使用循环探针的指数基数-3及以上的核酸扩增的制作方法

使用循环探针的指数基数-3及以上的核酸扩增
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2020年4月27日提交的美国临时申请63/016,194的优先权，其全部内容通过引用的方式纳入本文。
3.关于在联邦政府资助的研究和开发下做出的发明的权利声明
4.不适用
技术领域
5.本文所述的方法和组合物通常涉及核酸扩增领域。具体地，本文记载的是用于增加扩增效率的方法和组合物。


背景技术：

6.多种核酸扩增方法是可获得的，并且许多方法已用于实施基于核酸检测的灵敏诊断测定。聚合酶链式反应(pcr)仍然是最广泛使用的dna扩增和定量方法。巢式pcr(两步pcr)用于增加pcr的特异性和灵敏性(美国专利4,683,195)。用于pcr扩增的巢式引物为具有与靶序列上反向引物和正向引物靶向位点之间的区域互补的序列的寡核苷酸。然而，pcr通常具有若干限制。标准pcr扩增在每个循环时仅能够实现靶序列量的少于两倍的增加。这仍然是相对较低的。此外，该方法的灵敏性通常是受限的，使其难以在单个反应中检测仅以少数分子存在的靶标。
[0007]“催化杂交扩增(catalytic hybridization amplification)”(cha)(或者称为“循环探针技术(cycling probe technology)”)记载于pct公开wo 89/09284和美国专利5,011,769和4,876,187中。简言之，cha是一种改进的杂交测定方法，由此待检测的靶序列能够在重复的反应系列中捕获探针的许多分子(即，“循环探针”)。本质上，探针靶双链体内的探针的酶介导裂解导致完整靶序列的释放，其可通过反应途径重复地再循环。靶序列用作催化辅因子，其用于裂解与靶标杂交的互补的经标记的核酸探针。该反应中的可检测信号由探针的裂解产生，例如在重复的cha循环后，测量经标记的探针裂解产物。cha方法可用于检测特异性dna或rna序列。


技术实现要素：

[0008]
本文考虑到的各种实施方案可包括但不限于以下中的一个或多个：
[0009]
实施方案1：用于扩增样品中靶核酸的核酸引物组，其中所述靶核酸包括第一模板链和任选的第二模板链，其中所述第二模板链与所述第一模板链互补，所述引物组包括循环探针和寡核苷酸，所述寡核苷酸为至少两种第一引物形式或能够形成至少两种第一引物，所述第一引物能够与所述第一模板链杂交，其中所述至少两种第一引物包含第一外引物和第一内引物，
[0010]
所述第一外引物包括与第一模板链序列a’特异性杂交的引物序列a，引物序列a包括一个或多个第一经修饰的碱基；并且
[0011]
所述第一内引物包括与第一模板链序列b’特异性杂交的单链引物序列b，其中b’与a’相邻并且是a’的5’，并且其中单链引物序列b在其5’端连接至双链引物序列的第一链，所述第一链包括：
[0012]
引物序列a，其与单链引物序列b相邻并且是单链引物序列b的5’；和
[0013]
夹持序列c(clamp sequence c)，其与引物序列a相邻并且是引物序列a的5’，其中夹持序列c不与第一链模板序列d’互补，所述序列d’与第一链模板序列a’相邻并且是第一链模板序列a’的3’；其中双链引物序列的第二链包括引物序列c’，其与引物序列a’相邻并且是引物序列a’的3’，其中联合序列c
’‑
a’与联合序列c-a互补，引物序列a’包括一个或多个第二经修饰的碱基；并且其中第一和第二经修饰的碱基的未修饰形式是互补的，并且与第一和第二经修饰的碱基之间的配对相比，第一和第二经修饰的碱基优先与未修饰形式配对。
[0014]
实施方案2：实施方案1所述的引物组，其中所述引物组额外包括至少一种能够与所述第二模板链特异性杂交的第二引物。
[0015]
实施方案3：用于扩增样品中靶核酸的方法，其中所述靶核酸包括第一模板链和任选的第二模板链，其中所述第二模板链与所述第一模板链互补，所述方法包括：
[0016]
(a)使所述样品与包括标记物的循环探针和以下接触：
[0017]
(i)至少两种第一引物，所述第一引物能够与所述第一模板链杂交，其中所述至少两种第一引物包含第一外引物和第一内引物，
[0018]
所述第一外引物包含与第一模板链序列a’特异性杂交的引物序列a，引物序列a包括一个或多个第一经修饰的碱基；并且
[0019]
所述第一内引物包含与第一模板链序列b’特异性杂交的单链引物序列b，其中b’与a’相邻并且是a’的5’，并且其中单链引物序列b在其5’端连接至双链引物序列的第一链，所述第一链包括：
[0020]
引物序列a，其与单链引物序列b相邻并且是单链引物序列b的5’；和
[0021]
夹持序列c，其与引物序列a相邻并且是引物序列a的5’，其中夹持序列c不与第一链模板序列d’互补，所述序列d’与第一链模板序列a’相邻并且是第一链模板序列a’的3’；其中双链引物序列的第二链包括引物序列c’，其与引物序列a’相邻并且是引物序列a’的3’，其中联合序列c
’‑
a’与联合序列c-a互补，引物序列a’包括一个或多个第二经修饰的碱基；其中第一和第二经修饰的碱基的未修饰形式是互补的，并且与第一和第二经修饰的碱基之间的配对相比，第一和第二经修饰的碱基优先与未修饰形式配对；和
[0022]
(ii)至少一种能够与所述第二模板链特异性杂交的第二引物，其中所述接触是在其中引物退火至它们的模板链的条件下进行(如果存在)；
[0023]
(b)在其中发生链置换的条件下，(如果存在)使用缺少5
’‑3’
外切核酸酶活性的dna聚合酶扩增靶核酸以产生扩增子，所述扩增子包含从模板序列a’延伸至所述第二引物结合位点的序列；以及
[0024]
(c)检测和任选地定量所述靶核酸。
[0025]
实施方案4：实施方案3所述的方法，其中所述dna聚合酶在85摄氏度以上是稳定的。
[0026]
实施方案5：前述实施方案中任一项所述的引物组或方法，其中双链形式的联合序
列c-a的tm高于双链形式的联合序列a-b的tm。
[0027]
实施方案6：前述实施方案中任一项所述的引物组或方法，其中联合序列c-a比联合序列a-b更富含gc，和/或包含更多稳定的碱基。
[0028]
实施方案7：前述实施方案中任一项所述的引物组或方法，其中所述引物组能够在扩增的指数期中以至少3
循环数
的速率扩增靶核酸，或所述方法在扩增的指数期中以至少3
循环数
的速率扩增靶核酸。
[0029]
实施方案8：前述实施方案中任一项所述的引物组或方法，其中所述引物组或方法允许在这样的扩增循环内检测生物样品中的单拷贝核酸：所述扩增循环比仅使用单个正向引物和单个反向引物的所述检测所需的扩增循环少约12％-42％。
[0030]
实施方案9：实施方案2-8中任一项所述的引物组或方法，其中所述第二引物包括寡核苷酸，所述寡核苷酸为至少两种第二引物形式或能够形成至少两种第二引物，所述第二引物能够与所述第二模板链杂交，其中所述至少两种第二引物包含第二外引物和第二内引物，
[0031]
所述第二外引物包括与第二模板链序列e’特异性杂交的引物序列e，引物序列e包括一个或多个第三经修饰的碱基；并且
[0032]
所述第二内引物包括与第二模板链序列f’特异性杂交的单链引物序列f，其中f’与e’相邻并且是e’的5’，并且其中单链引物序列f在其5’端连接至双链引物序列的第一链，所述第一链包括：
[0033]
引物序列e，其与单链引物序列f相邻并且是单链引物序列f的5’；和
[0034]
夹持序列g，其与引物序列e相邻并且是引物序列e的5’，其中夹持序列g不与第二链模板序列h’互补，所述序列h’与第二模板链序列e’相邻并且是第二模板链序列e’的3’；其中双链引物序列的第二链包括引物序列g’，其与引物序列e’相邻并且是引物序列e’的3’，其中联合序列g
’‑
e’与联合序列g-e互补，引物序列e’包括一个或多个第四经修饰的碱基；并且其中第三和第四经修饰的碱基的未修饰形式是互补的，并且与第三和第四经修饰的碱基之间的配对相比，第三和第四经修饰的碱基优先与未修饰形式配对。
[0035]
实施方案10：实施方案9所述的引物组或方法，其中双链形式的联合序列g-e的tm高于双链形式的联合序列e-f的tm。
[0036]
实施方案11：实施方案9-10中任一项所述的引物组或方法，其中联合序列g-e比联合序列e-f更富含gc，和/或含有更多稳定的碱基。
[0037]
实施方案12：实施方案9-11中任一项所述的引物组或方法，其中所述引物组能够在扩增的指数期中以至少6
循环数
的速率扩增靶核酸，或所述方法在扩增的指数期中以至少6
循环数
的速率扩增靶核酸。
[0038]
实施方案13：实施方案9-12中任一项所述的引物组或方法，其中引物组或方法允许在这样的扩增循环内检测生物样品中的单拷贝核酸：所述扩增循环比仅使用单个正向引物和单个反向引物的所述检测所需的扩增循环少约36％-66％。
[0039]
实施方案14：前述实施方案中任一项所述的引物组或方法，其中夹持序列c和g(如果存在)不能在扩增过程中被复制。
[0040]
实施方案15：实施方案14所述的引物组或方法，其中夹持序列c和/或g(如果存在)包含2
’‑
o-甲基rna。
[0041]
实施方案16：前述实施方案中任一项所述的引物组或方法，其中所述第一内引物和/或所述第二内引物(如果存在)的双链引物序列不包含发夹序列。
[0042]
实施方案17：实施方案1-15中任一项所述的引物组或方法，其中所述第一内引物的双链引物序列包括发夹序列，在该发夹序列中夹持序列c连接至互补序列c’，和/或所述第二内引物的双链引物序列(如果存在)包含发夹序列，在该发夹序列中夹持序列g连接至互补序列g’。
[0043]
实施方案18：用于扩增样品中靶核酸的核酸引物组，其中所述靶核酸包括第一模板链和任选的第二模板链，其中所述第二模板链与所述第一模板链互补，所述引物组包括包含标记物的循环探针和寡核苷酸，所述寡核苷酸为至少三种第一引物形式或能够形成至少三种第一引物，所述第一引物能够与所述第一模板链杂交，其中所述至少三种第一引物包含第一外引物、第一中间引物和第一内引物，
[0044]
所述第一外引物包括与第一模板链序列d’特异性杂交的引物序列d，引物序列d包括一个或多个第一经修饰的碱基；
[0045]
所述第一中间引物包括与第一模板链序列a’特异性杂交的单链引物序列a，其中a’与d’相邻并且是d’的5’，引物序列a包括一个或多个第二经修饰的碱基，其中单链引物序列a在其5’端连接至双链引物序列的第一链，所述第一链包括：
[0046]
引物序列d，其与单链引物序列a相邻并且是单链引物序列a的5’；和
[0047]
夹持序列c1，其与引物序列d相邻并且是引物序列d的5’，其中夹持序列c1不与第一模板链序列i’互补，所述第一模板链序列i’与第一模板链序列d’相邻并且是第一模板链序列d’的3’；其中双链引物序列的第二链包括引物序列c1’，其与引物序列d’相邻并且是引物序列d’的3’，其中联合序列c1
’‑
d’与联合序列c1-d，引物序列d’包括一个或多个第三经修饰的碱基；并且
[0048]
所述第一内引物包括与第一模板链序列b’特异性杂交的单链引物序列b，其中b’与a’相邻并且是a’的5’，并且其中单链引物序列b在其5’端连接至双链引物序列的第一链，所述第一链包括：
[0049]
引物序列a，其与单链引物序列b相邻并且是单链引物序列b的5’；
[0050]
引物序列d，其与引物序列a相邻并且是引物序列a的5’；和
[0051]
夹持序列c2，其与引物序列d相邻并且是引物序列d的5’，其中夹持序列c2不与第一链模板序列i’互补；其中内引物的双链引物序列的第二链包括引物序列c2’，其与引物序列d’相邻并且是引物序列d’的3’，所述引物序列d’与引物序列a’相邻并且是引物序列a’的3’，引物序列a’包括一个或多个第四经修饰的碱基，其中联合序列c2
’‑d’‑
a’与联合序列c2-d-a互补；其中第一和第三经修饰的碱基的未修饰形式是互补的，并且与第一和第三经修饰的碱基之间的配对相比，第一和第三经修饰的碱基优先与未修饰形式配对；并且其中第二和第四经修饰的碱基的未修饰形式是互补的，并且与第二和第四经修饰的碱基之间的配对相比，第二和第四经修饰的碱基优先与未修饰形式配对。
[0052]
实施方案19：实施方案18所述的引物组，其中所述引物组额外包括至少一种能够与所述第二模板链特异性杂交的第二引物。
[0053]
实施方案20：用于扩增样品中靶核酸的方法，其中所述靶核酸包括第一模板链和任选的第二模板链，其中所述第二模板链(如果存在)与所述第一模板链互补，所述方法包
