上各时间点两种基因型小鼠的肠道微生物的分布；
53.图8a为实施例8中模型的体重变化；
54.图8b为实施例8中模型第14天结肠组织病理染色结果；
55.图8c为实施例8中模型第14天结肠组织流式细胞术检测结果；
56.图8d为实施例8中模型第14天结肠组织流式细胞术检测结果统计图；
57.图9为实施例9中poglut3在肠道上皮细胞表达情况和在分泌型上皮分化进程中的表达检测结果。
具体实施方式
58.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
59.除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
60.发明人通过研究发现，患者带有的poglut3基因罕见突变955c》t和/或848t》g(相应的蛋白突变为poglut3蛋白带有l283》r突变和/或r319位发生终止突变)，导致poglut3基因表达与健康人群相比，显著升高，是ibd、结直肠癌等胃肠道疾病的又一单基因突变致病因素；敲低或敲除poglut3基因的表达，使得结肠炎动物模型的疾病症状减轻、恢复时间缩
短、有利于体内抗菌肽的表达、增加微生物的多样性；同时，通过poglut3上皮特异性缺失实验，证明了poglut3基因或蛋白的表达降低，可以提高小鼠对致病细菌的抵抗能力、降低炎症反应以及减少嗜酸性粒细胞浸润，从而发现了poglut3是细菌性肠炎、嗜酸性粒细胞引起的胃肠道疾病(包括食物过敏相关的食管炎和胃肠炎)治疗中的有效靶点；在上述基础上，本发明还验证了notch信号通路在结肠炎患者结肠组织中普遍异常激活，同时验证了poglut3及其突变与notch信号通路活化相关。
61.基于上述研究内容，本发明提供检测poglut3基因或poglut3蛋白的试剂在制备诊断胃肠道疾病的产品中的应用，其中，所述产品包括试剂盒、诊断试剂、检测试剂、基因芯片或蛋白质芯片。
62.需要说明的是，poglut3及其蛋白的高表达会导致胃肠道疾病的发生或加重，检测试剂无论是从蛋白水平还是从转录水平来体现含量均可用于胃肠道疾病的诊断，预防和治疗。
63.本发明中，胃肠道疾病是指感染性胃肠道疾病或非感染性胃肠道疾病；感染性胃肠道疾病优选为细菌性肠炎；非感染性胃肠道疾病为炎症性肠病、过敏性胃肠道疾病、功能性胃肠道疾病和/或结直肠癌；所述炎症性肠病为结肠炎，优选为未定性的结肠炎、溃疡性结肠炎或克罗恩病；所述过敏性胃肠道疾病为嗜酸性粒细胞引起的，包括食物过敏相关的食管炎和胃肠炎。
64.本发明中，检测poglut3基因或poglut3蛋白表达水平的样本可以为待测对象的血液、体液、尿液、组织和细胞样品中的一种或多种，优选外周血或结肠粘膜组织。此外，待测对象为成人或儿童，优选为儿童。
65.本发明中，检测手段包括聚合酶链反应、微数字聚合酶链反应、荧光聚合酶链反应、环介导等温扩增反应、核苷酸或氨基酸序列测序法、变性梯度凝胶电泳、核酸分型芯片检测、高效液相色谱法、原位杂交、生物质谱法、高分辨率溶解曲线分析、单链构象异构多态分析或探针扩增阻滞突变系统分析等。在优选地实施方式中，当poglut3基因或poglut3蛋白表达水平升高，则诊断为胃肠道疾病。
66.在优选地实施方式中，poglut3基因带有955c》t突变和/或848t》g突变，或poglut3蛋白带有l283》r突变和/或r319*突变，其中*为终止密码子，则诊断为胃肠道疾病阳性。
67.本发明中，poglut3基因序列包括但不限于seq id no:21所示的序列，其中，“poglut3基因的955c》t突变”为seq id no:21所示序列第955位的c突变为t，“poglut3基因的848t》g突变”为seq id no:21所示序列第848位的t突变为g。
68.poglut3蛋白序列包括但不限于如seq id no:22所示，其中，“poglut3蛋白的l283》r突变”为seq id no:22所示序列第283位的l突变为r，“poglut3蛋白的r319*突变”突变为seq id no:22所示序列第319位的r突变为终止密码子(stopgain，意为后续终止了不翻译了)。
69.此外，核苷酸序列的突变表示中涉及的单字母缩写与本领域的核苷酸缩写所代表的含义相同，即，“a”、“t”、“g”、“c”、“u”分别代表：腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶。
70.对于本发明说明书和权利要求书中，提及的基因或核苷酸序列，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条，及其可反推成相应的氨基酸序列或蛋
白序列。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链，同时也公开了相应的氨基酸序列或蛋白序列。例如提及poglut3基因的mrna序列，实际上包括该序列以及其互补序列，以及相应的翻译成氨基酸或蛋白的序列。例如，提及seq id no:3，实际包括其互补的核苷酸序列，也包括其对应的翻译后的氨基酸序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然；本技术中的基因序列包括rna形式或dna形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。例如提及poglut3基因的mrna序列，实际也包括相应的cdna序列；此外，为了检测前述基因突变，可以设计能够扩增整个基因的检测引物和/或探针，也可以在突变所在位置前后设计检测引物和/或探针。
