产生丝氨酸蛋白酶抑制剂的制作方法

1.本发明涉及表达丝氨酸蛋白酶抑制剂的细菌、用于增加细菌中丝氨酸蛋白酶抑制剂产量的方法及其用途。


背景技术：

2.谷蛋白相关疾病包括由谷蛋白引发的所有疾病。除了其它病理生理学之外，它们还包括乳糜泻和非乳糜泻谷蛋白敏感症。目前，广谱谷蛋白相关疾病的发生率在全世界范围内正不断增长，尤其就乳糜泻和非乳糜泻谷蛋白敏感症来讲。这两种疾病都是通过摄入谷蛋白引发的。乳糜泻涉及先天性免疫和获得性免疫两者，而非乳糜泻谷蛋白敏感症涉及先天性免疫。
3.终生食用不含谷蛋白的饮食是用于乳糜泻和非乳糜泻谷蛋白敏感症患者的黄金标准疗法，但是该疗法可能对疾病的肠外表现有一些限制(sedghizadeh等人，2002年，《口腔外科、口腔医学、口腔病理学、口腔放射学和牙髓病学》，第94卷第4期，第474-478页(sedghizadeh et al.,2002,oral surgery,oral medicine,oral pathology,oral radiology,and endodontology,94(4),474-478))。已表明，遵循严格不含谷蛋白的饮食是非常困难的，因为从谷物生长到制造加工，低水平交叉污染难以避免并且可能在整个食品生产链中发生(mitchison等人，1991年，《胃肠病》，第32卷第3期，第260-265页(mitchison et al.,1991,gut,32(3),260-265))。此外，已描述在严格不含谷蛋白的饮食下每日仍可食用高达3g隐藏的谷蛋白(aziz等人，2014年，《美国胃肠病学杂志》，第109卷第9期，1498页(aziz et al.,2014,the american journal of gastroenterology,109(9),1498))。
4.乳糜泻尤其流行于美国和欧洲，在那里约1％的个体的抗体测试呈阳性(dub
é
等人，2005年，《胃肠病学》，第128卷第4期，第s57-s67页(dub
é
et al.,2005,gastroenterology,128(4),s57-s67))。它是一种复杂的疾病，由各种免疫、遗传和环境因素之间的复杂相互作用引起(alaedini和green，2005年)。它是通过摄入小麦谷蛋白和其它相关的谷物蛋白(诸如黑麦和大麦蛋白)引发的。与乳糜泻相关联的症状是儿童的生长迟缓、易怒和青春期延迟，以及许多胃肠症状诸如不适、腹泻、粪便潜血、脂肪痢和肠胃气胀(dub
é
等人，2005年；sedghizadeh等人，2002年)。
5.非乳糜泻谷蛋白敏感症(也称为非乳糜泻小麦敏感症)是一种新兴病症。它被定义为由于摄入谷蛋白诱导的临床实体，其导致肠症状和/或肠外症状，这些症状可通过从饮食中去除含谷蛋白的食料而改善(lundin和alaedini，2012年)。除了醇溶蛋白(谷蛋白的主要细胞毒性抗原)之外，谷蛋白和含谷蛋白的谷物(小麦、黑麦、大麦以及它们的衍生物)中存在的其它蛋白/肽可在症状的发展中起作用。非乳糜泻谷蛋白敏感症是在普通人群中患病率介于0.5-13％之间(平均5％)的谷蛋白相关疾病的最常见综合征(catassi等人，2013年，《营养物质》，第5卷第10期，第3839-3853页(catassi et al.,2013,nutrients,5(10),3839-3853))。
6.丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)是存在于真核细胞(gettins，2002年，《化学评论》，
第102卷第12期，第4751-4804页(gettins,2002,chemical reviews,102(12),4751-4804))和原核细胞(kantyka等人，《生物化学》，第92卷第11期，第1644-1656页(kantyka et al.,biochimie,92(11),1644-1656))中的蛋白质超家族。
7.最近，已证实人丝氨酸蛋白酶抑制剂在谷蛋白相关疾病中起重要作用。弹力素是人丝氨酸蛋白酶抑制剂，其显示出对各种形式的弹性蛋白酶和蛋白酶的有效抑制能力(ying和simon，1993年，《生物化学》，第32卷第7期，第1866-1874页(ying&simon,1993,biochemistry,32(7),1866-1874))。弹力素在胃肠道的整个上皮中表达，并且其表达和诱导在患有炎性肠病和乳糜泻的患者中有所减少(baranger、zani、labas、dallet-choisy和moreau，2011年；motta等人，2012年)。最近，已将弹力素鉴定为转谷氨酰胺酶2(tg2)的交联活性的底物(baranger等人，2011年，《公共科学图书馆：综合》，第6卷第6期，第e20976页(baranger et al.,2011,plos one,6(6),e20976)；motta等人，《科学转化医学》，第4卷，第158期，第158ra144-158ra144页(motta et al.,science translational medicine,4(158),158ra144-158ra144))。体外数据显示，添加弹力素适度抑制转谷氨酰胺酶2(tg2)，因此抑制抗消化33-mer醇溶蛋白肽的脱酰胺作用，其是乳糜泻中先天性免疫应答的潜在触发因素中的一种(mccarville等人，2015年，《药理学新见》，第25卷，第7-12页(mccarville et al.2015,current opinion in pharmacology,25,7-12))。