括：
[0054]
(a)使所述样品与包括标记物的循环探针和以下接触：
[0055]
(i)至少三种能够与所述第一模板链杂交的第一引物，其中所述至少三种第一引物包含第一外引物、第一中间引物和第一内引物，
[0056]
所述第一外引物包括与第一模板链序列d’特异性杂交的引物序列d，所述引物序列d包括一个或多个第一经修饰的碱基；
[0057]
所述第一中间引物包括与第一模板链序列a’特异性杂交的单链引物序列a，其中a’与d’相邻并且是d’的5’，引物序列a包括一个或多个第二经修饰的碱基，其中单链引物序列a在其5’端连接至双链引物序列的第一链，所述第一链包括：
[0058]
引物序列d，其与单链引物序列a相邻并且是单链引物序列a的5’；和
[0059]
夹持序列c1，其与引物序列d相邻并且是引物序列d的5’，其中夹持序列c1不与第一模板链序列i’互补，所述第一模板链序列i’与第一模板链序列d’相邻并且是第一模板链序列d’的3’；其中双链引物序列的第二链包括引物序列c1’，其与引物序列d’相邻并且是引物序列d’的3’，其中联合序列c1
’‑
d’与联合序列c1-d互补，引物序列d’包括一个或多个第三经修饰的碱基；并且
[0060]
所述第一内引物包含与第一模板链序列b’特异性杂交的单链引物序列b，其中b’与a’相邻并且是a’的5’，并且其中单链引物序列b在其5’端连接至双链引物序列的第一链，所述第一链包括：
[0061]
引物序列a，其与单链引物序列b相邻并且是单链引物序列b的5’；
[0062]
引物序列d，其与引物序列a相邻并且是引物序列a的5’；和
[0063]
夹持序列c2，其与引物序列d相邻并且是引物序列d的5’，其中夹持序列c2不与第一链模板序列i’互补；其中双链引物序列的第二链包括引物序列c2’，其与引物序列d’相邻并且是引物序列d’的3’，所述序列d’与引物序列a’相邻并且是引物序列a’的3’，引物序列a’包括一个或多个第四经修饰的碱基，其中联合序列c2
’‑d’‑
a’与联合序列c2-d-a互补；其中第一和第三经修饰的碱基的未修饰形式是互补的，并且与第一和第三经修饰的碱基之间的配对相比，第一和第三经修饰的碱基优先与未修饰形式配对；并且其中第二和第四经修饰的碱基的未修饰形式是互补的，并且与第二和第四经修饰的碱基之间的配对相比，第二和第四经修饰的碱基优先与未修饰形式配对；以及
[0064]
(ii)至少一种能够与所述第二模板链特异性杂交的第二引物，其中所述接触在其中引物退火至它们的模板链的条件下进行(如果存在)；
[0065]
(b)在其中发生链置换的条件下，(如果存在)使用缺少5
’‑3’
外切核酸酶活性的dna聚合酶扩增所述靶核酸以产生扩增子，所述扩增子包含从模板序列a’延伸到所述第二引物结合位点的序列；以及
[0066]
(c)检测和任选地定量所述靶核酸。
[0067]
实施方案21：实施方案20所述的方法，其中所述dna聚合酶在85度以上是稳定的。
[0068]
实施方案22：实施方案20或实施方案21所述的方法，其中与不包括经修饰的碱基的相同引物组的每个循环的时间相比，完成每个扩增循环所需的时间至少减少10-95％。
[0069]
实施方案23：实施方案22所述的方法，其中与不包括经修饰的碱基的相同引物组的每个循环的时间相比，完成每个扩增循环所需的时间减少50-85％。
[0070]
实施方案24：实施方案18-23中任一项所述的引物组或方法，其中c1具有与c2不同的序列。
[0071]
实施方案25：实施方案18-24中任一项所述的引物组或方法，其中双链形式的联合序列c1-d的tm高于双链形式的联合序列d-a的tm，并且双链形式的联合序列c2-d-a的tm高于双链形式的联合序列d-a-b的tm。
[0072]
实施方案26：实施方案18-25中任一项所述的引物组或方法，其中联合序列c1-d比联合序列d-a更富含gc，和/或含有更多稳定的碱基，并且联合序列c2-d-a比联合序列d-a-b更富含gc，和/或比联合序列d-a-b含有更多稳定的碱基。
[0073]
实施方案27：实施方案18-26中任一项所述的引物组或方法，其中所述引物组能够在扩增的指数期中以至少4
循环数
的速率扩增靶核酸，或所述方法在扩增的指数期中以至少4
循环数
的速率扩增靶核酸。
[0074]
实施方案28：实施方案18-27中任一项所述的引物组或方法，其中所述引物组或方法允许在这样的扩增循环内检测生物样品中的单拷贝核酸：所述扩增循环比仅使用单个正向引物和单个反向引物的所述检测所需的扩增循环少约25％-55％。
[0075]
实施方案29：实施方案18-28中任一项所述的引物组或方法，其中所述第二引物包括寡核苷酸，所述寡核苷酸为至少三种所述第二引物形式或能够形成至少三种所述第二引物，所述第二引物能够与所述第二模板链杂交，其中所述至少三种第二引物包含第二外引物、第二中间引物和第二内引物，
[0076]
所述第二外引物包括与第二模板链序列h’特异性杂交的引物序列h，引物序列h包括一个或多个第五经修饰的碱基；
[0077]
所述第二中间引物包括与第二模板链序列e’特异性杂交的单链引物序列e，其中e’与h’相邻并且是h’的5’，引物序列e包括一个或多个第六经修饰的碱基，其中单链引物序列e在其5’端连接至双链引物序列的第一链，所述第一链包括：
[0078]
引物序列h，其与单链引物序列e相邻并且是单链引物序列e的5’；和
[0079]
夹持序列g1，其与引物序列h相邻并且是引物序列h的5’，其中夹持序列g1不与第二模板链序列j’互补，所述序列j’与第二模板链序列h’相邻并且是第二模板链序列h’的3’；其中双链引物序列的第二链包括与引物序列h’相邻并且是引物序列h’的3’的引物序列g1’，其中联合序列g1
’‑
h’与联合序列g1-h互补，引物序列h’包括一个或多个第七经修饰的碱基；并且
[0080]
所述第二内引物包括与第一模板链序列f’特异性杂交的单链引物序列f，其中序列f’与e’相邻并且是e’的5’，并且其中单链引物序列f在其5’端连接至双链引物序列的第一链，所述第一链包括：
[0081]
引物序列e，其与单链引物序列f相邻并且是单链引物序列f的5’；
[0082]
引物序列h，其与引物序列e相邻并且是引物序列e的5’；和
[0083]
夹持序列g2，其与引物序列h相邻并且是引物序列h的5’，其中夹持序列c2不与第一链模板序列j’互补；其中内引物的双链引物序列的第二链包括与引物序列h’相邻并且是引物序列h’的3’的引物序列g2’，所述序列h’与引物序列e’相邻并且是引物序列e’的3’，引物序列e’包括一个或多个第八经修饰的碱基，其中联合序列g2
’‑h’‑
e’与联合序列g2-h-e互补；并且其中第五和第七经修饰的碱基的未修饰形式互补，与第五和第七经修饰的碱基
之间的配对相比，第五和第六经修饰的碱基优先与未修饰形式配对；并且其中第六和第八经修饰的碱基的未修饰形式互补，并且与第六和第八经修饰的碱基之间的配对相比，第六和第八经修饰的碱基优先与未修饰形式配对。
[0084]
实施方案30：实施方案29所述的引物组或方法，其中双链形式的联合序列g1-h的tm高于双链形式的联合序列h-e的tm，并且双链形式的联合序列g2-h-e的tm高于双链形式的联合序列h-e-f的tm。
[0085]
实施方案31：实施方案29或30中任一项所述的引物组或方法，其中联合序列g1-h比联合序列h-e更富含gc，和/或含有更多稳定的碱基，联合序列g2-h-e比联合序列h-e-f更富含gc，和/或比联合序列h-e-f含有更多稳定的碱基。
[0086]
实施方案32：实施方案29-31中任一项所述的方法，其中所述引物组能够在扩增的指数期中以至少8
循环数
的速率扩增靶核酸，或所述方法在扩增的指数期中以至少8
循环数
的速率扩增靶核酸。
[0087]
实施方案33：实施方案29-32中任一项所述的方法，其中所述扩增允许在这样的扩增循环内检测生物样品中的单拷贝核酸：所述扩增循环比仅使用单个正向引物和单个反向引物的所述检测所需的扩增循环少约42％-72％。
[0088]
实施方案34：实施方案18-33中任一项所述的引物组或方法，其中夹持序列c1和c2以及g1和g2(如果存在)不能在扩增期间被复制。
[0089]
实施方案35：实施方案34所述的引物组或方法，其中夹持序列c1和c2以及g1和g2(如果存在)包含2
’‑
o-甲基rna。
[0090]
实施方案36：实施方案20-35中任一项所述的引物组或方法，其中所述第一内引物和所述第一中间引物；和/或所述第二内引物和所述第二中间引物(如果存在)的双链引物序列不包含发夹序列。
[0091]
实施方案37：实施方案20-35中任一项所述的引物组或方法，其中：所述第一内引物的双链引物序列包括发夹序列，在该发夹序列中夹持序列c2连接至互补序列c2’；和/或所述第一中间引物的双链引物序列包括发夹序列，在该发夹序列中夹持序列c1连接至互补序列c1’；和/或所述第二内引物(如果存在)的双链引物序列包括发夹序列，在该发夹序列中夹持序列g2连接至互补序列g2’；和/或所述第二中间引物(如果存在)的双链引物序列包括发夹序列，在该发夹序列中夹持序列g1连接至互补序列g1’。
[0092]
实施方案38：实施方案3-17或20-37中任一项所述的方法，其中所述扩增包括pcr。
[0093]
实施方案39：实施方案3-17或20-38中任一项所述的方法，其中所述样品由来自单个细胞的核酸组成。
[0094]
实施方案40：实施方案1-8中任一项所述的引物组或方法，其中联合序列a-b比联合序列c-a含有更多不稳定的碱基。
[0095]
实施方案41：实施方案9-17中任一项所述的引物组或方法，其中联合序列e-f比联合序列g-e含有更多不稳定的碱基。
[0096]
实施方案42：实施方案18-28中任一项所述的引物组或方法，其中联合序列d-a比联合序列c1-d含有更多不稳定的碱基，和/或联合序列d-a-b比联合序列c2-d-a含有更多不稳定的碱基。
[0097]
实施方案43：实施方案29-42中任一项所述的引物组或方法，其中联合序列h-e比
联合序列g1-h含有更多不稳定的碱基，和/或联合序列h-e-f比联合序列g2-h-e含有更多不稳定的碱基。
[0098]
实施方案44：根据前述实施方案中任一项所述的引物组或方法，其中所述引物组包含探针或所述方法采用探针，所述探针包含一个或多个经修饰的碱基，其中所述经修饰的碱基优先与未修饰的碱基配对。
[0099]
实施方案45：前述实施方案中任一项所述的引物组或方法，其中与未修饰的互补碱基相比，修饰的互补碱基彼此形成更少的氢键。
[0100]
实施方案46：实施方案45所述的引物组或方法，其中在经修饰的互补碱基之间形成的碱基对的tm低于40℃。
[0101]
实施方案47：实施方案9-46中任一项所述的引物组或方法，其中至少一种经修饰的碱基与至少一种其他经修饰的碱基相同。
[0102]
实施方案48：前述实施方案中任一项所述的引物组或方法，其中至少一对修饰的碱基包括腺嘌呤和胸腺嘧啶的修饰形式。
[0103]
实施方案49：实施方案48所述的引物组或方法，其中腺嘌呤和胸腺嘧啶的修饰形式分别是2-氨基腺嘌呤和2-硫代胸腺嘧啶。
[0104]
实施方案50：前述实施方案中任一项所述的引物组或方法，其中至少一对经修饰的碱基包括鸟嘌呤和胞嘧啶的修饰形式。
[0105]
实施方案51：实施方案50所述的引物组或方法，其中鸟嘌呤的修饰形式包括脱氧肌苷、7-烷基-7-脱氮鸟嘌呤、2
’‑
次黄嘌呤或7-硝基-7-脱氮次黄嘌呤(deazahypoxanthine)，且胞嘧啶的修饰形式包括3-(2
’‑
脱氧-β-d-呋喃核糖基)吡咯并-[2,3-d]-嘧啶-2-(3h)-酮、n4-烷基胞嘧啶或2-硫代胞嘧啶。
[0106]
实施方案52：前述实施方案中任一项所述的引物组或方法，其中包含经修饰的碱基的引物或探针序列中的一个或多个引物或探针序列包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个经修饰的碱基。
[0107]
实施方案53：前述实施方案中任一项所述的引物组或方法，其中所述循环探针为rnase h2循环探针。
[0108]
实施方案54:前述实施方案中任一项所述的引物组或方法，其中所述探针是荧光标记的。
[0109]
实施方案55:实施方案54所述的方法的引物组，其中所述探针额外包括荧光猝灭剂。
[0110]
实施方案56:根据前述实施方案中任一项所述的引物组或方法，其中所述引物组包括，或所述方法采用，特异性针对至少一个额外的靶核酸的至少一个额外的引物组和至少一个额外的探针，其中所有探针都用可区分的标记物标记。