71.本发明提供一种胃肠道疾病的生物标志物，该生物标志物为突变的poglut3基因或poglut3蛋白，突变使得poglut3基因或poglut3蛋白的表达水平升高。
72.在优选的实施方式中，突变为带有955c》t和/或848t》g突变的poglut3基因，或为带有l283》r突变和/或r319*突变的poglut3蛋白，其中*为终止密码子。
73.上述技术方案在细胞和分子水平上提供了胃肠道疾病的生物标志物，不仅为胃肠道疾病的发病机理提供了新的理论基础，也为胃肠道疾病的治疗提供了新的方向和治疗靶点，有利于改善该类疾病(肠道炎症、肠道应激性反应、肠道癌症发生发展、免疫调节和肠道微生物调控、感染疾病、过敏疾病、炎症反应、移植排斥、自身免疫病等疾病)的临床诊疗现状，降低家庭和社会的医疗负担，促进社会和谐发展。
74.同时，本发明提供一种胃肠道疾病的诊断引物和/或检测探针，该引物为能够扩增poglut3基因的序列，检测探针为能够检测poglut3基因的955c》t和/或848t》g突变的探针。
75.在优选的实施方式中，引物为能够扩增覆盖poglut3基因的955c》t和/或848t》g突变的引物。进一步优选为如下的引物对：
76.poglut3-f：5'gaagcctgctatcttgggatt 3'(seq id no.1)；
77.poglut3-r：5'caacgacacccactgaaataga 3'(seq id no.2)。
78.本发明还提供一种用于诊断胃肠道疾病的试剂盒，含有上述诊断引物和/或检测探针。
79.该试剂盒还可以含有样品的处理试剂，包括但不限于样品裂解试剂、样品纯化试剂和/或样品核酸提取试剂。同时，该试剂盒还可以含有dna提取试剂、dntp、dna聚合酶、双链特异性荧光染料以及水中的一种或多种。
80.本发明最后提供降低poglut3基因或其蛋白表达的试剂在制备预防和/或治疗胃肠道疾病的药物中的用途。
81.需要说明的是，该药物的用药对象为成人或儿童，优选为儿童。
82.在优选地实施方式中，降低poglut3基因或其蛋白表达的试剂包括如下任一种：
83.(a)靶向结合poglut3基因或蛋白的药物，包括小分子药物或抗体药物；
84.(b)干扰或沉默poglut3的核酸分子，包括能够靶向poglut3基因全长或截短序列的sirna、shrna或sgrna。
85.下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
86.实施例1 pibd患儿及对照儿童的单细胞测序和生物信息学分析
87.i.研究方案：
88.(1)获取对照和非感染性胃肠道疾病儿童结肠粘膜组织，获得单细胞悬液；
89.(2)经表面染色后，用流式细胞分选t、b、非tb淋巴细胞、以及非淋巴细胞四个亚群；
90.(3)各细胞亚群进行单细胞转录组分析；
91.(4)单细胞测序结果，分析免疫细胞亚群的聚类特征，建立结肠粘膜免疫细胞的组成与转录特征；
92.(5)通过信号通路富集分析，确定细胞亚群特异的功能特征。鉴定细胞类型特异性高表达的转录因子，通过与基因表达水平的关联分析，建立转录因子调控网络；将非感染性胃肠道疾病易感基因与单细胞测序获得的免疫细胞亚型的转录特征对应，确立易感基因影响的免疫和非免疫细胞亚型。
93.ii.实验方法
94.(1)临床样本(结肠粘膜和外周血)的采集。
95.通过结肠镜采集患有非感染性胃肠道疾病(溃疡性结肠炎、克罗恩病、未定性的结肠炎100例)的儿童，以及28例对照儿童的结肠粘膜。每个入组的儿童采集回盲部，升，横，降，乙状结肠和直肠粘膜各一块(大约1mm
×
1mm
×
3mm)；同时采集相应儿童的抗凝外周血(大约3ml)待用。上述采集过程已通过广州市妇女儿童医疗中心的临床研究伦理审查。以是需要进行结肠息肉切除的，肠镜和病理表现均正常的儿童作为对照儿童。
96.(2)结肠粘膜单细胞的提取。
97.用小剪刀将结肠粘膜剪碎，然后将组织转入装有6ml消化液(rpmi1640含10％胎牛血清白蛋白 10mm hepes 100u/ml青霉素 100μg/ml链霉素 1mg/ml胶原酶1a 10u/ml脱氧核糖核酸酶)的离心管中，水平震荡(180rpm，30分钟，37℃)，再利用70μm滤网过滤，离心(900g，5分钟)，收集沉淀待用。
98.(3)t细胞的表型分析。
99.经(2)处理后的细胞浸于60μl流式抗体溶液中孵育(20分钟，冰上)，然后用facs buffer(pbs 2％胎牛血清白蛋白 1mm edta)清洗1次，最终将细胞置于facs buffer(含1％pi)中，上流式细胞仪检测。
100.(4)单细胞分选和5’,3’转录组建库。
101.拟采集结肠粘膜和按照本节方法(2)提取结肠粘膜的单细胞，并孵育抗体(cd19-apc,cd45-apc-cy7,cd3-fitc)后通过流式细胞仪分选至事先孵育了pbs(含5％fbs)的ep管中，具体分选和建库测序策略见下表1。
102.表1分选、建库和测序策略
103.分选细胞类型分选细胞策略单细胞分析策略t淋巴细胞pi-，cd45