8.已证实，由重组乳酸乳球菌(lactococcus lactis)产生的弹力素的递送减少了谷蛋白诱导的病变并且使小鼠谷蛋白敏感症模型中的肠道炎症正常化(galipeau等人，2014年，《美国胃肠病学杂志》，第109卷第5期，第748-756页(galipeau et al.,2014,the american journal of gastroenterology,109(5),748-756))。然而，提出的这种疗法基于转基因微生物(gmo)，并因此与食品应用不相容，因为消费者对gmo的接受度非常低。
9.最近，丝氨酸蛋白酶抑制剂已在原核细胞中报道。计算机分析显示了在不同的双歧杆菌物种中，存在编码氨酸蛋白酶抑制剂样蛋白的基因，特别是在长双歧杆菌长亚种的细菌中。由长双歧杆菌长亚种(b.longum subsp longum)(称为长双歧杆菌(b.longum))ncc 2705编码的蛋白显示出与人丝氨酸蛋白酶抑制剂相似的抗蛋白酶活性(ivanov等人，2006年，《生物化学杂志》，第281卷第25期，第17246-17252页(ivanov et al 2006,journal of biological chemistry,281(25),17246-17252))。
10.长双歧杆菌ncc 2705根据布达佩斯条约于2001年1月29日保藏于巴斯德研究所，保藏号为cncm i-2618。
11.最近已证实，通过产生丝氨酸蛋白酶抑制剂可改善小鼠谷蛋白敏感症模型中谷蛋白诱导的病理生理学的长双歧杆菌ncc 2705(cncm i-2618)显示出其作为谷蛋白相关疾病的解决方案的潜力(mccarville等人，2017年，《应用与环境微生物学》，第83卷第19期，第e01323-17页(mccarville et al.,2017,appl.envoron.microbiol.vol.83,no.19,e01323-17))。


技术实现要素：

12.本发明人惊奇地发现，半乳糖和低聚半乳糖(gos)在添加到长双歧杆菌长亚种物种的细菌生长培养基中时可以增加丝氨酸蛋白酶抑制剂的产生。
13.因此，在本发明的第一方面，提供了半乳糖或低聚半乳糖(gos)或它们的组合用于
增加长双歧杆菌长亚种中丝氨酸蛋白酶抑制剂产生的用途。
14.在本发明的另一方面，提供了增加长双歧杆菌长亚种物种的细菌中丝氨酸蛋白酶抑制剂产生的方法，其中所述方法包括使长双歧杆菌长亚种在培养基中生长，其特征在于所述培养基包含半乳糖或低聚半乳糖(gos)或它们的组合。
15.根据本发明的另一方面，提供了通过使长双歧杆菌长亚种在培养基中生长的方法产生的长双歧杆菌长亚种物种的细菌，其特征在于所述培养基包含半乳糖或gos或它们的组合。
16.相对于在不存在半乳糖或gos或它们的组合的情况下生长的相同长双歧杆菌长亚种菌株，根据本发明产生的长双歧杆菌长亚种与增加的丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白水平相关联。
17.根据本发明，长双歧杆菌长亚种可在包含浓度为例如0.02重量％至5重量％，优选地为0.05重量％至2重量％的半乳糖或gos或它们的组合的培养基中培养。
18.例如，长双歧杆菌菌株cncm i-2618可在包含浓度为0.02重量％至5重量％、0.05重量％至2重量％、0.1重量％至1.5重量％或约1重量％的半乳糖或gos或它们的组合的培养基中培养。
19.根据本发明的另一方面，提供了一种组合物，该组合物包含根据本文所述的方法产生的长双歧杆菌长亚种。
20.在一个实施方案中，该组合物为食品、医疗食品、管饲或营养补充剂。
21.在一个实施方案中，食品选自乳、酸奶、凝乳、奶酪、发酵乳、基于乳的发酵产品、基于稻的产品、奶粉、婴儿配方食品和宠物食品。
22.在一个实施方案中，该组合物为药物组合物，其中药物组合物包含一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
23.根据本发明的另一方面，提供了根据本文所述的方法产生的长双歧杆菌长亚种，或包含所述长双歧杆菌长亚种的组合物，其用于在治疗或预防与谷蛋白敏感症相关的或涉及丝氨酸蛋白酶抑制剂的活性降低的病症中使用。