[0111]
实施方案57:实施方案56所述的方法，其中所述至少一个额外的探针是循环探针，任选地rnase h2循环探针。
[0112]
实施方案58:实施方案56所述的引物组或方法，其中所述至少一个额外的引物组和至少一个额外的探针特征在于所述的引物和/或探针均包含一个或多个经修饰的碱基，其中所述经修饰的碱基优先与未修饰的碱基配对。
[0113]
实施方案59:实施方案3-17或20-58中任一项所述的方法，其中所述扩增
(amplifying)包括多重反应。
[0114]
实施方案60:实施方案56-59中任一项所述的引物组或方法，其中所述引物组包括，或所述方法采用，2、3、4、5、6、7、8、或9或更多个所述额外的引物组和额外的探针，其中所有探针都用可区分的标记物标记。
[0115]
实施方案61:实施方案3-17或20-60中任一项所述的方法，其中所述扩增是在存在聚乙二醇(peg)的情况下进行。
[0116]
实施方案62:实施方案61所述的方法，其中所述peg是peg 8000。
[0117]
实施方案63:实施方案61或实施方案62所述的方法，其中所述peg是以至少2％的浓度存在。
附图说明
[0118]
图1：示意图示出了在双链dna模板上进行的完全巢式pcr。侧翼引物如图2和图3所记载的。
[0119]
图2：示意图示出了与靶核苷酸序列的一端杂交的示例性的双引物组。该组可以是，例如正向引物组。示出引物序列的不同片段(a,b,c)；互补序列表示为(a’,b’,c’)。模板序列3
’‑5’
表示为d’、a’和b’。外引物(a)是单链的。内引物具有单链部分(b)和双链部分(a-c)。
[0120]
图3：示意图示出了与图2中所示的靶核苷酸序列的相反端杂交的示例性的双引物组。该组可以是，例如反向引物组。引物序列的不同片段示出为(e,f,g)；互补序列表示为(e’,f’,g’)。模板序列3
’‑5’
表示为h’、e’和f’。外引物(e)是单链的。内引物具有单链部分(f)和双链部分(a-g)。
[0121]
图4：示意图示出了与靶核苷酸序列的一端杂交的示例性的三引物组。该组可以是，例如正向引物组。引物序列的不同片段示出为(a,b,c1,c2,d)；互补序列表示为(a’,b’,c1’,c2’,d’)。模板序列按3
’‑5’
表示为i’、d’、a’和b’。外引物(d)是单链的。中间引物具有单链部分(a)和双链部分(d-c1)。内引物具有单链部分(b)和双链部分(a-d-c2)。
[0122]
图5：示意图示出了与图4中所示的靶核苷酸序列的相反端杂交的示例性的三引物组。该组可以是，例如反向引物组。引物序列的不同片段示为(e,f,g1,g2,h)；互补序列表示为(e’,f’,g1’,g2’,h’)。模板序列按3
’‑5’
表示出为j’、h’、e’和f’。外引物(d)是单链的。中间引物具有单链部分(e)和双链部分(h-g1)。内引物具有单链部分(f)和双链部分(e-h-g2)。
[0123]
图6a-b：示意图示出了当允许具有夹持序列的示例性引物与模板杂交时，该引物的两种替代的结构。荧光猝灭剂(q)存在于引物中的一个位置，在该位置它使模板链中对应的荧光标记(f)猝灭。在实施例1中，进行实验，其中在存在或不存在夹子(clamp)的情况下测量引物和互补靶序列的tm。(a)如果在双链形式的联合序列c-a的tm高于双链形式的联合序列a-b的tm，则形成该结构。(b)如果双链形式的联合序列c-a的tm小于双链形式的联合序列a-b的tm，则形成该结构。
[0124]
图7a-b：(a)示意图示出了示例性的双引物组，其中荧光猝灭剂(q)存在于内引物中的一个位置，在该位置它使模板链中对应的荧光标记(f)猝灭。(b)在实施例2的引物延伸反应中，荧光强度作为时间的函数。三条上升迹线是具有稍微不同的夹子的单独反应；水平
迹线没有外(侧翼)置换引物存在。
[0125]
图8a：胸腺嘧啶和腺嘌呤(式1a)、胸腺嘧啶和2-氨基腺嘌呤(式1b)、2-硫代胸腺嘧啶和腺嘌呤(式2b)以及2-硫代胸腺嘧啶和2-氨基腺嘌呤(式2b)之间的watson-crick配对的碱基配对方案。2-硫代胸腺嘧啶与2-氨基腺嘌呤碱基对不稳定，而胸腺嘧啶与2-氨基腺嘌呤以及2-硫代胸腺嘧啶与腺嘌呤碱基对稳定。
[0126]
图8b：胞嘧啶和鸟嘌呤(式3a)，胞嘧啶和肌苷(式3b)，dp和鸟嘌呤(式4a)以及dp和肌苷(式4b)之间的watson-crick配对的碱基配对方案。dp与肌苷碱基对不稳定，而胞嘧啶与肌苷以及dp与鸟嘌呤碱基对稳定。
[0127]
图9：使用修饰的碱基可使基数-3扩增中用于引物退火(上图)的期望的构型更稳定。下图示出了用于引物退火的不期望的构型。指向上方的较大箭头指示不期望的构型比期望的构型更不稳定。换言之，双链形式的联合序列c-a(即，c-a/c
’‑
a’)(在此上下文中使用连字符表示由序列c和a组成的联合核酸序列)的稳定性高于双链形式的联合序列a-b(即，a-b/a
’‑
b’)的稳定性。
[0128]
图10a-10b：a和b图比较了修饰的测试引物组(“8系列；”a图)和未修饰的测试引物组(“6系列；”b图)的实时pcr生长曲线。使用对数y轴刻度将荧光(y轴)相对于pcr循环数作图。参见实施例3。
[0129]
图11a：从减少的模板dna分子的数量开始，通过基数-6(每个循环约6个重复)pcr扩增生成的实时pcr荧光生长曲线。参见实施例4。
[0130]
图11b：图11b示出了达到荧光的阈值水平所需的扩增循环数(ct)，相对于实施例4中所述的研究的起始dna模板分子数目的log 10作图。
[0131]
图12：在荧光寡核苷酸探针的存在下，由基数-6pcr生成实时pcr荧光生长曲线。扩增从模板dna分子的数量减少开始。化脓链球菌(s.pyogenes)基因组dna的log 10稀释被用作dna模板输入。该曲线(按从左到右的顺序)为模板的1.27e7、1.27e6、1.27e5、1.27e4、1.27e3和127个拷贝，无模板对照曲线为最右边的曲线。
[0132]
图13：实施例6中反应盒装载(cartridge loading)的布局图。
[0133]
图14：用于实施例6的详细热循环程序(detailed thermal profile)。
[0134]
图15：在tris-edta缓冲液ph 8.0中稀释的不同百分比的聚乙二醇(peg)8000的存在下，由基数-6pcr生成实时pcr荧光生长曲线。“百分比”对应于反应混合物中估计的peg浓度。该曲线(按从左到右的顺序)为9％、7％、8％和0％的peg 8000。
[0135]
图16：不同百分比的peg 8000对不同类型的核酸扩增的影响：基数-3、基数-3和基数-6。peg 8000对基数-6pcr的影响最大(参见实施例7)。
具体实施方式
[0136]
定义
[0137]
除非另有说明，否则权利要求书和说明书中使用的术语定义如下。
[0138]
术语“核酸”是指核苷酸聚合物，并且除非另有限制，否则包括天然核苷酸的类似物，其能够以与天然存在的核苷酸类似的方式起作用(例如杂交)。
[0139]
术语核酸包括任何形式的dna或rna，包括例如基因组dna；互补dna(cdna)，其是mrna的dna表示(representation)，通常通过信使rna(mrna)的逆转录或通过扩增获得；以
合成方法或通过扩增产生的dna分子；mrna；和非编码rna。
[0140]
术语核酸包括双链或三链核酸复合物，以及单链分子。在双链或三链核酸复合物中，核酸链无须共同延伸(即，双链核酸无须在两条链的整个长度都是双链的)。
[0141]
术语核酸还包括其任何修饰，例如通过甲基化和/或通过加帽。核酸修饰可以包括向单个核酸碱基或整个核酸添加包含额外电荷、极化性、氢键、静电相互作用和官能度的化学基团。此类修饰可包括碱基修饰，例如2’位糖修饰、5位嘧啶修饰、8位嘌呤修饰、胞嘧啶环外胺处修饰、5-溴-尿嘧啶的取代、糖-磷酸骨架修饰、不常见的碱基配对组合，例如异碱基异胞苷和异胍(isoguanidine)等。
[0142]
更具体地，在一些实施方案中，核酸可以包括多脱氧核糖核苷酸(包含2-脱氧-d-核糖)、多核糖核苷酸(包含d-核糖)和任何其他类型的核酸，其是嘌呤或嘧啶碱的n-或c-糖苷，以及包含非核苷酸骨架的其他聚合物，例如聚酰胺(例如肽核酸(pna))和多吗啉代聚合物(参见，例如summerton and weller(1997)morpholino antisense oligomers:design,preparation,and properties,antisense&nucleic acid drug dev.7:1817-195；okamoto et al.(20020)development of electrochemically gene-analyzing method using dna-modified electrodes,nucleic acids res.supplement no.2:171-172)，以及其他合成序列特异性核酸聚合物，条件是所述聚合物含有核碱基，其构型允许碱基配对和碱基堆叠，例如在dna和rna中发现的。术语核酸还包括锁核酸(lna)，其记载于美国专利6,794,499、6,670,461、6,262,490和6,770,748中，其关于lna的公开内容全部通过引用的方式纳入本文。
[0143]
核酸可以源自完全化学合成方法(例如固相介导的化学合成)，源自生物来源(例如通过从产生核酸的任何物种中分离)，或者源自涉及通过分子生物学工具对核酸进行的操作的方法(例如dna复制，pcr扩增，逆转录)，或源自这些方法的组合。
[0144]
如本文所用，术语“互补”是指两个核苷酸之间精确配对的能力；即，如果在核酸的给定位置处的核苷酸能够与另一核酸的核苷酸氢键键合以形成标准碱基对，则认为这两种核酸在该位置彼此互补。两个单链核酸分子之间的互补性可以是“部分的”，其中只有一些核苷酸结合，或者当单链分子之间存在总互补性时，互补性可以是完全的。核酸链之间的互补性程度对核酸链之间杂交的效率和强度有显著影响。
[0145]“特异性杂交”是指在确定的严格条件下，在不存在与杂交混合物中存在的其他核苷酸序列实质性结合的情况下，核酸与靶核苷酸序列的结合。本领域技术人员认识到，放宽杂交条件的严格度允许容忍序列错配。
[0146]
在一些实施方案中，杂交是在严格杂交条件下进行。短语“严格杂交条件”通常是指在所限定的离子强度和ph下，比特定序列的熔解温度(tm)低约5℃至约20℃或25℃范围的温度。如本文所用，tm是一群双链核酸分子均变成半解离为单链的温度。用于计算核酸的tm的方法在本领域中是公知的(参见例如berger and kimmel(1987)methods in enzymology,vol.152:guide to molecular cloning techniques，san diego:academic press,inc.和sambrook et al.(1989)molecular cloning:a laboratory manual,2nd ed.,vols.1-3,cold spring harbor laboratory，两者关于严格杂交条件的记载通过引用的方式纳入本文)。如标准参考文献所示，tm值的简单估计可以通过以下公式计算：tm＝81.5 0.41(％g c)，当核酸在1m nacl的水溶液中时(参见例如anderson and young，
quantitative filter hybridization in nucleic acid hybridization(1985))。杂交体(hybrid)的熔解温度(因此严格杂交的条件)受各种因素的影响，例如引物或探针的长度和性质(dna，rna，碱基组成)以及靶核酸的性质(dna，rna，碱基组成，存在于溶液中或固定化的等)，以及盐和其他组分的浓度(例如甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇的存在与否)。这些因素的影响是公知的，并且在本领域的标准参考文献中进行了讨论。适于实现大多数序列特异性杂交的示例性严格条件是：在ph7下至少约60℃的温度和约0.2摩尔的盐浓度。基于近邻热力学(nearest-neighbors thermodynamics)的寡核苷酸序列的tm计算可以如“a unified view of polymer,dumbbell,and oligonucleotide dna nearest-neighbor thermodynamics”john santalucia,jr.,pnas february 17,1998vol.95no.4 1460-1465(其中的记载通过引用的方式纳入本文)中所述进行。