，cd3

,5’转录组测序 tcr测序b淋巴细胞pi-，cd45

，cd3-，cd19
5’
转录组测序 bcr测序非t非b淋巴细胞pi-，cd45

，cd3-，cd19-5’转录组测序 bcr测序cd45-细胞(肠粘膜)pi-，cd45-5’转录组测序
104.所得细胞采用台盼蓝进行活细胞计数，然后利用10
×
genomic chroimium single cell 5’建库试剂盒进行单细胞文库构建。具体而言，根据试剂盒说明书操作，将单细胞悬
液与rt-pcr master mix混合，然后同时加载纳米级交联微球和分离油到专门的单细胞处理芯片上。接着，将添加了特定标签的每个单细胞中的rna进行反转录，并对产生的cdna进行纯化，扩增，末端修复和并加上illumina特定的接头，至此成功构建成单细胞转录组文库。同时，在此基础上，利用chromium single cell v(d)j建库试剂盒扩增tcr和bcr的文库。最终，上述文库采用illumina x ten进行测序。
105.iii.试验结果
106.目前，notch信号通路在ibd中的研究有限。通过收集ibd患儿结肠镜活检组织进行单细胞测序，结果发现，notch信号通路相关分子notch1、dll1、dll4、hes1在ibd患儿的上皮细胞中的表达均显著上调(图1的a图和b图)，其中，a图表示收取ibd儿童患者(包括未定性的结肠炎、uc、cd)和对照儿童结肠粘膜进行单细胞测序的结果，分析得到notch信号通路相关分子在ibd患儿的分泌型上皮细胞中表达上调，b图表示表达量的定量分析结果(p＜0.01)。图1的c图的免疫荧光结果提示notch的切割活化形式nicd在cd、uc以及其它未定性的炎症性肠病(colitis)的肠道上皮细胞显著上调，并伴随分泌型上皮细胞杯状细胞(muc2

)数量的减少，与单细胞测序结果一致,说明notch信号通路在ibd患儿结肠组织异常激活，这一表型在ibd中普遍存在。
107.实施例2 ibd患儿发现poglut3罕见突变
108.(一)实验方法
109.突变位点验证：病人全血速冻于-80℃，干冰保存运送至华大基因进行sanger测序验证突变位点。
110.苏木精和伊红(h&e)染色：取动物组织固定于4％多聚甲醛(pfa)固定24h，依次浸入50％、60％、70％、80％、90％和100％乙醇脱水，2次二甲苯透明，石蜡包埋，制4μm切片。60℃烤片后，石蜡切片依次经过2次二甲苯，每次15min脱蜡，依次经过2次100％和70％乙醇复水，蒸馏水浸洗2次。苏木素室温染色6min，流水洗去浮色。1％盐酸酒精分色3s，置于自来水中，流水返蓝5min。伊红染色3min，依次经过2次70％、100％乙醇脱水，经过2次二甲苯透明，中性树脂封片。镜检。
111.(二)实验结果
112.通过对儿童ibd队列样品进行全外显子分析，我们在一位从2月龄开始发病的男性ibd患儿中发现了基因poglut3产生的955c》t/848t》g突变(rs759766572)。患者结肠镜检查显示，病人粘膜充血水肿，所见降结肠、乙状结肠、直肠等各段粘膜弥漫性充血糜烂，伴大小不等溃疡灶覆白苔，粘膜质脆易出血，镜检诊断为极早发糜烂溃疡性结肠炎(图2的a图)。病理检测显示，胃粘膜呈中度慢性炎伴糜烂，轻度活动性；十二指肠粘膜呈中度慢性炎；回肠肠壁组织重度糜烂伴灶性出血；降结肠大部糜烂，间质水肿，少量淋巴细胞、浆细胞及个别嗜酸粒细胞浸润，散在点状出血(图2的b图)。进一步对患儿家系进行测序分析，结果发现，患儿poglut3 955c》t突变从其父亲处遗传得到，848t》g突变从其母亲处遗传得到，患儿为基因poglut3复合杂合突变(图2的c图)，因此，提示了不管是poglut3 955c》t突变还是848t》g突变，均是ibd和/或结直肠癌的易感和危险因素。
113.实施例3 poglut3罕见突变伴随notch信号通路激活
114.为了研究ibd的poglut3罕见突变与notch信号通路激活之间是否存在相关性，进一步做了如下实验。
115.(一)实验方法
116.免疫荧光分析：新鲜组织活检样本固定于4％多聚甲醛(pfa)固定24h，依次浸入50％、60％、70％、80％、90％和100％乙醇脱水，2次二甲苯透明，石蜡包埋，制4μm切片。60℃烤片后，石蜡切片依次经过2次二甲苯，每次15分钟脱蜡，依次经过2次100％和70％乙醇复水，蒸馏水浸洗2次。切片水化后置于磷酸盐缓冲液中。使用酸性抗原修复液(10mm枸橼酸钠，ph 6.0)进行高压修复。使修复液自然冷却至室温后磷酸盐缓冲液洗涤3次，各5分钟。3％过氧化氢甲醇溶液室温避光10分钟，去除内源性过氧化氢酶。磷酸盐缓冲液洗3次，每次5分钟。使用10％羊血清室温封闭1小时。将识别人nicd(1：100，ab52627，abcam)和muc2(1：200，ab272692，abcam)的兔多抗稀释于封闭液中，4℃封闭过夜。切片室温复温30分钟，磷酸盐缓冲液洗3次，每次5分钟。二抗稀释于封闭液中，室温孵育1小时，磷酸盐缓冲液洗3次，每次5分钟。加荧光二抗(1：1000，抗山羊igg-alexa fluor 568，a-11079，invitrogen；1：1000，抗兔igg-alexa fluor 488，a-32731，invitrogen)室温孵育1小时，磷酸盐缓冲液洗3次，每次5分钟。最后加含dapi封片剂封片。图像使用莱卡全自动正置荧光显微镜dm6采集(20
×
0.75)。
117.(二)实验结果
118.955c》t/848t》g突变使poglut3表达水平升高，对患儿以及健康对照组的结肠切片进行免疫荧光分析，我们发现存在突变的患儿体内poglut3蛋白水平显著高于健康组(图3的a图)。通过免疫荧光检测患儿肠道组织，发现其肠道结构紊乱，ki67