24.根据本发明的另一方面，提供了根据本文所述的方法产生的长双歧杆菌长亚种，或包含所述长双歧杆菌长亚种的组合物，其用于在治疗或预防谷蛋白相关疾病中使用。
25.根据本发明的一个方面，提供了根据本文所述的方法产生的长双歧杆菌长亚种，或包含所述长双歧杆菌长亚种的组合物，其用于在治疗或预防乳糜泻、非乳糜泻谷蛋白敏感症、谷蛋白共济失调、疱疹样皮炎或小麦过敏中使用。
26.根据本发明的另一方面，提供了根据本文所述的方法产生的长双歧杆菌长亚种，或包含所述长双歧杆菌长亚种的组合物，其用于在治疗或预防炎症性肠病中使用。
27.长双歧杆菌长亚种可以是任何长双歧杆菌长亚种菌株。在一些优选的实施方案中，长双歧杆菌长亚种菌株可选自长双歧杆菌长亚种菌株cncm i-2169、长双歧杆菌长亚种菌株cncm i-2171、长双歧杆菌长亚种菌株atcc baa-999、长双歧杆菌长亚种菌株atcc 15708、长双歧杆菌长亚种菌株dsm 20097、长双歧杆菌长亚种菌株ncimb 8809、长双歧杆菌长亚种菌株cncm i-2618(ncc 2705)、长双歧杆菌长亚种菌株cncm i-2170、长双歧杆菌长亚种菌株atcc 15707(t)、或它们的组合，特别是长双歧杆菌cncm i-2618(ncc 2705)。
28.还应理解，当半乳糖或gos或它们的组合与长双歧杆菌长亚种组合施用时，半乳糖
和/或gos还可以在体内增加长双歧杆菌长亚种中丝氨酸蛋白酶抑制剂的产生。
29.因此，根据本发明的另一方面，还提供了(i)长双歧杆菌长亚种和(ii)半乳糖或gos、或它们的组合的组合。
30.根据本发明的另一方面，还提供了(i)长双歧杆菌长亚种和(ii)半乳糖或gos、或它们的组合的组合，其用于在治疗或预防与谷蛋白敏感症相关的病症或与丝氨酸蛋白酶抑制剂的水平降低相关联的病症中使用。
31.在一个实施方案中，该组合是长双歧杆菌菌株cncmi-2618和半乳糖的组合。
32.根据本发明的另一方面，还提供了长双歧杆菌长亚种，其用于在治疗或预防与谷蛋白敏感症相关的病症或与丝氨酸蛋白酶抑制剂的水平降低相关联的病症中使用，其中长双歧杆菌长亚种与半乳糖或gos、或它们的组合组合施用。
33.根据本发明的另一方面，提供了半乳糖或gos、或它们的组合，其用于在治疗或预防与谷蛋白敏感症相关的病症或与丝氨酸蛋白酶抑制剂的水平降低相关联的病症中使用，其中半乳糖或gos、或它们的组合与长双歧杆菌长亚种组合施用。
34.在一些实施方案中，长双歧杆菌长亚种可选自长双歧杆菌长亚种菌株cncm i-2169、长双歧杆菌长亚种菌株cncm i-2171、长双歧杆菌长亚种菌株atcc baa-999、长双歧杆菌长亚种菌株atcc 15708、长双歧杆菌长亚种菌株dsm 20097、长双歧杆菌长亚种菌株ncimb 8809、长双歧杆菌长亚种菌株cncm i-2618(ncc 2705)、长双歧杆菌长亚种菌株cncm i-2170、长双歧杆菌长亚种菌株atcc 15707(t)、或它们的组合。
35.在一些优选的实施方案中，长双歧杆菌长亚种可选自长双歧杆菌长亚种菌株cncm i-2169、长双歧杆菌长亚种菌株cncm i-2171、长双歧杆菌长亚种菌株atcc 15708、长双歧杆菌长亚种菌株dsm 20097、长双歧杆菌长亚种菌株ncimb 8809、长双歧杆菌长亚种菌株cncm i-2618(ncc 2705)、长双歧杆菌长亚种菌株cncm i-2170、长双歧杆菌长双歧杆菌菌株atcc 15707(t)或它们的组合。
36.在一些优选的实施方案中，使用长双歧杆菌长亚种菌株长双歧杆菌cncm i-2618(ncc 2705)。
附图说明
37.图1-示出在不同碳水化合物上生长8小时的长双歧杆菌ncc 2705中测量的丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白水平。
38.图2-示出在不同比率的葡萄糖和半乳糖上生长的长双歧杆菌ncc 2705中测量的丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白水平。
39.图3-示出在gos上生长8小时的长双歧杆菌ncc 2705中测量的丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白水平。
40.图4-示出(部分水解的瓜尔胶(phgg))对长双歧杆菌ncc 2705的丝氨酸蛋白酶抑制剂水平的影响。
41.图5-示出半乳糖对能够在半乳糖上生长的长双歧杆菌长亚种菌株的丝氨酸蛋白酶抑制剂水平的影响。值表示由每个样品中的蛋白质总量归一化的蛋白水平。
42.图6-示出半乳糖对不能单独在半乳糖上生长的长双歧杆菌长亚种菌株的丝氨酸蛋白酶抑制剂水平的影响。值表示由每个样品中的蛋白质总量归一化的蛋白水平。