[0147]
术语“寡核苷酸”用于指相对较短的核酸，通常指短于200个核苷酸，更特别地短于100个核苷酸，最特别地短于50个核苷酸。通常，寡核苷酸是单链dna分子。
[0148]
术语“引物”是指能够与核酸杂交(也称为“退火”)并在适当条件下作为核苷酸(rna或dna)聚合的起始位点的寡核苷酸，所述条件即在存在四种不同核苷三磷酸和用于聚合的试剂(例如dna或rna聚合酶或逆转录酶的情况下。引物的合适长度取决于引物的预期用途，但引物的长度通常为至少7个核苷酸，在一些实施方案中，长度为10至30个核苷酸，或在一些实施方案中，长度为10至60个核苷酸。在一些实施方案中，引物长度可以是例如15至50个核苷酸。短引物分子通常需要较冷的温度以与模板形成足够稳定的杂交复合物。引物不需要反映模板的精确序列，但必须充分互补以与模板杂交。
[0149]
如果引物或其一部分与另一种核酸内的核苷酸序列杂交，则称为引物与核酸退火。引物与特定核苷酸序列杂交的说法并不旨在暗示引物完全或仅与该核苷酸序列杂交。例如，在一些实施方案中，本文使用的扩增引物被称为“退火至”或“特异性针对”核苷酸序列。该描述包括完全退火至核苷酸序列的引物，以及部分退火至核苷酸序列的引物。
[0150]
术语“引物对”是指一组引物，其包括与待扩增的dna序列5’端互补物(complement)杂交的5
’“
上游引物”或“正向引物”，以及与待扩增的序列3’端杂交的3
’“
下游引物”或“反向引物”。如本领域技术人员将认识到的，术语“上游”和“下游”或“正向”和“反向”不旨在限制性，而是在一些实施方案中提供示例性方向。
[0151]“探针”是能够通过一种或多种类型的化学键(通常通过互补碱基配对，经常通过氢键形成)结合到互补序列的靶核酸上的核酸，从而形成双链体结构。探针可以用可检测的标记物标记，以允许轻易检测到探针，特别是一旦探针已杂交至其互补靶标。或者，所述探针可以是未标记的，但可以通过与被标记的配体直接或间接的特异性结合来检测。探针大小可能有明显差异。通常，探针的长度为至少7至15个核苷酸。其他探针的长度为至少20、30或40个核苷酸。还有其他探针更长一些，长度为至少50、60、70、80或90个核苷酸。还有其他探针更长且长度为至少100、150、200或多个核苷酸。探针还可以是上述值中任何值(例如长度为15-20个核苷酸)界定的任何范围内的任何长度。
[0152]
引物或探针可以与靶核苷酸序列完全互补或可以不完全互补。在一些实施方案中，引物靶核苷酸序列的互补物在至少7个核苷酸的序列上具有至少65％的序列同一性，更典型地在10至30个核苷酸的序列上，并且在一些实施方案中，在至少14至25个核苷酸的序列上，并且在一些实施方案中，具有至少75％的同一性、至少85％的同一性、至少90％的同
一性或至少95％、96％、97％、98％、99％的同一性。应当理解，某些碱基(例如引物的3’碱基)通常理想地与靶核苷酸序列的对应碱基完美互补。引物和探针通常在严格杂交条件下退火至靶序列。
[0153]
如在本文中用于引物的一部分或引物内的核苷酸序列时，术语“特异性针对”核酸，是指可以在合适的退火条件下可以特异性地退火至靶核酸的引物或核苷酸序列。
[0154]
根据本教导的扩增包括通常以模板依赖性方式复制至少一种靶核酸的至少一部分的任何方法，包括但不限于线性或指数扩增核酸序列的众多技术。用于进行扩增步骤的示例性手段包括pcr、基于核酸链的扩增(nasba)、两步多重扩增、滚环扩增(rca)等，包括多重形式及其组合，例如但不限于ola/pcr、pcr/ola、ldr/pcr、pcr/pcr/ldr、pcr/ldr、lcr/pcr、pcr/lcr(也称为联合链式反应
‑‑
ccr)、解旋酶依赖性扩增(hda)等。对此类技术的记载可以在其他来源中找到：ausubel et al.；pcr primer:a laboratory manual,diffenbach,ed.,cold spring harbor press(1995)；the electronic protocol book,chang bioscience(2002)；msuih et al.,j.clin.micro.34:501-07(1996)；the nucleic acid protocols handbook,r.rapley,ed.,humana press,totowa,n.j.(2002)；abramson et al.,curr opin biotechnol.1993feb.；4(1):41-7,u.s.pat.no.6,027,998；u.s.pat.no.6,605,451,barany et al.,pct publication no.wo 97/31256；wenz et al.,pct publication no.wo 01/112579；day et al.,genomics,29(1):152-162(1995),ehrlich et al.,science 252:1643-50(1991)；innis et al.,pcr protocols:a guide to methods and applications,academic press(1990)；favis et al.,nature biotechnology 18:561-64(2000)；和rabenau et al.,infection 28:97-102(2000)；belgrader,barany,and lubin,development of a multiplex ligation detection reaction dna typing assay,sixth international symposium on human identification,1995(available on the world wide web at:promega.com/geneticidproc/ussymp6proc/blegrad.html-)；lcr kit instruction manual,cat.#200520,rev.#050002,stratagene,2002；barany,proc.natl.acad.sci.usa 88:188-93(1991)；bi and sambrook,nucl.acids res.25:2924-2951(1997)；zirvi et al.,nucl.acid res.27:e40i-viii(1999)；dean et al.,proc natl acad sci usa 99:5261-66(2002)；barany and gelfand,gene 109:1-11(1991)；walker et al.,nucl.acid res.20:1691-96(1992)；polstra et al.,bmc inf.dis.2:18-(2002)；lage et al.,genome res.2003feb.；13(2):294-307和landegren et al.,science241:1077-80(1988),demidov,v.,expert rev mol diagn.2002nov.；2(6):542-8.,cook et al.,j microbiol methods.2003may；53(2):165-74,schweitzer et al.,curr opin biotechnol.2001feb.；12(1):21-7,u.s.pat.no.5,830,711,u.s.pat.no.6,027,889,u.s.pat.no.5,686,243,pct publication no.wo0056927a3和pct publication no.wo9803673a1。
[0155]
在一些实施方案中，扩增包括以下顺序步骤的至少一个循环：在至少一个靶核酸中退火至少一个具有互补或基本互补序列的引物；使用聚合酶以模板依赖性方式合成至少一条核苷酸链；以及使新形成的核酸双链体变性以分离链。循环可重复或可不重复。
[0156]“巢式扩增”是指使用多于两种引物来扩增靶核酸。
[0157]“半巢式扩增”是指使用多于一种(例如两种或三种)在靶核苷酸序列的一端退火
的引物。
[0158]“完全巢式扩增”是指使用多于一种在靶核苷酸序列的每一端退火的引物。
[0159]
关于巢式扩增，通过使用术语“内”、“外”和“中间”来区分在扩增子的一端退火的多种引物。
[0160]“外引物”是指这样的引物，其与在靶核苷酸序列的相同末端退火的另一种引物相比，退火到更靠近所述靶核苷酸序列的末端的序列。在一些实施方案中，外引物序列定义了从靶核酸产生的扩增子的末端。在本文中，“外引物”也被称为“侧翼引物”。
[0161]“内引物”是指这样的引物，其与在靶核苷酸序列的相同末端退火的另一种引物相比，退火到更靠近所述靶核苷酸序列的中间的序列。
[0162]
术语“中间引物”在本文中用于巢式扩增，在所述巢式扩增中，使用至少三种退火到靶核苷酸序列一端的引物。中间引物是退火到内引物和外引物之间的序列的引物。
[0163]
如本文使用的术语“与
…
相邻”用于指足够靠近以使所述方法起作用的序列。在一些实施方案中，彼此相邻的序列是直接相邻的，而没有插入的核苷酸。
[0164]“多重扩增反应”是其中可通过序列区分的两个或多个核酸被同时扩增的反应。
[0165]
本文使用术语“qpcr”以指定量实时聚合酶链式反应(pcr)，其也称为“实时pcr”或“动态聚合酶链式反应”；所有术语是指具有实时信号检测的pcr。
[0166]“试剂”在广义上是指在反应中使用的除分析物(例如，被分析的核酸)以外的任何试剂。核酸扩增反应的示例性试剂包括但不限于缓冲液、金属离子、聚合酶、逆转录酶、引物、模板核酸、核苷酸、标记、染料、核酸酶、dntp等。用于酶反应的试剂包括例如底物、辅因子、缓冲液、金属离子、抑制剂和激活剂。
[0167]
本文使用的术语“标记物”是指可用于提供可检测和/或可定量信号的任何原子或分子。具体地，标记物可直接或间接连接至核酸或蛋白。可连接至探针的适合的标记物包括但不限于放射性同位素、荧光团、生色团、质量标记物、电子致密颗粒、磁性颗粒、自旋标记物、发射化学发光的分子、电化学活性分子、酶、辅因子和酶底物。
[0168]
本文使用的术语“染料”通常指吸收电磁辐射的任何有机或无机分子。
[0169]
构成dna和rna的天然碱基腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶在本文中被描述为“未修饰的碱基”或“未修饰的形式”。
[0170]
本文使用的术语“修饰的碱基”是指不是标准的天然存在的碱基(例如，腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶)的碱基。修饰的碱基的实例是2-硫代胸腺嘧啶和2-氨基腺嘌呤。
[0171]
包含经修饰的碱基的核苷酸在本文中称为“修饰的核苷酸”。
[0172]
如果dna聚合酶在核酸扩增反应中提供令人满意的延伸速率，则称其在该特定温度下是“稳定的”。
[0173]
术语“循环探针”，其在与靶核酸序列退火后可被酶裂解，其中这种裂解释放出完整的目标核酸。循环探针使靶核酸与探针的许多分子退火，由此扩增与探针相关的任何信号。
[0174]
用于增加扩增效率和增强靶核酸检测的一般方法
[0175]
本公开内容将循环探针(如rnase h2循环探针)的用途与特定引物组的用途相结合，以增强扩增效率和靶核酸的检测。设计引物组以实现使每个扩增循环的扩增产物至少
增加3倍。所述引物包括经修饰的碱基，所述碱基与它们的未修饰的互补碱基配对，但不与它们的经修饰的互补序列配对。经修饰的碱基的包括倾向于减少使用这些引物组的每个扩增循环所需的时间。现已证明，循环探针可与该系统一起使用，以扩大扩增信号，进一步增强靶核酸的检测，特别是低拷贝数核酸的检测。
[0176]