细胞分布散在而且数量增加，失去正常的腺腔结构(图3的b图)。由于poglut3与notch信号通路活化相关，因此我们检测了患儿肠道组织notch1及其活化形式nicd的水平，结果表明notch1及nicd均上调，提示患儿肠道上皮存在notch信号通路的异常活化(图3的c图和d图)。
119.实施例4 poglut3在胃、结肠上皮等消化道中表达
120.为了研究poglut3是否能够作为胃肠道疾病的基因或蛋白靶点，本实施例进一步研究poglut3在胃肠道中的表达情况。
121.(一)实验方法
122.实时定量聚合酶链反应(real-time pcr)：人结肠上皮细胞系ncm460、caco-2、hct116和ht29以及人成纤维细胞系ccd18购自atcc并在本实验室传代培养。从广州中医药大学购买6周龄黑色雄性小鼠(c57bl/6，小鼠)。购买的小鼠在鼠笼里进行饲养，在该鼠笼内有供应适当的食物和水，温度维持在20～24℃，湿度保持在40～70％。此外，在12/12光暗周期(上午八点开灯，下午八点关灯)内保管这些野生型的小鼠。所有实验被设计成均使用最少数量的小鼠，根据动物实验伦理，实施了麻醉方法，以最大程度降低实验中所用的小鼠的痛苦。小鼠麻醉后心脏灌注，取小鼠各器官。新鲜小鼠组织或细胞浸没于rnalater(thermo fisher scientific，waltham，ma)里，4℃固定过夜后，使用rneasy mini kit(qiagen，germantown，md)依照说明书提取组织rna。经定量后取相同总量rna(2μg)使用all-in-one rt matermix(applied biological materials inc.，richmond，canada)反转录成互补dna(cdna)。以人poglut3上游f(5'gaagcctgctatcttgggatt 3'，seq id no.1)，下游r(5'caacgacacccactgaaataga3'，seq id no.2)，notch1上游f(5'atgtgttctcggagtgtgtatg 3'，seq id no.3)，下游r(5'agggaccaagaacttgtataacc 3'，seq id no.4)，notch2上游f(5'cagaatggaggttcctgtatgg 3'，seq id no.5)，下游r(5'tcatgtctgtctggcacttatc3'，
seq id no.6)，notch3上游f(5'gttggtctgtgtctaggtaagg 3'，seq id no.7)，下游r(5'ccaagatgggagctcaagtta 3'，seq id no.8)，小鼠poglut3上游f(5'ggtcctcaagcaggagtcac 3'，seq id no.9)，下游r(5'actgcccttctttcgcaatct 3'，seq id no.10)，gapdh上游f(5'atcaagaaggtggtgaagca 3'，seq id no.11)，下游r(5'agacaacctggtcctcagtgt 3'，seq id no.12)为引物，进行实时定量聚合酶链反应(real-time pcr)扩增40轮。
123.蛋白质免疫印记：组织或细胞使用含蛋白酶抑制剂(磷酸化检测还需加入磷酸酶抑制剂，sigma-aldrich，ma)的ripa lysis buffer(invitrogen，san diego，ca)冰上裂解30分钟，超声后离心取上清液。蛋白经bca定量后，取相同量，加入novex
tm
tricine sds sample buffer(invitrogen，san diego，ca，含50mm dtt)，补齐体积后99℃煮样10分钟。上样至10％sds-page(invitrogen，san diego，ca)，120v，90分钟电泳。pvdf膜预先用甲醇活化，正确组装转膜装置，170ma，90分钟转膜，冰浴。转膜完成后，pvdf膜用5％bsa(w/v，tbst配制)室温封闭1小时。识别小鼠fam3d一抗(200ng/ml，af3027，r&d，封闭液配制)4℃过夜。tbst清洗3次，每次5分钟，二抗(tbst配制)室温孵育1小时。使用ecl显影液super signal chemiluminescent substrate(pierce，rockford，il)和膜孵育3分钟，在g:box gel doc system(syngene,frederick,md)显影。光密度分析使用image j analysis program(nih，besthesda，usa)。
124.(二)实验结果
125.图4中a图表示poglut3在各人结肠上皮细胞系中高表达，而在人成纤维细胞系中未见明显表达。b图表示poglut3及其潜在调控靶点notch1、notch2和notch3均在人结肠上皮细胞系中表达，提示poglut3在结肠上皮发挥重要功能。c图表示poglut3在小鼠各器官中的相对表达水平，可以看到，其在肠道中有一定水平的表达。d图进一步表示poglut3在小鼠消化道不同位置中均有表达，从而提示了poglut3在胃肠道很可能发挥了极其重要的作用，也提示该基因有利于作为胃肠道疾病的诊断靶点，以及预防、治疗给药的靶点。
126.实施例5 poglut3的肠道上皮缺失在dss(硫酸葡聚糖钠，dextran sulphate sodium)-诱导的急性结肠炎模型中的作用
127.(一)实验方法
128.小鼠：poglut3
fl/fl villin-cre