43.图7-示出半乳糖、gos和木瓜蛋白酶对具有丝氨酸蛋白酶抑制剂编码基因的不同双歧杆菌菌株的影响。值表示由每个样品中的蛋白质总量归一化的蛋白水平。
具体实施方式
44.组合物
45.本发明的组合物可为食品、医疗食品、管饲、营养组合物或营养补充剂的形式。术语“营养补充剂”是指旨在补充个体的一般饮食的产品。
46.在一个实施方案中，食品选自乳、酸奶、凝乳、奶酪、发酵乳、基于乳的发酵产品、基于稻的产品、奶粉、婴儿配方食品和宠物食品。
47.该组合物可为医疗食物的形式。如本文所用，术语“医疗食品”是指专门配制用于医疗疾病或病症的膳食管理的食物产品。医疗食物可以在医疗监督下施用。医疗食物可用于口服摄取或管饲。
48.该组合物可为管饲的形式。术语“管饲”是指旨在通过饲管将营养物质直接引入个体的胃肠道的产品。管饲可通过例如穿过个体的鼻子放置的饲管(诸如鼻胃管、鼻窦管和鼻空肠管)或者直接放置到个体的腹部中的饲管(诸如，胃造口术、胃空肠吻合术或空肠造口术饲管)来施用。
49.该组合物可以呈药物组合物的形式并且可包含一种或多种合适的药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
50.本文所述组合物的此类合适的赋形剂的示例可见于由a wade和pj weller编辑的《药物赋形剂手册》，第2版，1994年(“handbook of pharmaceutical excipients”,2nd edition,(1994),edited by a wade and pj weller)中。
51.用于治疗用途的可接受载体或稀释剂在制药领域是众所周知的，并且描述于例如a.r.gennaro编辑的《remington的药物科学》，mack出版公司，1985年(“remington's pharmaceutical sciences”,mack publishing co.(a.r.gennaro edit.1985)。
52.合适的载体的示例包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露醇、山梨糖醇等。合适的稀释剂的示例包括乙醇、甘油和水。
53.可参照预期的施用途径和标准药物实践选择药物载体、赋形剂或稀释剂的选项。药物组合物可包含以下物质作为载体、赋形剂或稀释剂或除了载体、赋形剂或稀释剂之外还包含以下物质：任何合适的粘结剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂和/或增溶剂。
54.合适的粘结剂的示例包括淀粉、明胶、天然糖诸如葡萄糖、无水乳糖、自由流动乳糖、β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成树胶诸如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠、羧甲基纤维素和聚乙二醇。合适的润滑剂的示例包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。
55.可以在组合物中提供防腐剂、稳定剂、染料和甚至风味剂。防腐剂的示例包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸的酯。还可以使用抗氧化剂和悬浮剂。
56.营养学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂包括在食品工业中作为标准使用的适合人类或动物食用的那些。典型的营养学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂对于本领域的技术人员来说是熟悉的。
57.组合物可为片剂、糖衣丸、锭剂、胶囊、胶丸、粉末、颗粒、溶液、乳液、悬浮液、包衣
2209(10801 university blvd.,manassas,virginia 20110-2209,u.s.a))。dsm是指德国莱布尼茨植物遗传和作物研究所(德国布伦瑞克inhoffenstr.7b，d-38124(inhoffenstr.7b,d-38124 braunschweig,germany))。ncimb是指ncimb有限公司(苏格兰阿伯丁buckburnltd，craibstone estate弗格森大楼，ab21 9ya(ferguson building,craibstone estate,buckburn,aberdeen ab21 9ya,scotland))。
67.菌株1、2、6、7、9、11-13已由瑞士韦威雀巢大街55号雀巢公司，1800(nestec s.a.,avenue nestl
é
55,1800 vevey,switzerland)保藏。此后，nestec s.a.已合并到soci
é
t
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des produits nestl