美国专利8,252,558和harris et al.,biotechniques 54:93-97(2013年2月)教导了巢式pcr形式，称为“聚合酶链置换反应”(pcdr)(这两篇文件的描述均以引用的方式纳入本文)。在pcdr中，当延伸从外引物发生时，外引物置换从内引物产生的延伸链，因为所述反应使用了具有链置换活性的聚合酶。理论上，这允许每个扩增循环的扩增产物的增加大于2倍，因此灵敏性和速度相对于常规pcr增加。实际上，从巢式引物产生的每个扩增子不再包含外引物的引物退火位点。因此，pcdr无法在非常多的循环中维持每个扩增循环的扩增产物的增加大于2倍。为此，pcdr仅提供检测靶核酸所需的扩增循环数的适度减少(例如从约23至约20)。相比之下，下表1示出每个循环的持续四倍化(4
循环数
)应将使具有相同扩增所需的循环数减半，因为每个循环均加倍。每个循环持续的6倍重复应在15个循环中实现，其需要40个正常pcr循环。
[0177]
表1——具有不同“基数”的扩增程度
[0178][0179]
维持每个扩增循环的扩增产物的增加大于2倍的关键是设计内(巢式)引物，以使内(巢式)引物的延伸产物包含外(侧翼)引物序列。图1示出了使用正向内和外引物以及反向内和外引物进行的完全巢式pcr的方案。在内引物退火到模板时形成的“瓣状(flap)”包含外引物序列，以使得从两条模板链产生的四条新链中的每一条从(并包含)正向外引物序列(或其互补序列)延伸通过(并包含)反向外引物序列。然而，需要的不只是简单地将外引
物序列添加到内引物的5’端，因为当内引物退火时，所添加的序列也将立即退火并阻止外引物退火。这个问题的解决方案是使用内引物的额外5’添加物(add-on)(即除外引物序列以外的序列)以及与这两个序列互补的寡核苷酸，其在本文中称为“夹子”。为了便于讨论，添加的序列被称为“夹持序列”。该构型如图2所示。
[0180]
夹持序列c与模板(d’区域)不同源。本文中c-a/c
’‑
a’比a-b/a
’‑
b’更稳定。在一些实施方案中，这可通过使用序列c来实现，该序列c相对于a更长、富含gc(即比a更富含gc)、或包含一个或多个稳定的碱基(当a不包含这类碱基时)或比a中更多的稳定的碱基。在一些实施方案中，这可通过使用序列c来实现，该序列c相对于b更长、富含gc(即比b更富含gc)、或包含一个或多个稳定的碱基(当b不包含这类碱基时)或比b中更多的稳定的碱基。在一些实施方案中，稳定的碱基可被包含在c-a-b的a区，以及在c
’‑
a’的a’区以增加c-a/c
’‑
a’相对于a-b/a
’‑
b’的稳定性。可选地或额外地，b可包含一个或多个不稳定的碱基，例如肌苷。外引物保留序列a。在这种情况下，外引物仍然可接触模板中的序列a’。内引物的c
’‑
a’夹子和5’端将在比任何其他序列更高温度下快速地退火，因此c
’‑
a’夹子不必连接至内引物以形成发夹结构。然而，在一些实施方案中，使用具有这种类型的发夹结构的内引物可增加反应速度。
[0181]
在一些实施方案中，内引物中的c序列优选地不在pcr过程中复制。如果它在pcr过程中复制，则这些新模板将具有c
’‑
a’尾，其将与内引物一起产生c-a-b/c
’‑a’‑
b’双链体，所述双链体会在链置换竞争中“胜过”其他可能的结构并且再次阻止侧翼引物序列a退火。为了阻止这种复制，可从dna聚合酶不能很好复制的rna(或2
’‑
o-甲基rna，其相对易于通过合成方法来制备)制备序列c。序列c可从能够碱基配对、但不能够被复制的任何碱基来制备。
[0182]
在一些实施方案中，夹持寡核苷酸(a
’‑
c’)被阻断3’端延伸(blocked to extension at the 3’end)，例如由于缺少3’羟基或使用化学阻断基团，这可提高扩增的特异性。
[0183]
样品
[0184]
可使用本领域中已知的常规方法从生物来源获得并制备包含核酸的样品。特别地，可用于本文所述方法的核酸可从任何来源获得，包括单细胞生物和高等生物，如植物或非人动物，例如犬、猫、马、灵长类动物和其他非人哺乳动物，以及人。在一些实施方案中，可从疑似或已知感染病原体的个体、疑似患有或已知患有疾病(例如癌症)的个体或妊娠个体获得样品。
[0185]
核酸可以通过多种标准技术中的任一种从细胞、体液(例如，血液、血液级分、尿液等)或组织样品获得。在一些实施方案中，所述方法采用血浆、血清、脊髓液、淋巴液、腹膜液、胸膜液、口腔液和皮肤的外切片的样品；来自呼吸道、肠道生殖道(intestinal genital)或泌尿道的样品；眼泪、唾液、血细胞、干细胞或肿瘤的样品。样品可以从活或死的生物或从体外培养物中获得。示例性的样品可包括单细胞、石蜡包埋的组织样品和针吸活组织检查样品。在一些实施方案中，所分析的核酸获自单细胞。
[0186]
可以使用本领域所公知的方法分离目的核酸。样品核酸不需要为纯的形式，但是通常足够纯以允许进行本文所述方法的步骤。
[0187]
靶核酸
[0188]
可以通过核酸扩增检测的任何靶核酸都可以使用本文所述的方法检测。在典型的实施方案中，靶核酸的至少一些核苷酸序列信息是已知的。例如，如果所采用的扩增反应是pcr，通常可获得给定靶核酸的每个末端的足够的序列信息，以允许设计适合的扩增引物。
[0189]
靶标可包括例如与病原体(例如病毒、细菌、原生动物或真菌)相关的核酸；rna，例如其过表达或表达不足指示疾病的那些rna，以组织特异性方式或发育特异性方式表达的那些rna；或由特定刺激物诱导的那些；基因组dna，可以分析其中的特定多态性(例如snp)、等位基因或单倍型，例如在基因分型中。特别感兴趣的是在遗传疾病或其他病理中改变(例如扩增、缺失和/或突变)的基因组dna；与期望或不期望的性状相关的序列；和/或唯一识别个体的序列(例如在法医学中或亲子鉴中)。
[0190]
引物设计
[0191]
适用于核酸扩增的引物足够长，以在合适的核酸聚合酶存在下引发延伸产物的合成。引物的精确长度和组成将取决于许多因素，包括例如退火反应的温度、引物的来源和组成、以及在使用探针的情况下，探针退火位点与引物退火位点的邻近度，以及引物:探针浓度的比率。例如，根据靶核酸序列的复杂性，寡核苷酸引物通常包含约10至约60个核苷酸，尽管其可能包含更多或更少的核苷酸。引物应当充分互补以选择性地退火到它们各自的链并形成稳定的双链体。
[0192]
通常，本领域技术人员知晓如何设计能够扩增目的靶核酸的合适的引物。例如，可通过使用任何市售可得的软件或开源软件如primer3(参见例如rozen and skaletsky(2000)meth.mol.biol.,132:365-386；www.broad.mit.edu/node/1060等)，或通过访问roche upl网站来设计pcr引物。将扩增子序列输入到primer3程序中，其中upl探针序列在括号中以保证primer3程序会在括号中的探针序列的任一侧上设计引物。
[0193]
引物可以通过任何合适的方法制备，包括例如通过下列方法进行的直接化学合成：例如narang et al.(1979)meth.enzymol.68:90-99的磷酸三酯法、brown et al.(1979)meth.enzymol.68:109-151的磷酸二酯法、beaucage et al.(1981)tetra.lett.,22:1859-1862的二乙基亚磷酰胺法、美国专利4,458,066的固体载体法等，或者可以由商业来源提供。引物可以通过使用sephadex柱(amersham biosciences,inc.,piscataway,nj)或本领域技术人员已知的其他方法纯化。引物纯化可提高本文所述方法的灵敏性。
[0194]
外引物
[0195]
图2示出了双引物组如何退火到靶核苷酸序列一端的第一模板链。为了便于讨论，该引物组可被认为是“正向”引物组。外引物包含与第一模板链序列a’特异性杂交的序列a。图3示出了双引物组如何退火到靶核苷酸序列相反端的第二模板链。为了便于讨论，该引物组可被认为是“反向”引物组。在此处，外引物包含与第一模板链序列e’特异性杂交的序列e。图4和5示出了示例性的“正向”和“反向”三引物组。在图4中，正向外引物包含与第一模板链序列d’特异性杂交的序列d。在图5中，正向外引物包含与第一模板链序列d’特异性杂交的序列d。通常，设计适合的外引物的考虑因素与设计用于常规巢式pcr的外引物的那些并无差异。值得注意的是，在一些实施方案中，相对于另一引物序列(例如内引物序列或中间引物序列)为“外”的任何引物序列的tm优选地比内(或中间)引物序列的tm更低。因此，例如，在pcr的下降温度斜坡过程中，内引物可退火并在外引物之前开始延伸；或者外引物的提前延伸将阻断内引物的靶位点并阻止内引物退火。更具体地，在图2中所示的实施方案中，引
物序列a将具有低于引物序列b的tm的tm。类似地，在图3中所示的实施方案中，引物序列e将具有低于引物序列f的tm的tm。在一些实施方案中，tm差异为至少约4℃，通常范围为约4℃至约20℃。在一些实施方案中，tm差异范围为约4℃至约15℃。然而，外引物的tm通常足够高以保持高效pcr，例如在一些实施方案中，外引物的tm为至少40℃。可通过调节序列长度、g-c含量和/或通过在序列中包含稳定或不稳定的碱基来调节tm。
[0196]“稳定的碱基”包括，例如，可被掺入到dna寡核苷酸中以增加双链体稳定性的肽核酸(pna)区段(stretch)。锁核酸(lna)和解锁核酸(una)是rna的类似物，其可以在固相寡核苷酸合成过程中被容易地掺入dna寡核苷酸中，并分别增加和降低双链体稳定性。适合的稳定的碱基也包括经修饰的dna碱基，其增加了碱基对(并因此增加双链体整体)的稳定性。这些经修饰的碱基可以在固相合成过程中被掺入寡核苷酸中，并且提供更加可预测的增加dna双链体稳定性的方法。实例包括ap-dc(g-夹)和2-氨基腺嘌呤以及5-甲基胞嘧啶和c(5)-丙炔基胞嘧啶(替代胞嘧啶)和c(5)-丙炔基尿嘧啶(替代胸腺嘧啶)。
[0197]“不稳定碱基”是那些通过形成与典型a-t和/或g-c碱基对相比更不稳定的碱基对而使双链dna不稳定的碱基。肌苷(i)是不稳定的碱基，因为其与胞嘧啶(c)配对，但是i-c碱基对不如g-c碱基对稳定。这种较低的稳定性是由于以下事实导致的：与g-c碱基对的三个氢键相比，肌苷是仅能够形成两个氢键的嘌呤。本领域技术人员已知或容易识别其他不稳定碱基。
[0198]
双引物组的内引物
[0199]
参考图2，正向双引物组中的内引物包含单链引物序列b，其与第一模板链序列b’特异性杂交，其中b’与a’相邻并且是a’的5’，并且其中单链引物序列b在其5’端连接至双链引物序列的第一链。该第一链包含：引物序列a，其与单链引物序列b相邻并且是单链引物序列b的5’；和夹持序列c，其与引物序列a相邻并且是引物序列a的5’，其中夹持序列c不与第一链模板序列d’互补，该序列d’与第一链模板序列a’相邻并且是第一链模板序列a’的3’。在一些实施方案中，双链形式的联合序列c-a(本文中用连字符来表示由序列c和a组成的联合核酸序列)(即c-a/c
’‑
a’)的tm高于双链形式的联合序列a-b(即a-b/a
’‑
b’)的tm。这易于通过以下方式实现，例如通过制备比联合序列a-b更长和/或更富含gc的联合序列c-a，和/或设计联合序列c-a以包含比联合序列a-b更多稳定的碱基(“更多”要求包括其中序列a-b不包含g-c碱基对和/或不包含稳定的碱基的情况)。可选地或额外地，可设计联合序列a-b以包含比联合序列c-a更多不稳定的碱基(“更多”要求包括其中序列c-a不包含不稳定的碱基的情况)。在一些实施方案中，a
’‑
c’被阻断其3’端延伸。
[0200]
正向双引物组可与用于半巢式扩增的简单的常规反向引物或与反向双引物组一起使用。
[0201]
参考图3，反向双引物组中的内引物包含单链引物序列f，其与第一模板链序列f’特异性杂交，其中f’与e’相邻并且是e’的5’，并且其中单链引物序列f在其5’端连接至双链引物序列的第一链。该第一链包含：引物序列e，其与单链引物序列f相邻并且是单链引物序列f的5’；和夹持序列g，其与引物序列e相邻并且是引物序列e的5’，其中夹持序列g不与第一链模板序列h’互补，该序列h’与第一链模板序列e’相邻并且是第一链模板序列e’的3’。在一些实施方案中，双链形式的联合序列g-e(即g-e/g
’‑
e’)的tm高于双链形式的联合序列e-f(即e-f/e
’‑
f’)的tm。这易于通过以下方式实现，例如通过制备比联合序列e-f更长和/
或更富含gc的联合序列g-e，和/或设计联合序列(双链形式的联合序列g-e的tm高于双链形式的联合序列e-f的tm)以比联合序列e-f包含更多稳定的碱基(“更多”要求包括其中序列e-f不包含g-c碱基对和/或不包含稳定的碱基的情况)。可选地或额外地，可设计联合序列e-f以比联合序列g-e包含更多不稳定的碱基(“更多”要求包括其中序列g-e不包含不稳定的碱基的情况)。在一些实施方案中，e