，poglut3
fl/fl villin-cre-小鼠由南方模式动物研究所构建和繁殖。实验前给小鼠常规食物和水。在所有研究中均采用了体重匹配的小鼠。动物研究得到广州医科大学动物保护与利用委员会的批准，并根据机构指南进行。
129.dss诱导的急性结肠炎：将dss(36,000-50,000mw)，mp biomedicals)添加到它们的饮用水中(3％)，持续7天。给对照小鼠常规食物和水。每天监测小鼠，如果体重减轻超过35％，则对其实施安乐死。
130.苏木精和伊红(h&e)染色：取动物组织固定于4％多聚甲醛(pfa)固定24h，依次浸入50％、60％、70％、80％、90％和100％乙醇脱水，2次二甲苯透明，石蜡包埋，制4μm切片。60℃烤片后，石蜡切片依次经过2次二甲苯，每次15min脱蜡，依次经过2次100％和70％乙醇复水，蒸馏水浸洗2次。苏木素室温染色6min，流水洗去浮色。1％盐酸酒精分色3s，置于自来水中，流水返蓝5min。伊红染色3min，依次经过2次70％、100％乙醇脱水，经过2次二甲苯透明，中性树脂封片。镜检。
131.(二)实验结果
132.利用上皮特异性poglut3敲除小鼠poglut3
fl/fl villin-cre

建立dss模型，以进一步探索poglut3在肠道稳态和肠道炎症中的作用。结果显示，dss诱导的poglut3
fl/fl villin-cre

小鼠结肠炎明显较poglut3
fl/fl villin-cre-小鼠减轻，体现在体重降低较轻，病理评分更低，结肠和小肠缩短较少，如图5的a图-d图，其中，a图表示dss诱导的poglut3
fl/fl villin-cre

小鼠(poglut3上皮特异性敲除小鼠，图中圆环形折线)体重明显较poglut3
fl/fl villin-cre-小鼠(野生型对照，图中倒三角形折线)减轻；b图表示poglut3
fl/fl villin-cre

小鼠在模型中病理评分较poglut3
fl/fl villin-cre-小鼠降低(p＜0.05)；c图表示poglut3
fl/fl villin-cre

小鼠在模型中结肠缩短较poglut3
fl/fl villin-cre-小鼠更少(p＜0.05)；d图表示poglut3
fl/fl villin-cre

小鼠在模型中小肠缩短较poglut3
fl/fl villin-cre-小鼠少(p＜0.05)。病理染色提示，dss处理组中，敲除小鼠无论近端结肠还是远端结肠，上皮损伤和免疫细胞浸润都较野生型小鼠减轻，进一步证实了poglut3的缺失可减轻小鼠dss诱导的结肠炎减轻这一表型(图5的e图)。同时，对稳态下两者肠道组织进行免疫荧光染色，结果提示在敲除小鼠中，nicd的水平显著下调(图5的f图)，提示poglut3缺失降低notch信号通路激活。p值由参数检验方法非成对t检验计算得到，*,p《0.05。以上结果均表明，poglut3敲除小鼠能够减轻结肠炎的发生和发展，从而也从另一方面证明了，前述该基因的表达水平升高突变—955c》t和/或88t＞g会加速ibd的发生发展，因而控制该基因表达水平的升高或维持其处于正常表达水平，能够起到预防和/或治疗ibd、结直肠癌等胃肠道疾病的作用。
133.实施例6 rnaseq提示poglut3上皮特异性缺失导致小鼠肠道抗菌肽显著上调
134.i.实验方法
135.rnaseq：小鼠co2安乐死后将其结肠取出置于冰上，预冷磷酸盐缓冲液冲洗结肠内容物；结净结肠置于hbss中，将结肠纵向剖开，剪成0.5厘米小段，充分涮洗后，新鲜小鼠组织或细胞浸没于rnalater(thermo fisher scientific，waltham，ma)里，4℃固定过夜后，交由金唯智公司进行rna提取和建库及测序。在illumina hiseq 2000上获得读数，使用tophat2与grcm38小鼠基因组装配对齐并使用htseq计数。使用edger进行差异表达基因分析。使用edger表达差异基因分析(》1log
2 fc和《-1log
2 fc，调整的p值＝0.05)。
136.ii.实验结果
137.图6的a图表示在稳态下poglut3
fl/fl villin-cre