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s.a。因此，根据《布达佩斯条约》第2(ix)条，soci
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des produits nestl
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s.a.是nestec s.a.的继承者。所有其它菌株都是可商购获得的。
68.在一些优选的实施方案中，长双歧杆菌长亚种可选自长双歧杆菌长亚种菌株cncm i-2169、长双歧杆菌长亚种菌株cncm i-2171、长双歧杆菌长亚种菌株atcc 15708、长双歧杆菌长亚种菌株dsm 20097、长双歧杆菌长亚种菌株ncimb 8809、长双歧杆菌长亚种菌株cncm i-2618(ncc 2705)、长双歧杆菌长亚种菌株cncm i-2170、长双歧杆菌长双歧杆菌菌株atcc 15707(t)或它们的组合。
69.在一些优选的实施方案中，使用长双歧杆菌长亚种菌株长双歧杆菌cncm i-2618(ncc 2705)。
70.gos
71.本发明人惊奇地发现，半乳糖和低聚半乳糖(gos)在长双歧杆菌长亚种物种的细菌中可以增加丝氨酸蛋白酶抑制剂的产生。
72.如本文所用，术语“低聚糖”是指聚合度(dp)在2到20(包括端值在内)范围内的碳水化合物。
[0073]“聚合度”或“dp”是指低聚糖或多糖链中糖单元的总数。
[0074]
如本文所用，术语“低聚半乳糖”是指包含两个或更多个半乳糖分子的非消化性低聚糖。本发明的低聚半乳糖的dp为2至20，优选地dp为2至10。基于单体亚单元，优选地至少30％、优选地至少50％、更优选地至少60％的糖单元是半乳糖单元。
[0075]
合适的低聚半乳糖是可商购获得的，并且包括例如purimune gos(得自国际玉米制品公司(cornproducts international))、king gos(得自金欧利多公司(king prebiotics))、vivinal gos(得自菲仕兰康柏尼公司(friesland campina))和phgg(得自太阳公司(taiyo))。低聚糖的其它供应商包括克拉萨多公司(clasado)、宜瑞安公司(ingredion)、奶普利乐公司(leprino)、养乐多公司(yakult)、德斯克实验室(dextra laboratories)、西格玛奥德里奇化学公司(sigma-aldrich chemie gmbh)和协和发酵工业有限公司(kyowa hakko kogyo co.,ltd)。或者，可使用特定的糖基转移酶(诸如半乳糖基转移酶)来生产中性低聚糖。
[0076]
由于其糖苷键的配置，低聚半乳糖(gos)很大程度上抵抗唾液和肠道消化酶的水解。gos被分类为益生元、非消化性碳水化合物，其通过刺激结肠中有益细菌的生长和/或活性而有益地影响宿主。
[0077]
长双歧杆菌长亚种可在包含浓度为例如0.02重量％至5重量％的半乳糖或gos、或它们的混合物的培养基中培养。例如，长双歧杆菌长亚种可在包含浓度为0.02重量％至5重量％、0.05重量％至2重量％、0.1重量％至1.5重量％或约1重量％的半乳糖或gos、或它们
的混合物的培养基中培养。
[0078]
可将半乳糖或gos、或它们的混合物添加到常规培养基中，该常规培养基包含至多8重量％，优选至多6重量％，例如至多4重量％的适于维持长双歧杆菌生长的另一种糖，诸如但不限于葡萄糖。发明人惊奇地发现，半乳糖可诱导长双歧杆菌长亚种中丝氨酸蛋白酶抑制剂的产生，即使存在葡萄糖，但仅当葡萄糖以允许其在发酵期间耗尽的水平存在时。优选地，发酵结束时的培养基含有少于0.4重量％的葡萄糖，诸如0重量％至0.3重量％的葡萄糖，例如0.02重量％至0.4重量％，或约0.05重量％至约0.3重量％。适于长双歧杆菌生长的常规培养基是本领域技术人员众所周知的。
[0079]
在一个实施方案中，长双歧杆菌长亚种可在包含浓度为0.05重量％至2重量％、0.1重量％至1.5重量％或约1重量％的半乳糖的培养基中培养，任选地在浓度使其能够耗尽直至发酵结束的葡萄糖存在下培养。优选地，发酵结束时的培养基含有少于0.4重量％的葡萄糖，诸如0重量％至0.3重量％的葡萄糖。如果存在葡萄糖，则培养基可以在发酵结束时包含例如0.02重量％至0.4重量％，或约0.05重量％至约0.3重量％的葡萄糖。
[0080]
在一个实施方案中，长双歧杆菌长亚种可在包含浓度为0.05重量％至2重量％、0.1重量％至1.5重量％或约1重量％的gos的培养基中培养，任选地在浓度为0.02重量％至0.4重量％、或约0.05重量％至约0.3重量％的残余葡萄糖存在下培养。
[0081]
在一个实施方案中，半乳糖以上述浓度使用。