’‑
g’被阻断其3’端延伸。
[0202]
在一些实施方案中，夹持序列c和g(如果存在)不能在扩增期间被复制。rna或rna类似物(例如抗水解的rna类似物)可用于提供所需的碱基对以形成双链夹持序列，而不在扩增期间被dna依赖性聚合酶复制。最常见的rna类似物是2
’‑
o-甲基取代的rna。可特异性地进行碱基配对但是无法被复制的其他核酸类似物包括锁核酸(lna)或bna(桥接核酸)、吗啉代和肽核酸(pna)。尽管这些寡核苷酸具有不同的骨架糖，或在pna的情况下，具有替代磷酸核糖的氨基酸残基，但它们仍然按照watson和crick配对结合至rna或dna，但是不受核酸酶活性的影响。它们无法通过酶法来合成，只能使用亚磷酰胺策略通过合成获得，或对于pna，通过肽合成法获得。
[0203]
如果需要，夹持序列c可共价连接至互补序列c’，以使得从发夹结构形成a-c/a-c’；然而，这对于高效形成引物的双链夹持部分而言并不是必需的。类似地，夹持序列g能够但不需要共价连接至互补序列g’以使得从发夹结构形成e-g/e
’‑
g’。
[0204]
三引物组的引物
[0205]
在一些实施方案中，可在靶核酸序列的一端或两端使用第三引物以进一步增加在每个扩增循环中产生的拷贝数。图4和图5示出了示例性的“正向”和“反向”三引物组。三引物组包括如上文所讨论的外引物和在结构上与上文讨论的内引物基本上相同的中间引物。额外的引物是内引物，其被设计以与中间引物的模板链5’杂交。
[0206]
正向三引物组中的内引物包含与第一模板链序列b’特异性杂交的单链引物序列b，其中b’与a’相邻并且是a’的5’。单链引物序列b在其5’端连接至双链引物序列的第一链，所述第一链包含：引物序列a，其与单链引物序列b相邻并且是单链引物序列b的5’；引物序列d，其与引物序列a相邻并且是引物序列a的5’；和夹持序列c2，其与引物序列d相邻并且是引物序列d的5’，其中夹持序列c2不与第一链模板序列i’互补。夹持序列c2可以与内引物中使用的夹持序列(c1)相同或不同。在优选的实施方案中，c1和c2是不同的序列。如上文针对双引物组中的内引物所讨论的，类似的考虑因素适用于三引物组中的内引物的设计，并且反向三引物组(图5中所示)的内引物具有与正向三引物组中的内引物相同的结构。一种或多种(或全部)夹持寡核苷酸(图4中的d
’‑
c1’和a
’‑d’‑
c2’，以及图5中的h
’‑
g1’和e
’‑h’‑
g2’)可被阻断其3’端延伸。正向三引物组可与用于半巢式扩增的简单的常规反向引物一起使用，与反向双引物组一起使用，或与反向三引物组一起使用。
[0207]
在一些实施方案中，基于引物序列的tm来控制引物退火和延伸的次序，以使得相对于另一引物是“内”的任何引物在该另一引物之前退火并开始延伸。因此，例如，在双引物组中，内引物在外引物之前退火并开始延伸，并且在三引物组中，内引物在中间引物之前退火并开始延伸，中间引物在外引物之前退火并开始延伸。例如，在图4中所示的实施方案中，引物序列的tm将具有以下关系：d的tm《a的tm《b的tm。在图5中所示的实施方案中，引物序列的tm将具有以下关系：h的tm《e的tm《f的tm。如上文指出，tm是序列长度、c-g含量和任选存在的稳定和/或不稳定的碱基的函数。
[0208]
可基于上文讨论的原则来设计其他巢式引物。
[0209]
在引物中使用经修饰的碱基
[0210]
图9在该图的上图示出了用于基数-3扩增的期望的引物退火构型，而在下图示出了不会产生基数-3扩增的替代引物退火构型。为了进行高效基数-3扩增，上图构型应比下图构型更稳定。实现此目的的一种方法是设计引物，以使得双链形式的联合序列c-a(即c-a/c
’‑
a’)的tm高于双链形式的联合序列a-b(即a-b/a
’‑
b’)的tm。如图9所示，在这些引物中修饰的碱基的使用提供了一种新的用于增强这种稳定性差异的方法。a*和t*碱基被修饰，使得每个修饰的碱基与天然(标准的)互补碱基形成稳定的氢键键合的碱基对，但不与其修饰的互补碱基形成稳定的氢键键合的碱基对。这确保了下图的引物退火构型的稳定性明显低于上图的引物退火构型。图9中指向上方的较大箭头指示，由于上图的构型具有更多的双链体结构，因此上图的期望构型比不期望构型更稳定。实际上，修饰的碱基在其与其天然互补体的配对方面是稳定的，但是在其与其修饰的互补体的配对方面则是不稳定的。
[0211]
在本文所述的引物组中使用经修饰的碱基的优点是，与不包括经修饰的碱基的相同引物组的每个循环的时间相比，其减少了完成每个扩增循环所需的时间量。在各种实施方案中，如本文所述在引物中使用经修饰的碱基可以将每个循环的时间减少例如10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％或以上。循环时间百分比减少可以落入由任意这些值界定的范围内，例如10-95％、20-95％、30-95％、40-95％、50-95％、60-95％、70-95％、80-95％、85-95％、10-90％、20-90％、30-90％、40-90％、50-90％、60-90％、70-90％、80-90％、85-90％、10-85％、20-85％、30-85％、40-85％、50-85％、60-85％、70-85％、80-85％等。
[0212]
下一部分详细描述适用于引物的经修饰的碱基。本部分的其余内容描述了在上文讨论的各种实施方案中本文所述引物中修饰的碱基的定位。
[0213]
具有经修饰的碱基的双引物组
[0214]
图9(上图构型)示出了具有经修饰的碱基的双引物组如何退火至靶核苷酸序列的一端的第一模板链。该引物组的设计与图2所示的相同。为便于讨论，可以将该引物组视为“正向”引物组。外引物包括与第一模板链序列a’特异性杂交的序列a。在经修饰的碱基的实施方案中，引物序列a可以包括一个或多个第一经修饰的碱基。如果引物序列a包括一个以上的第一经修饰的碱基，则第一经修饰的碱基可以相同或不同(在本文中使用术语“第一”、“第二”、“第三”等是为了便于讨论，但并不意味着所有第一、第二或第三经修饰的碱基都相同)。
[0215]
如在图2中，图9的引物组包括具有双链部分的内引物，该双链部分的一条链包含引物序列c’，其与引物序列a’相邻并且是引物序列a’的3’，其中联合序列c
’‑
a’与联合序列c-a互补。在经修饰的碱基的实施方案中，引物序列a’可包括一个或多个第二经修饰的碱基。外引物序列a中的修饰的碱基是互补序列，并且位于会允许它们与内引物(引物序列a’)第二条链中的经修饰的碱基进行碱基配对的位置。然而，因为是互补的，修饰的碱基不以稳定的方式进行碱基配对(相对于它们的未修饰形式)，所以不期望的引物退火构型的形成是不利的(图9中下图构型)。
[0216]
图3示出了双引物组如何退火至靶核苷酸序列相对端的第二模板链。为了便于讨
论，可以将该引物组视为“反向”引物组。此处，外引物包括与第一模板链序列e’特异性杂交的序列e。在经修饰的碱基的实施方案中，引物序列e可以包括一个或多个第三经修饰的碱基。
[0217]
图3的引物组还包括具有双链部分的内引物，该双链引物序列的第二链包括与引物序列e’相邻并且是引物序列e’的3’的引物序列g’，其中联合序列g
’‑
e’与联合序列g-e互补。在经修饰的碱基的实施方案中，引物序列e’可以包括一个或多个第四经修饰的碱基。外引物序列e中的经修饰的碱基是互补序列，并且位于会允许它们与内引物(引物序列e’)第二链中的修饰的碱基进行碱基配对的位置。然而，因为是互补的，修饰的碱基不以稳定的方式进行碱基配对(相对于它们的未修饰形式)，所以不期望的引物退火构型(图9中下图构型)的形成是不利的。
[0218]
具有经修饰的碱基的三引物组
[0219]
图4和5示出了示例性的“正向”和“反向”三引物组，其也可以设计为具有修饰的碱基。参照图4中的正向引物组，在经修饰的碱基的实施方案中，外引物的引物序列d可以包括一个或多个第一经修饰的碱基。
[0220]
中间引物具有单链部分和双链部分。单链部分包括引物序列a，其可以包含一个或多个第二经修饰的碱基。双链部分包括这样一条链，该链包括与引物序列d’相邻并且是引物序列d’的3’的引物序列c1’，其中联合序列c1
’‑
d’与联合序列c1-d互补。在经修饰的碱基的实施方案中，引物序列d’可以包括一个或多个第三经修饰的碱基。
[0221]
内引物也具有单链部分和双链部分。双链部分包括这样一条链，该链包括与引物序列d’相邻并且是引物序列d’的3’的引物序列c2’，所述引物序列d’与引物序列a’相邻并且是引物序列a’的3’，其中联合序列c2
’‑d’‑
a’与联合序列c2-d-a互补。在经修饰的碱基的实施方案中，引物序列a’可以包括一个或多个第四经修饰的碱基。
[0222]
第一和第三经修饰的碱基是互补序列，并且处于会允许它们碱基配对的位置，但是所述修饰不鼓励这种配对，而有利于与它们的天然的、未修饰的互补序列进行碱基配对。类似地，第二和第四经修饰的碱基是互补序列，并且处于会允许它们碱基配对的位置，但是所述修饰不鼓励这种配对，而有利于与它们的天然的、未修饰的互补序列进行碱基配对。
[0223]
参考图5中的反向引物组，在经修饰的碱基的实施方案中，外引物的引物序列h可以包括一个或多个第五经修饰的碱基。
[0224]
中间引物具有单链部分和双链部分。单链部分包括引物序列e，其可以包含一个或多个第六经修饰的碱基。双链部分包括这样一条链，该链包括与引物序列h’相邻并且是引物序列h’的3’的引物序列g1’，其中联合序列g1
’‑
h’与联合序列g1-h互补。在经修饰的碱基的实施方案中，引物序列h’可以包括一个或多个第七经修饰的碱基。
[0225]
内引物也具有单链部分和双链部分。双链部分包括这样一条链，该链包括与引物序列h’相邻并且是引物序列h’的3’的引物序列g2’，所述序列h’与引物序列e’相邻并且是引物序列e’的3’，其中联合序列g2
’‑h’‑
e’与联合序列g2-h-e互补。在经修饰的碱基的实施方案中，引物序列a’可以包括一个或多个第八经修饰的碱基。
[0226]
第五和第七经修饰的碱基是互补序列，并且处于会允许它们碱基配对的位置，但是所述修饰不鼓励这种配对，而有利于与它们的天然的、未修饰的互补序列进行碱基配对。类似地，第六和第八经修饰的碱基是互补序列，并且处于会允许它们碱基配对的位置，但是
所述修饰不鼓励这种配对，而有利于与它们的天然的、未修饰的互补序列进行碱基配对。
[0227]
修饰的碱基
[0228]
可用于本文所述的引物中的修饰的碱基包括其中修饰的碱基与天然互补碱基形成稳定的氢键键合的碱基对，但不与其修饰的互补碱基形成稳定的氢键键合的碱基对的那些(为便于讨论，互补碱基在本文中也称为“配对体”(partner))。在一些实施方案中，当修饰的碱基可以与其天然配对体形成两个或多个氢键，但是与其修饰的配对体仅形成一个氢键或不形成氢键时，就实现了这一点。这允许产生引物对，这它们彼此之间不形成基本上稳定的氢键键合杂交体，如在低于约40℃的解链温度(在生理或基本生理条件下)中所显示的。然而，引物对的引物与单链或双链靶核酸的模板链(例如，第一模板链)中的互补核苷酸序列以及与模板链互补的链(例如，第二个模板链)形成基本稳定的杂交体。在一些实施方案中，由于此类杂交体中氢键数目的增加(在一些实施方案中为两倍)，因此与使用具有未经修饰的碱基的引物形成的杂交体相比，用本发明的引物形成的杂交体更稳定。
[0229]
根据公认的惯例，核酸中天然存在的核苷酸的名称为a、u、g和c(rna)以及da、dt、dg和dc(dna)。下文描述适用于核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸，因此，除非上下文另有要求，否则在本说明书中无需在a和da、u和dt等之间进行区分。
[0230]
在碱基部分中被修饰以与t(或在rna的情况下为u)而不与修饰的t形成稳定的氢键键合对的a的类似物被称为a*。在碱基部分中被修饰以与a而不与a*形成稳定的氢键键合对的t的类似物被称为t*。在碱基部分中修饰以与c而不与修饰的c形成稳定的氢键键合对的g的类似物被称为g*。在碱基部分中修饰以与g而不与g*形成稳定的氢键键合对的c的类似物称为c*。在一些实施方案中，当a*、t*、g*和c*核苷酸(统称为修饰的核苷酸)中的每一个与它们的天然配对体形成两个或多个氢键，但与它们的修饰的配对体仅形成一个氢键或不形成氢键时，满足前述条件。这由下文的式1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a和4b(以及在图8a-8b中)举例说明，其中举例说明了天然a-t(在rna的情况中为a-u)和g-c对之间的氢键键合，以及示例性的a*-t、t*-a、g*-c、c*-g、a*-t*和g*-c*对之间的氢键键合。