小鼠结肠较poglut3
fl/fl villin-cre-小鼠结肠所富集的上调基因的功能注释。其中，词条“r-mmu-6798695:neutrophil degranulation”表示中性粒细胞抗菌功能增强的基因集，词条“go:0002237:response to molecule of bacterial origin”表示抗菌肽分泌增加的基因集，词条“wp3626:microglia pathogen phagocytosis pathway”表示调控小胶质细胞对病原菌发挥吞噬作用的基因集，词条“go:0045088:regulation of innate immune reponse”表示调控天然免疫反应的基因集。上述基因集的基因在poglut3上皮特异性敲除小鼠的结肠组织中表达升高，提示poglut3在肠道上皮的缺失可提高小鼠肠道的抗菌能力。b图表示在dss模型中poglut3
fl/fl villin-cre

小鼠结肠较poglut3
fl/fl villin-cre-小鼠结肠所富集的上调基因的功能注释。提示poglut3上皮特异性缺失导致小鼠肠道抗菌肽显著上调从而能够对相关免疫细胞功能起到促进作用，也可知，其能够起到抗细菌性肠炎的作用。
138.实施例7 poglut3上皮特异性缺失使dss模型小鼠恢复变快并增加其肠道微生物
的多样性
139.i.实验方法
140.小鼠：poglut3
fl/fl villin-cre

，poglut3
fl/fl villin-cre-小鼠由南方模式动物研究所构建和繁殖。实验前给小鼠常规食物和水。在所有研究中均采用了体重匹配的小鼠。动物研究得到广州医科大学动物保护与利用委员会的批准，并根据机构指南进行。
141.dss诱导的急性结肠炎：将dss(36,000-50,000mw)，mp biomedicals)添加到它们的饮用水中(3％)，持续6天。之后撤掉dss，给小鼠更换正常饮用水，观察7天。给对照小鼠常规食物和水。每天监测小鼠，如果体重减轻超过35％，则对其实施安乐死。
142.苏木精和伊红(h&e)染色：取动物组织固定于4％多聚甲醛(pfa)固定24h，依次浸入50％、60％、70％、80％、90％和100％乙醇脱水，2次二甲苯透明，石蜡包埋，制4μm切片。60℃烤片后，石蜡切片依次经过2次二甲苯，每次15min脱蜡，依次经过2次100％和70％乙醇复水，蒸馏水浸洗2次。苏木素室温染色6min，流水洗去浮色。1％盐酸酒精分色3s，置于自来水中，流水返蓝5min。伊红染色3min，依次经过2次70％、100％乙醇脱水，经过2次二甲苯透明，中性树脂封片。镜检。
143.粪便细菌dna提取和粪便微生物组分析：将小鼠单独放入洁净的鼠笼内，用洁净镊子收集粪便。使用dna stool kit(qiagen，germantown，md)依照说明书提取粪便细菌dna。16s rdna v4片段(515f-806r)两侧连接p5和p7 illumina测序接头、barcode、pad和连接序列。使用200ng粪便dna并利用高保真酶accuprime high fidelity taq polymerase(invitrogen,san diego，ca)进行pcr扩增，扩增程序为(95℃ 2min，20s 95℃，30s 55℃，25轮扩增，7min 72℃)。pcr产物使用sequalprep normalization plate kit(invitrogen，san diego，ca)进行纯化和标准化(normalized)。合并并定量得到的洗脱液，并将合并的dna文库在illumina miseq上进行测序(使用v2 500循环试剂盒，v2 500cycle kit)。对序列进行比对、修剪和聚类以产生具有超过97％相似性的操作分类单元(otu)。使用qiime2版本2-2018.2(https://qiime2.org)对配对末端fastq文件进行预处理和分析。在qiime2中采用dada2算法用于建模和过滤原始fastq文件。分类学分析(taxonomic classification)使用qiime2功能分类器silva 132数据库(https://github.com/qiime2/q2-feature-classifier)。3d pcoa使用emperor生成。
144.ii.实验结果
145.图7a表示造模方案。图7b表示模型各时间点两种基因型小鼠的结肠长度。图7c表示模型各时间点两种基因型小鼠的结肠病理表现。beta多样性(beta diversity)主要是利用各样本的物种组成、物种间的进化关系丰度信息来计算样品间距离。其中，主坐标分析pcoa(principal co-ordinates analysis，)是一种研究数据相似性或差异性的可视化方法，通过一系列的特征值和特征向量进行排序后，选择主要排在前几位的特征值，pcoa可以找到距离矩阵中最主要的坐标。通过pcoa分析可以观察个体或群体间的差异，每一个点代表一个样本，相同颜色的点来自同一个分组，两点之间距离越近表明两者的群落构成差异越小。图7d表示模型各时间点两种基因型小鼠的肠道微生物的主坐标分析，pcoa分析结果表明，源自poglut3
fl/fl villin-cre-小鼠和poglut3
fl/fl villin-cre