[0082]
在一个实施方案中，gos以上述浓度使用。
[0083]
用于产生培养物粉末的方法
[0084]
属于菌种长双歧杆菌的菌株在厌氧条件下生长。厌氧条件下的发酵方法是公知的。根据待生长的微生物，技术人员能够鉴定发酵培养基的合适组分并基于常识调整发酵条件。发酵培养基通常包含
[0085]-氮源，诸如酵母提取物；
[0086]-碳源，诸如糖；
[0087]-微生物所需的各种生长因子(例如矿物质、维生素等)以及
[0088]-水。
[0089]
用于长双歧杆菌的典型生长培养基的非限制性示例为补充有0.05％半胱氨酸的mrs(de man、rogosa和sharpe)培养基(mrsc)。
[0090]
发酵优选以两个步骤进行，发酵剂发酵在主发酵步骤之前进行。发酵培养基对于发酵剂发酵和主发酵可以是不同的，或者可以是相同的。
[0091]
该方法的第二步是生物质的浓缩。这也可使用本领域技术人员已知的方法进行，诸如例如离心或过滤。基于生物质的总干重(即发酵培养基和产生的微生物的总量)计，浓缩后生物质的总固体含量优选地为10重量％至35重量％，优选地为14重量％至35重量％。
[0092]
任选地，浓缩可在洗涤步骤之前或与洗涤步骤组合以去除发酵培养基的残余物和/或在发酵期间产生的化合物。例如，可通过浓缩生物质，将浓缩的生物质重悬于缓冲液诸如磷酸盐缓冲液或类似组合物中并重新浓缩生物质来进行洗涤。
[0093]
例如，可应用全文以引用方式并入的wo2017/001590中描述的方法。
[0094]
组合
[0095]
在本发明的一个方面，提供了(i)长双歧杆菌长亚种和(ii)半乳糖或gos、或它们
298页(alaedini&green,2005,annals of internal medicine,142(4),289-298))。
[0109]
非乳糜泻谷蛋白敏感症
[0110]
非乳糜泻谷蛋白敏感症(也称为非乳糜泻小麦敏感症)是一种新兴病症。它被定义为由于摄入谷蛋白诱导的临床实体，其导致肠症状和/或肠外症状，这些症状可通过从饮食中去除含谷蛋白的食料而改善(lundin和alaedini，2012年)。非乳糜泻谷蛋白敏感症的发病尚未被充分了解。已表明，除了醇溶蛋白(谷蛋白的主要细胞毒性抗原)之外，谷蛋白和含谷蛋白的谷物(小麦、黑麦、大麦以及它们的衍生物)中存在的其它蛋白/肽可在症状的发展中起作用。非乳糜泻谷蛋白敏感症是在普通人群中患病率介于0.5-13％之间的谷蛋白相关疾病的最常见综合征(catassi等人，2013年，《营养物质》，第5卷第10期，第3839-385页(catassi et al.,2013,nutrients,5(10),3839-385))。非乳糜泻谷蛋白敏感症的诊断通过排除其它谷蛋白相关疾病来进行。
[0111]
疱疹样皮炎
[0112]
疱疹样皮炎是一种慢性起泡皮肤自身免疫性病症，其特征在于存在皮肤病变，该皮肤病变具有广泛且对称的分布，主要在摩擦较大的区域中，并且主要影响两个肘部、膝盖、臀部、踝部，并且也可影响头皮和身体的其它部位。这些病变是水泡-结痂型的，并且当它们剥落时，它们发展成有色区域或者慢性且强烈的灼热、瘙痒和起泡皮疹。
[0113]
发病年龄是可变的。它可始于儿童和青少年时期，但也可在其生命的任何年龄不明显地影响两种性别的个体。
[0114]
患有疱疹样皮炎的人具有不同程度的肠病变，范围从较温和的粘膜损伤到存在绒毛萎缩。
[0115]
小麦过敏
[0116]
小麦过敏的胃肠症状类似于乳糜泻和非乳糜泻谷蛋白敏感症，但在暴露于小麦和症状发作之间存在不同的间隔。在食用含小麦的食品后小麦过敏会快速发作(从几分钟到几小时)，并且可导致过敏症。
[0117]
谷蛋白共济失调
[0118]
谷蛋白共济失调是谷蛋白相关疾病。患有谷蛋白共济失调时，在小脑中发生损伤，小脑是大脑的平衡中心，控制协调和复杂运动如行走、说话和吞咽。谷蛋白共济失调是散发性特发性共济失调的最常见起因之一。它占据未知来源共济失调的40％和所有共济失调的15％。
[0119]
谷蛋白共济失调是由于遗传易感性个体摄入谷蛋白而引发的免疫介导的疾病。在患有散发性特发性共济失调的所有患者的鉴别诊断中应考虑它。治疗的效果取决于从共济失调发病直到诊断所经过的时间。由于个体暴露于谷蛋白所导致的小脑中神经元的死亡是不可逆的。
[0120]
早期诊断和用不含谷蛋白的饮食治疗可改善共济失调并阻止其进展。少于10％的患有谷蛋白共济失调的人呈现任何胃肠症状，但约40％具有肠损伤。谷蛋白共济失调的敏感标记物包括抗醇溶蛋白抗体。免疫球蛋白a(iga)在小肠中和在肠外位点处紧靠转谷氨酰胺酶2(tg2)沉积证明是另外可靠的。
[0121]
施用
[0122]
本文所述的长双歧杆菌长亚种或组合物优选地经肠施用。
[0123]
经肠施用可以是口服、胃和/或直肠施用。
[0124]
一般来讲，本文所述的组合或组合物的施用可例如通过口服途径或另一种途径进入胃肠道，例如可通过管饲施用。