[0231]
[0232][0233]
通常，与引物-至-引物退火相比，将足够数量的修饰的核苷酸掺入本文所述的引物中以优先增加引物向靶核酸的模板链的退火。为实现这一点，不必用修饰的核苷酸替换
引物的每个天然核苷酸。在一些实施方案中，除了一个或多个修饰的核苷酸外，引物还包括一个或多个天然存在的核苷酸和/或天然存在的核苷酸的变体，条件是所述变异不显著干扰引物的互补结合能力，如上文所讨论。例如，包括修饰的核苷酸的引物可以包括戊基呋喃糖部分而非核糖或2-脱氧核糖，以及核糖和2-脱氧核糖的衍生物，例如3-氨基-2-脱氧核糖、2-氟-2-脱氧核糖，以及2-o-c
1-6
烷基或2-o-烯丙基核糖，特别地是2-o-甲基核糖。糖苷键可以为α或β构型。如果需要，引物的磷酸酯骨架可以包括硫代磷酸酯键。
[0234]
下文的式5、6和7提供了合适类别的修饰的a类似物a*的一般结构，显示为掺入引物中的3'-磷酸酯(或硫代磷酸酯)，其中：
[0235]
x是n或ch；
[0236]
y是o或s；
[0237]
z是oh或ch3；
[0238]
r是h、f或or2，其中r2是c
1-6
烷基或烯丙基，或在rna的情况下是h；且
[0239]
r1是c
1-4
烷基、c
1-4
烷氧基、c
1-4
烷硫基、f或nhr3，其中r3是h或c
1-4
烷基。a*的示例性实施方案以2,6-二氨基嘌呤(2-氨基腺嘌呤)作为碱基，如式1b所示。如果适用，后一个核苷酸可以缩写为2-ama或d2-ama。
[0240]
[0241][0242]
式8提供了合适种类的修饰的t类似物t*的一般结构，显示为掺入引物中的3'-磷酸酯(或硫代磷酸酯)，其中：
[0243]
y、z和r如上定义；且
[0244]
r4是h、c
1-6
烷基、c
1-6
烯基或c
1-6
炔基。t*的示例性实施方案具有2-硫代-4-氧代-5-甲基嘧啶(2-硫代胸腺嘧啶)作为碱基，如式2b所示。如果适用，后一个核苷酸可以缩写为2-st或d2-st。
[0245][0246]
式9、10和11提供了合适种类的修饰的g类似物g*的一般结构，显示为掺入引物中的3'-磷酸酯(或硫代磷酸酯)，其中：
[0247]
r1为h、c
1-4
烷基、c
1-4
烷氧基、c
1-4
烷硫基、f或nhr3，其中r3如上定义；且
[0248]
x、y、z和r如上定义。g*的示例性实施方案具有6-氧代-嘌呤(次黄嘌呤)作为碱基，如式3b所示。如果适用，后一个核苷酸可以缩写为i或di。
[0249][0250]
式12和13提供了合适种类的修饰的c类似物c*的一般结构，显示为掺入引物中的3'-磷酸酯(或硫代磷酸酯)，其中：
[0251]
y、z、r和r4如上定义；
[0252]
z1是o或nh；且
[0253]
r5是h或c
1-4
烷基。c*的示例性实施方案具有吡咯并-[2,3-d]嘧啶-2(3h)-酮作为
碱基，如式4b所示。如果适用，后一个核苷酸可以缩写为p或dp。
[0254]
上述修饰的碱基和核苷酸也记载于美国专利5,912,340(1999年6月15日授权给kutyavin等人)中，其描述通过引用的方式纳入本文。d2-ama和d2-st的杂交特性记载于kutyavin et al.(1996)biochemistry 35:11170-76中，其描述也通过引用的方式纳入本文。di和dp的合成和杂交特性记载于woo et al.(1996)nucleic acids research 25(13):2470-75中，其描述也通过引用的方式纳入本文。
[0255]
g*和c*的其他实例分别包括7-烷基-7-脱氮鸟嘌呤和n
4-烷基胞嘧啶(其中烷基＝甲基或乙基)，其记载于lahoud et al.(2008)nucleic acids research 36(10):3409-19(其描述通过引用的方式纳入本文)。该研究中测试的类似物如式12所示。
[0256]
式12
[0257][0258]
g*和c*的其他实例分别包括7-硝基-7-脱氮次黄嘌呤(nitroch)和2-硫代胞嘧啶(sc)，其记载于lahoud et al.(2008)nucleic acids research 36(22):6999-7008(其描述通过引用的方式纳入本文)。hoshinka et al.(2010)angew chem int ed engl.49(32):5554-5557记载了这种碱基的使用(self-avoiding molecular recognition systems)，包括作为g*的2
’‑
次黄嘌呤(该参考文献的描述通过引用的方式纳入本文；尤其参见图1)；也参见yang et al.(2015)chembiochem.16(9):1365-1367(该参考文献的描述通过引用的方式纳入本文；尤其参见方案1)。该研究中测试的类似物示出于式13中。
[0259]
式13
[0260][0261]
聚合酶
[0262]
本公开的方法使用聚合酶进行扩增。在一些实施方案中，聚合酶是缺少5’至3’外切核酸酶活性的dna聚合酶。在这样的条件下使用所述聚合酶以使得从第一引物延伸的链可通过从第二引物延伸的正在形成的链的聚合而被置换，所述第二引物相对于第一引物是在“外”。方便地，聚合酶能够置换与模板链互补的链，该特性被称为“链置换”。链置换导致每个模板分子合成多拷贝的靶序列。在一些实施方案中，用于本公开的方法中的dna聚合酶是高度进行性的(processive)。示例性的dna聚合酶包括缺少5’至3’外切核酸酶活性的taq dna聚合酶的变体，例如taq dna聚合酶的stoffel片段(abi)、sd聚合酶(bioron)、uspn 5474920中所述的缺少5’至3’外切核酸酶活性的突变taq、bca聚合酶(takara)、pfx50聚合酶(invitrogen)、tfu dna聚合酶(qbiogene)。如果将进行热循环(如在pcr中)，则dna聚合酶优选地为热稳定的dna聚合酶。下表2列出了不具有5’至3’外切核酸酶活性，但是具有伴随热稳定性的链置换活性的聚合酶。
[0263]
在一些实施方案中，使用两种或多种聚合酶的共混物(blend)可以是有利的。例如，示例性的聚合酶共混物包括特别擅长从部分双链dna引物开始延伸的聚合酶和特别擅长链置换合成的聚合酶，因为在一些实施方案中结合这些特性可以提供净优势。替代地或额外地，在需要使用taqman型探针进行实时pcr的情况下，聚合酶混合物可以包括具有5’至3’核酸外切酶活性的聚合酶，只要设计引物结构以使得其不易受“瓣状(flap)”核酸内切酶活性的影响；实际上，由于所述“瓣状”的双链性质，本文所述的结构可能固有地不易受到该活性的影响。taq dna聚合酶可以例如用于这样的聚合酶共混物，尽管taq dna聚合酶被描述为包括5’至3’核酸外切酶活性，但taq dna聚合酶起作用的方式更像瓣状核酸内切酶。
[0264]
表2—缺少5’至3’外切核酸酶活性的热稳定的链置换聚合酶
[0265][0266]
在一些实施方案中，dna聚合酶包含taq聚合酶和拓扑异构酶的一部分之间的融合物，例如topotaq
tm
(fidelity systems,inc.)。
[0267]
例如，对于sd聚合酶，示例性聚合酶浓度范围为每个反应约20至200单位。在各种实施方案中，聚合酶浓度可以至少为：每个反应10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200或更多单位。在一些实施方案中，聚合酶浓度落入任意这些值所界定的范围内，例如，每个反应10-200、10-150、10-100、10-50、20-150、20-100、20-50、50-200、50-150、50-100、100-200、100-150等单位。当使用聚合酶共混物时，总的聚合酶浓度可以是任意这些值或落入任意这些范围中。
[0268]
也可通过使用链置换因子(例如解旋酶)来促进链置换。在存在链置换因子的情况下能够进行链置换的任何dna聚合酶适用于所公开的方法，即使dna聚合酶在不存在这样的因子的情况下不进行链置换。可用于本文所述方法的链置换因子包括bmrf1聚合酶辅助亚基(tsurumi et al.,j.virology 67(12):7648-7653(1993))、腺病毒dna结合蛋白(zijderveld and van der vliet,j.virology 68(2):1158-1164(1994))、单纯疱疹病毒蛋白icp8(boehmer and lehman,j.virology 67(2):711-715(1993)；skaliter and lehman,proc.natl.acad.sci.usa 91(22):10665-10669(1994))、单链dna结合蛋白(ssb；rigler and romano,j.biol.chem.270:8910-8919(1995))和小牛胸腺解旋酶(siegel et al.,j.biol.chem.267:13629-13635(1992))。解旋酶和ssb的热稳定形式是可获得的，因此适用于pcr。
[0269]
扩增
[0270]
使上述引物组与样品核酸在这样的条件下接触：其中引物退火到它们的模板链(如果存在)。使用能够在所采用的反应条件下进行链置换的缺少5
’‑3’
外切核酸酶活性的
dna聚合酶来进行所需的核酸扩增方法。该扩增产生扩增子，所述扩增子包含扩增反应中所用的全部引物的序列。可将引物组以单独的寡核苷酸的形式方便地添加到扩增混合物中。例如，双引物组可由三种寡核苷酸组成(假定内引物不包含发夹结构)，三引物组可由五种寡核苷酸组成(假定内引物和中间引物都不包含发夹结构)。
[0271]
对于如上所述使用双引物组的半巢式扩增，在pcr的指数期中可实现至少3
循环数
的速率。使用半巢式双引物组的扩增能够将检测单拷贝核酸所需的扩增循环数减少约12％至约42％(例如减少37％)。这有助于在约23-27个扩增循环内(否则其可能需要40个或多个循环)检测生物样品中的单拷贝核酸。在一些实施方案中，半巢式双引物组pcr有助于在23、24、25、26或27个扩增循环中检测生物样品中的单拷贝核酸。
[0272]
下表3示出了使用本文所述的不同实施方案来扩增单拷贝核酸至10
12
拷贝所需的循环数。对于如上所述使用双引物组的完全巢式扩增，在pcr的指数期中可实现至少6
循环数
的速率。使用完全巢式双引物组的扩增能够将检测单拷贝核酸所需的扩增循环数减少约36％至约66％(例如减少61％)。这有助于在约13-17个扩增循环内检测生物样品中的单拷贝核酸。在一些实施方案中，完全巢式双引物组pcr有助于在13、14、15、16或17个扩增循环中检测生物样品中的单拷贝核酸。
[0273]
表3—扩增所需的循环数的减少为pcr基数(base)的函数
[0274][0275]
对于如上所述使用三引物组的半巢式扩增，在pcr的指数期中可实现至少4
循环数
的速率。使用半巢式三引物组的扩增能够将检测单拷贝核酸所需的扩增循环数减少约25％至约55％(例如减少50％)。这有助于在约20个扩增循环内(否则其可能需要40个或多个循环)检测生物样品中的单拷贝核酸。在一些实施方案中，半巢式三引物组pcr有助于在18、19、20、21或22个扩增循环中检测生物样品中的单拷贝核酸。
[0276]
对于如上所述使用三引物组的完全巢式扩增，在pcr的指数期中可实现至少8
循环数
的速率。使用完全巢式三引物组的扩增能够将检测单拷贝核酸所需的扩增循环数减少约42％至约72％(例如减少67％)。这有助于在约11-15个扩增循环内检测生物样品中的单拷贝核酸。在一些实施方案中，完全巢式三引物组pcr有助于在9、10、11、12或13个扩增循环中检测生物样品中的单拷贝核酸。
[0277]
在一些实施方案中，使用pcr来进行扩增步骤。对于运行实时pcr反应，反应混合物通常包含适合的缓冲液(约1至约10mm的镁离子(mg
2