小鼠的肠道菌群各自聚为一类，说明两组间在群落构成上有差异。图7e表示恢复阶段poglut3
fl/fl villin-cre

小鼠结肠较poglut3
fl/fl villin-cre-小鼠结肠微生物多样性高。图7f表示门(phylum)水平
上各时间点两种基因型小鼠的肠道微生物的组成，提示在poglut3
fl/fl villin-cre-小鼠结肠中，tenericutes比例增加，deferribacteres和proteobacteria比例下降。图7g表示在科(family)水平上各时间点两种基因型小鼠的肠道微生物的分布，提示在poglut3
fl/fl villin-cre-小鼠结肠中deferribacteraceae和deltaproteobacteria比例降低，alphaproteobacteria比例上调。以上结果表明，poglut3上皮特异性缺失使dss模型小鼠恢复变快并增加其肠道微生物的多样性，从而也再次印证了poglut3基因或其蛋白的表达下调，可以防治细菌性肠炎。
146.实施例8 poglut3上皮特异性缺失使柠檬酸杆菌(citrobacter rodentium)感染模型小鼠恢复变快并增加其肠道微生物的多样性
147.为了进一步确认poglut3基因或其蛋白对细菌感染性胃肠道疾病、过敏性胃肠道疾病(例如嗜酸性粒细胞引起的胃肠道疾病，包括食物过敏相关的食管炎和胃肠炎)的影响，本实施例进一步研究poglut3上皮特异性缺失使的一种细菌感染导致的模型小鼠的胃肠道病情恢复情况、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞浸润情况。
148.i.实验方法
149.柠檬酸杆菌(citrobacter rodentium)感染模型：c.rodentium菌液加等量甘油冻存于-80℃。使用时，吸取10μl c.rodentium甘油冻存液加入3ml lb培养基，37℃，120rpm培养，至od
600
＝0.8。取菌液用pbs进行倍比稀释，涂于macconkey琼脂板上，过夜培养后，统计菌落数，依此计算出原菌液中的细菌数。取一定量菌液，离心去除lb培养基，用pbs重悬至1.0x10
10
/ml备用。小鼠饥饿16h，饮用水供应正常。取100μl c.rodentium pbs重悬液给小鼠灌胃，即1x109pfu/小鼠。1h后恢复小鼠正常饮食。每日称量小鼠体重。
150.流式细胞术：小鼠安乐死后将其结肠取出置于冰上，预冷pbs冲洗结肠内容物；结净结肠置于hbss中，将结肠纵向剖开，剪成0.5cm小段，充分涮洗后，将结肠移至新的hbss中；将组织加入10ml结肠上皮消化液(1640 5％fbs 5mm edta 1mm dtt 10mm hepes)，37℃摇床200rpm 30min，剧烈摇晃，过滤后上皮细胞在上清里，重复一次，收集上清离心得到上皮细胞。取出剩余组织，加入固有层消化液(1640 type iv
151.collagenase dnase i)，将组织剪碎，37℃摇床200rpm 30min。过40μm筛网，收集上清，离心得到固有层细胞。用facs buffer(含2％fbs的pbs)清洗细胞一次，用facs buffer重悬后加入流式抗体，4℃避光染色30min。facs buffer清洗细胞3次后，加入pi上机检测。
152.ii.实验结果
153.图8a表示模型中的体重变化，图8b表示模型第14天结肠组织病理染色，结果显示，poglut3
fl/fl villin-cre

小鼠的结肠抵御致病菌入侵的能力增强，可能是抗菌肽上调、肠道微生物的多样性增加的结果。图8c表示模型第14天结肠组织流式细胞术检测，图8d是流式细胞术结果的统计图，提示c.rodentium感染后，poglut3
fl/fl villin-cre-小鼠结肠组织中性粒细胞和嗜酸性粒细胞浸润增加，而上皮缺失poglut3后，中性粒细胞和嗜酸性粒细胞浸润减少，提示上皮缺失poglut3可提高小鼠对致病菌的抵抗能力，降低炎症反应以及减少嗜酸性粒细胞浸润。上述结果提示poglut3是细菌性结肠炎、嗜酸性粒细胞引起的胃肠道疾病(包括食物过敏相关的食管炎和胃肠炎)治疗中的有效靶点。
154.实施例9 poglut3的人类结肠类器官实验
155.肠道共生菌通过肠上皮细胞直接或间接调节黏膜免疫反应，黏膜免疫系统通过肠上皮细胞调节菌群稳态，因此，在肠道黏膜系统的3个组分中，肠上皮是关键。鉴于肠道上皮发育在维持肠道稳态上具有重要作用，我们进一步探索poglut3与肠道上皮增殖和分化是否存在相关性。我们分离健康供者的结肠培养成类器官并进行以下实验：
156.i.实验方法
157.人类结肠类器官的培养：组织活检获得的新鲜结肠黏膜用预冷pbs清洗后，剪碎，使用解离液gentle cell dissociation reagent(stemcell technologies,seattle,wa)置于水平摇床，40rpm室温孵育30分钟。290g，4℃离心5分钟，采用dmem/f-12(含15mm hepes和1％bsa，stemcell technologies,seattle,wa)重悬，吹打20次，将内容物用70μm滤网过滤。200g，4℃离心5分钟，弃去上清留取沉淀。用预冷dmem/f-12(含15mm hepes和1％bsa)将matrigel(growth factor reduced,phenol red free；bd biosciences)等体积稀释后加入解离沉淀中，吹匀后铺入预温的24孔板中，培养箱孵育15分钟使matrigel充分凝固。加入300μl新鲜intesticult
tm
organoid growth medium(stemcell technologies,seattle,wa)，在细胞培养箱中培养。对于类器官的分化，更换intesticult
tm
organoid differentiation medium(stemcell technologies,seattle,wa)，并加入10μmn-[(3,5-difluorophenyl)acetyl]-l-alanyl-2-phenyl]glycine-1,1-dimethylethyl ester(dapt,tocris,minneapolis，mn)和10μm iwp-2培养4天。
[0158]
人类结肠类器官的染色：弃去培养基，加入4％pfa4℃固定30分钟，pbs清洗3次。0.3％triton x-100室温通透30分钟，pbs清洗3次。用10％山羊血清封闭1小时，加入相应一抗，4℃孵育过夜。pbs清洗3次，加入相应二抗，室温孵育1小时。pbs清洗3次，加入dapi复染细胞核。pbs清洗3次后，加入抗淬灭封片剂，置于confocal小皿中拍摄。拍摄采用倒置激光共聚焦显微镜(leica sp5,leica microsystems inc,il)。
[0159]
real-time pcr：类器官浸没于rnalater(thermo fisher scientific，waltham，ma)里，4℃固定过夜后，使用rneasy mini kit(qiagen，germantown，md)依照说明书提取组织rna。经定量后取相同总量rna(2μg)使用all-in-one rt matermix(applied biological materials inc.，richmond，canada)反转录成互补dna(cdna)。以poglut3上游f(5'gaagcctgctatcttgggatt 3'，seq id no.1)，下游r(5'caacgacacccactgaaataga3'，seq id no.2)，notch1上游f(5'atgtgttctcggagtgtgtatg 3'，seq id no.3)，下游r(5'agggaccaagaacttgtataacc 3'，seq id no.4)，lgr5上游f(5'tcttcaccaactgcatcctaaa3'，seq id no.13)，下游r(5'ggactaccaccagaaggataaac3'，seq id no.14)，ascl2上游f(5'aagggcacagagaatccattt 3'，seq id no.15)，下游r(5'gggtccaggtcatctttattacg 3'，seq id no.16)，muc2上游f(5'ctgcgagcagtgtgtctgta3'，seq id no.17)，下游r(5'ggaatcgttgtggtcaccct 3'，seq id no.18)，chga上游f(5'ctgaacacaggcagctttcta3'，seq id no.19)，下游r(5'cagtcaggagttctcagctttc 3'，seq id no.20)，gapdh上游f(5'atcaagaaggtggtgaagca3'，seq id no.11)，下游r(5'agacaacctggtcctcagtgt 3'，seq id no.12)为引物，进行实时定量聚合酶链反应(real-time pcr)扩增40轮。
[0160]
ii.实验结果
[0161]
poglut3在肠道上皮细胞表达并在分泌型上皮分化进程中表达下调。我们进一步验证poglut3与肠道上皮增殖和分化是否存在相关性。我们分离健康供者的结肠培养成类
器官并进行免疫荧光染色，发现正常结肠类器官上具有增殖能力的细胞(ki67