[0125]
在一个另选的实施方案中，本文所述的组合施用或组合物的施用可以是局部施用。
[0126]
个体可以是哺乳动物，诸如人类、犬科动物、猫科动物、马科动物、山羊、牛科动物、绵羊、猪、鹿科动物和灵长类动物。优选地，个体是人类。
[0127]
现将通过非限制性实施例来描述本发明的优选特征和实施方案。
[0128]
除非另外指明，本发明的实践将采用常规化学、生物化学、分子生物学、微生物学和免疫学技术，这些技术均在本领域普通技术人员的能力范围内。此类技术在文献中有所阐述。参见：例如sambrook,j.,fritsch,e.f.和maniatis,t.，1989年，《molecular cloning：a laboratory manual》，第二版，冷泉港实验室出版社；ausubel,f.m.等人，(1995年和定期补充)，《current protocols in molecular biology》,第9、13和16章,john wiley&sons；roe,b.、crabtree,j.和kahn,a.，1996年，《dna isolation and sequencing:essential techniques》，john wiley&sons；polak,j.m.和mcgee,j.o’d.，1990年，《in situ hybridization:principles and practice》，牛津大学出版社；gait,m.j.，1984年，《oligonucleotide synthesis:a practical approach》,irl出版社；以及lilley,d.m.and dahlberg,j.e.，1992年，《methods in enzymology:dna structures part a:synthesis and physical analysis of dna》,学术出版社。这些一般性文本均以引用的方式并入本文。
[0129]
实施例
[0130]
实施例1：由半乳糖进行的长双歧杆菌cncm i-2618(ncc 2705)丝氨酸蛋白酶抑制剂诱导
[0131]
长双歧杆菌菌株cncm i-2618(ncc 2705)在不含糖的mrs 5mm l-半胱氨酸(mrsc)碱基中在微型生物反应器(biolector)(生长条件
–
厌氧，37℃)中生长，向其中添加不同的碳水化合物。
[0132]
使用配有ph传感器和溶解氧(do)传感器的48孔微量滴定板在微型生物反应器(德国m2p-labs aachen公司(m2p-labs aachen,germany))中培养菌株。将其连续摇动8小时以防止细菌聚集。通过离心收获培养物并去除上清液。将沉淀重悬于补充有halt蛋白酶抑制剂(西格玛公司(sigma))的pbs中并使用玻璃珠裂解。然后收集含有可溶性和不溶性材料的裂解物。使用pierce bca试剂盒(赛默飞世尔公司(thermofisher))测量总蛋白含量，并且使用elisa测定丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白浓度。
[0133]
如图1所示，与所测试的所有其它糖相比，半乳糖被示出为增加长双歧杆菌ncc 2705丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白水平。
[0134]
实施例2：在葡萄糖存在下由半乳糖进行的长双歧杆菌cncm i-2618(ncc 2705)丝氨酸蛋白酶抑制剂诱导
[0135]
长双歧杆菌ncc 2705在不含糖的mrsc的碱基中在微型生物反应器中培养(如实施例1中所述)，添加了不同的葡萄糖和半乳糖比例，至最终浓度为1％。在生长18小时后收集培养物，并分析总丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白水平(如实施例1中所述)。
[0136]
结果(图2)显示半乳糖可诱导丝氨酸蛋白酶抑制剂在长双歧杆菌ncc 2705中的产生，即使存在葡萄糖，但仅当葡萄糖以在发酵期间耗尽的水平存在时。在此实施例中使用的模型系统中，添加0.3％是葡萄糖的最大添加速率，从而允许其在发酵期间耗尽(数据未显示)。因此，发酵系统/生长培养基中的葡萄糖浓度应相对于半乳糖浓度保持为低。
[0137]
实施例3：由低聚半乳糖(gos)进行的长双歧杆菌ncc 2705丝氨酸蛋白酶抑制剂诱导
[0138]
长双歧杆菌ncc 2705在不含糖的mrsc碱基上生长，在不同浓度下添加不同的可商购获得的低聚半乳糖(gos)。培养物如先前所述(参见实施例1)生长18小时并收获。分析获得的沉淀的总蛋白含量和丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白含量(参见实施例1)。测试的商业gos是purimune gos(得自国际玉米制品公司)、king gos(gds-700-p，得自金欧利多公司)、vivinal gos糖浆(得自domo公司(domo))、bmos(牛乳低聚糖，得自雀巢公司(nestl