)表达poglut3，且分布于胞浆(图9的a图)。用notch抑制剂dapt诱导类器官向分泌型上皮分化，实时定量聚合酶链式反应(qpcr)检测发现干细胞标志物lgr5和ascl2下调，分泌型上皮细胞分化标志物muc2和chga表达上调，poglut3表达下调且与notch1表达变化一致(图9的b图)。免疫荧光显示，notch1和poglut3可以在细胞中共表达。在正常培养条件下，poglut3与notch1存在共定位。在诱导分化条件下，notch1所呈现的胞浆分布形式减少，几乎不与poglut3存在共定位，提示在细胞增殖状态下poglut3可能与notch1存在相互作用(图9的c图)。因此，我们推测poglut3可能参与调控细胞的增殖或分化行为。p值由参数检验方法非成对t检验计算得到。**，p《0.01，***，p《0.001。
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综上所述，本发明通过对儿童ibd队列样品进行全外显子分析，发现了新的ibd单基因突变，其涉及poglut3基因，及其产生的955c》t突变、848t》g突变(rs759766572)。进一步地，我们还发现955c》t/848t》g突变使poglut3表达水平升高，存在突变的患儿体内poglut3蛋白水平显著高于健康组，且通过免疫荧光检测患儿肠道组织，发现其肠道结构紊乱，ki67

细胞分布散在而且数量增加，失去正常的腺腔结构。此外，我们通过免疫荧光实验、单细胞实验等具体实验验证了，炎症性肠病患者中普遍存在notch信号通路在肠道组织中异常激活，通过类器官实验也发现poglut3与notch信号通路存在相互作用，而由于poglut3与notch信号通路活化相关，因此我们检测了患儿肠道组织notch1及其活化形式nicd的水平，结果notch1及nicd均上调，表明poglut3基因突变患儿肠道上皮同样存在notch信号通路的异常活化。进而，我们还验证了，poglut3在各人结肠上皮细胞系中高表达、poglut3及其潜在调控靶点notch1、notch2和notch3均在人结肠上皮细胞系中表达，以及poglut3在小鼠胃肠道不同位置中均有表达，从而提示该基因能够作为胃肠道疾病的诊断靶点，以及预防、治疗给药的靶点。更进一步地，我们通过poglut3敲除小鼠，验证了poglut3敲除(即表达水平大大降低)能够减轻结肠炎多个症状的发生和发展、使dss模型小鼠恢复变快、同时观察到小鼠肠道抗菌肽显著上调、肠道微生物的多样性增加，对相关免疫细胞功能起到促进作用，从而也从印证了，前述该基因的表达水平升高突变——955c》t和/或88t＞g会加速ibd的发生发展，因而控制该基因表达水平的升高或维持其处于正常表达水平，能够起到预防和/或治疗ibd、细菌性胃肠道感染等胃肠道疾病的作用。
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尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。