é
))、sunfiber r(部分水解的瓜尔胶；得自得自太阳公司(taiyo gmbh))。
[0139]
purimmune gos、king gos、vivinal gos和bmos支持长双歧杆菌ncc 2705的生长。如图3所示，这些gos可以显著增加长双歧杆菌ncc 2705中丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白的水平。由于可商购获得的gos都含有残余糖(主要是葡萄糖和乳糖)，因此应该调整其使用的浓度，使得那些残余糖以在发酵期间耗尽的水平存在。单独的sunfiber r仅部分地支持长双歧杆菌ncc 2705的生长(数据未示出)，然而，如其它测试的gos，其能够显著增加长双歧杆菌ncc 2705中丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白质的水平(图4)。
[0140]
实施例4：由半乳糖进行的长双歧杆菌长亚种丝氨酸蛋白酶抑制剂诱导
[0141]
丝氨酸蛋白酶抑制剂编码基因及其周围环境在长双歧杆菌长亚种物种中高度保守。长双歧杆菌长亚种的菌株被选择为表示遗传系统树的整个跨度(表2)。所有菌株都在微型生物反应器中(根据实施例1)在不含糖的mrsc碱基中培养，向其添加1％葡萄糖、1％半乳糖或葡萄糖和半乳糖(分别为0.2％和0.8％)的混合物。培养物生长18小时并收获。进一步分析获得的沉淀的总蛋白含量和丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白含量(参见实施例1)。
[0142]
表2：所测试的长双歧杆菌长亚种菌株的列表及其丝氨酸蛋白酶抑制剂基因与bl0108(长双歧杆菌ncc 2705丝氨酸蛋白酶抑制剂编码基因)的同源性。
[0143]
菌株n
°
bl0108的％id(ncc2705丝氨酸蛋白酶抑制剂)ncc 2705(cncm i-2618)100.00atcc 15707(t)99.78cncn i-217199.79atcc baa-99999.78atcc 1570899.57dsm 2009797.42ncimb 880999.79cncm i-2170100
[0144]
并发所有长双歧杆菌长亚种的菌株都能够作为唯一碳水化合物源在半乳糖上生长。然而，如图5和图6中所示，尽管如此，但重要的是，丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白水平在所有长双歧杆菌长亚种菌株中在存在半乳糖的情况下增加，这意味着半乳糖的诱导能力不依赖于其代谢生长的能力。
[0145]
实施例5：由半乳糖进行的长双歧杆菌丝氨酸蛋白酶抑制剂诱导此外，丝氨酸蛋白酶抑制剂在有限数量的双歧杆菌物种中是保守的(turroni,f等人，characterization of the serpin-encoding gene of bifidobacterium breve 210b.appl environ microbiol 76,3206-3219(短双歧杆菌210b的丝氨酸蛋白酶抑制剂编码基因的表征，《应用与环境微生物学》，第76卷，第3206-3219页)，doi：10.1128/aem.02938-09，2010年)。属于这些物种的菌株(表3)在微型生物反应器中(参见实施例1)在不含糖的mrsc碱基中培养，向其添加1％葡萄糖、1％半乳糖。同样，在1％葡萄糖之上，测试0.05mg/ml木瓜蛋白酶(得自沃新顿公司(worthington))，如先前证明在短双歧杆菌(b.breve)中诱导丝氨酸蛋白酶抑制剂。培养物生长18小时并收获。进一步分析获得的沉淀的总蛋白含量和丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白含量(参见实施例1)。
[0146]
表3：所使用的菌株的列表及其丝氨酸蛋白酶抑制剂基因与bl0108(长双歧杆菌ncc 2705丝氨酸蛋白酶抑制剂编码基因)的同源性。
[0147][0148]
如图5-图7所示，错误！找不到参考源。所有测试的长双歧杆菌长亚种菌株响应于半乳糖，并显示显著的丝氨酸蛋白酶抑制剂蛋白增加。而相反，短双歧杆菌atcc 15700(t)、长双歧杆菌婴儿亚种和长双歧杆菌猪亚种菌株都不被半乳糖诱导。以前显示诱导短丝双歧杆菌丝氨酸蛋白酶抑制剂的木瓜蛋白酶不增加长双歧杆菌长亚种培养物中的丝氨酸蛋白酶抑制剂水平，但在短双歧杆菌atcc 15700(t)菌株中确实如此。分别属于长双歧杆菌婴儿亚种和长双歧杆菌猪亚种的两种菌株属于既不由半乳糖诱导，也不由木瓜蛋白酶诱导(图7)。