)的源，例如约2至约8mm)、核苷酸以及任选的洗涤剂和稳定剂。一种适合的缓冲液的实例为浓度为约5mm至约85mm的tris缓冲液，优选地浓度为10mm至30mm。在一个实施方案中，在反应混合物双倍强度(2x)形式下，tris缓冲液浓度为20mm。反应混合物的ph范围可以为约7.5至约9.0，典型ph范围为约8.0至约8.5。核苷酸的浓度范围可为约25mm至约1000mm，通常在约100mm至约800mm的范围内。dntp浓度的实例为100、200、300、400、500、600、700和800mm。洗涤剂(如tween 20、triton x 100和
nonidet p40)也可包含于反应混合物中。还可包含稳定剂如二硫苏糖醇(dtt，cleland’s reagent)或巯基乙醇。此外，主混合物(master mix)可任选地包含dutp以及尿嘧啶dna糖基化酶(glycosylase)(尿嘧啶-n-糖基化酶，ung)。主混合物可商购自applied biosystems,ca,foster city(universal master mix，目录号4304437、4318157和4326708)。
[0278]
在一些实施方案中，本文所述的引物和探针可用于多重扩增反应。所述多重反应可以采用本文所述的两组或更多组引物(均由两个以上的寡核苷酸组成)和相关探针，例如，用于检测和任选地定量2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多不同靶核酸的引物组和相关探针。作为多重扩增的标准，在单一反应中使用的所有探针可具有可区分的标记物。在一些实施方案中，多重扩增反应可采用本文所述的一组或多组引物和相关探针(均由两个以上的寡核苷酸组成)与标准的双引物组和任选的相关探针相结合。
[0279]
分子聚集剂(molecular crowding agent)
[0280]
已有报告称dna聚合酶(如t7和taq聚合酶)的结合亲和力和催化活性在分子聚集的条件下增加，其模拟活细胞中的条件。sasaki(2006,biotechnology journal,“effect of molecular crowding on dna polymerase activity,”1:440-446,其关于该现象的描述通过引用的方式纳入本文)观察到使用聚乙二醇(peg)200、4000和8000的这些增强。特别是，sasaki发现4-10％的peg 4000或peg 8000增强聚合酶活性。下文的实施例6和7证明在基数-6pcr中的类似效果，包括peg 8000减少检测靶核酸所需的循环数。实施例7显示，基数-2pcr反应的ct没有随着peg 8000浓度的递增而改变。然而，基数-3和基数-6反应的ct值随着peg 8000浓度的递增而逐渐并显著提高。
[0281]
虽然peg可能是最方便的分子聚集剂，但任何不带正电荷的水溶性聚合物都是用于本文所述方法的候选者。用于这些方法的优选水溶性聚合物是不带电的。实例包括葡聚糖和聚氧乙烯。这类试剂的使用浓度是它们保持在溶液中的浓度。更高的浓度提供更多的分子聚集，并因此聚合酶活性更增强，但浓度不仅受溶解度的限制，而且受反应混合物的粘度的限制，其不能太粘而无法使用。
[0282]
在各种实施方案中，在本文所述方法中用作扩增添加剂的分子聚集剂的平均分子量在1,000g/mol至107g/mol；2,000g/mol至106g/mol；3,000g/mol至105g/mol；4,000g/mol至10,500g/mol；5,000g/mol至10,000g/mol；6,000g/mol至10,500g/mol；和7,000至9000g/mol。在一个举例说明性的实施方案中，分子聚集剂是peg 8000。
[0283]
分子聚集剂的浓度将受到上面提到的实际考虑因素的限制，但一般来说，与较低分子量的分子聚集剂相比，预期较高分子量的分子聚集剂在更低的浓度下增强聚合酶活性。在多种实施方案中，所述分子聚集剂能够以2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％，或更高的浓度包含在本文所述的扩增反应中。例如，在分子聚集剂的平均分子量为7,000至9,000g/mol的情况下，用于在大于基数2的扩增反应中增强聚合酶活性的合适浓度可以在7％至9％之间。
[0284]
标记策略
[0285]
在本文所述方法中可使用任何适合的标记策略。当分析反应中是否存在单一扩增产物的情况下，可在扩增混合物中使用通用检测探针。在特定的实施方案中，可使用通用qpcr探针来进行实时pcr检测。适合的通用qpcr探针包括双链dna结合染料，例如
sybrgreen、pico green(molecular probes,inc.,eugene,or)、eva green(biotinum)、溴化乙锭等(参见zhu et al.,1994,anal.chem.66:1941-48)。
[0286]
在一些实施方案中，在扩增混合物中使用一个或多个靶特异性qpcr探针(即，特异性针对待检测的靶核苷酸序列)以检测扩增产物。通过谨慎地选择标记物，可进行分析，其中在单个反应中以不同的波长激发和/或检测不同的标记物(“多重检测”)。参见例如fluorescence spectroscopy(pesce et al.,eds.)marcel dekker,new york,(1971)；white et al.,fluorescence analysis:a practical approach,marcel dekker,new york,(1970)；berlman,handbook of fluorescence spectra of aromatic molecules,2nd ed.,academic press,new york,(1971)；griffiths,colour and constitution of organic molecules,academic press,new york,(1976)；indicators(bishop,ed.).pergamon press,oxford,19723；和haugland,handbook of fluorescent probes and research chemicals,molecular probes,eugene(1992)；以及linck et al.(2017)“a multiplex taqman qpcr assay for sensitive and rapid detection of phytoplasmas infecting rubus species,”plos one 12(5)。
[0287]
在一些实施方案中，设计探针以使探针与靶核酸退火导致荧光共振能量转移(fret)。fret是发生在两个染料分子之间的量子现象。激发从供体转移到受体荧光团，从而使供体分子荧光被猝灭，并且受体分子被激发。在某些实施方案下，荧光团标记的dna探针的一部分可参与碰撞和静态荧光猝灭。这些非基于fret的机制可以模拟fret的荧光猝灭效果。fret和其他用于实时pcr反应中的基于荧光的探针的设计是公知的，并且综述于例如didenko,biotechniques(2001)31:5,1106-1121中，其通过引用并入本文用于本说明书。
[0288]
循环探针
[0289]
在一些实施方案中，在本文所述的方法中循环探针可用于检测，和任选地定量靶核酸。循环探针作为一种在扩增测定中放大信号的方式已经使用了多年。循环探针记载于例如pct公开wo 89/09284和美国专利5,011,769和4,876,187中，其描述通过引用的方式纳入本文。
[0290]
美国专利5,763,181记载荧光标记的循环探针用于检测靶核酸的用途。一般来说，所公开的方法采用荧光标记的寡核苷酸底物，其包含被催化裂解反应的酶所识别的核苷酸序列。寡核苷酸底物可为dna或rna，并且可为单链或双链。所述寡核苷酸可用dna或rna的单链上的单个荧光标记或荧光对(供体和受体)来标记。单标记物或双标记物的选择可取决于本发明的方法中所采用的酶的效率。对寡核苷酸底物的长度没有限制，只要在距离酶裂解位点足够远(例如6-7个核苷酸)的位置标记荧光探针。常用于该方法中的荧光团的实例包括异硫氰酸荧光素、荧光素胺(fluorescein amine)、曙红、罗丹明(rhodamine)、丹酰和伞形酮(umbelliferone)。其它荧光标记是本领域技术人员已知的。在heller和jablonski的美国专利4,996,143中可找到一些用于设计灵敏的荧光标记的多核苷酸探针的一般指导。该专利讨论了在设计荧光探针时可以考虑的参数。所述循环探针裂解反应可由酶来催化，诸如dna酶、rna酶、解旋酶(helicase)、核酸外切酶、限制性核酸内切酶或逆转录病毒整合酶(retroviral integrase)。其他影响核酸裂解的酶是本领域技术人员已知的，并且可以被用来裂解具有其同源裂解位点(cognate cleavage site)的循环探针。
[0291]
在一些实施方案中，一个或多个经修饰的碱基可包括在本文所述的任何探针中。
上文讨论的关于在探针中使用稳定和/或经修饰的碱基的考虑因素也适用于探针。
[0292]
在一些实施方案中，在扩增混合物中使用的一个或多个引物上包含标记物可能是方便的。
[0293]
示例性的自动化和系统
[0294]
在一些实施方案中，使用自动样品处理和/或分析平台来检测靶核酸。在一些实施方案中，利用市售可得的自动化分析平台。例如，在一些实施方案中，利用系统(cepheid,sunnyvale,ca)。
[0295]
举例说明本文所述的方法用于genexpert系统。示例性的样品制备和分析方法如下文所述。然而，本发明不限于特定的检测方法或分析平台。本领域技术人员认识到可以使用任何数量的平台和方法。
[0296]
利用独立的一次性反应盒(self-contained,single use cartridge)。样品提取、扩增和检测可全部在该独立的“反应盒实验室”(可从cepheid获得，参见www.cepheid.com)内进行。
[0297]
所述反应盒的部件包括但不限于包含试剂、过滤器和可用于提取、纯化和扩增靶核酸的捕获技术的处理室。阀门使得流体能够在室间转移，并包含核酸裂解和过滤部件。光学窗口使得能够进行实时光学检测。反应管使得能够进行非常快速的热循环。
[0298]
在一些实施方案中，系统包括多个用于可扩展性(scalability)的模块。每个模块包括多个反应盒，以及样品处理和分析部件。
[0299]
在将样品添加到反应盒之后，将样品与裂解缓冲液接触，释放的核酸结合至核酸-结合底物(substrate)(例如二氧化硅或玻璃底物)。然后除去样品上清液并在洗脱缓冲液(例如tris/edta缓冲液)中洗脱核酸。然后可在反应盒中处理洗脱液以检测本文所述的靶基因。在一些实施方案中，洗脱液用于复原至少一些试剂，其以冻干颗粒形式存在于反应盒中。
[0300]
在一些实施方案中，pcr用于扩增并检测一种或多种靶核酸的存在。在一些实施方案中，pcr使用具有热启动功能的taq聚合酶，例如aptataq(roche)。
[0301]
在一些实施方案中，离线(off-line)离心用于改善使用具有低细胞含量的样品的测定结果。将添加或不添加缓冲液的情况下，将样品离心并除去上清液。然后将沉淀物重新悬浮于更小体积的上清液、缓冲液或其他液体中。然后将重新悬浮的沉淀物添加到之前所述的反应盒中。
[0302]
试剂盒
[0303]
还考虑到用于实施本文所述的方法的试剂盒。这样的试剂盒包括一种或多种可用于实施这些方法中任何一种的试剂。试剂盒通常包括具有一种或多种盛放试剂的容器的包装，所述试剂形式为一种或多种单独的组合物，或任选地在试剂相容性允许的情况下为混合物。所述试剂盒也可包括从使用者角度而言需要的其他材料，例如缓冲液、稀释剂、标准品和/或可用于样品处理、清洗或进行测定的任何其他步骤的任何其他材料。
[0304]
试剂盒优选地包括用于实施一种或多种本文所述的筛选方法的说明书。试剂盒中包含的说明书可附于包装材料上或可作为包装插页包括在内。尽管说明书通常为书面或印刷材料，但不限于此。可以使用任何能够存储这样的说明书并将其传播到最终使用者的介
质。这样的介质包括但不限于电子存储介质(例如磁盘、磁带、卡带(cartridges)、芯片)、光学介质(例如cd rom)等。本文使用的术语“说明书”可包括提供说明书的互联网站点地址。
[0305]
实施例
[0306]
实施例1：“夹持”寡核苷酸对引物/靶结构的影响的确认
[0307]
进行实验，其中测量在存在和不存在“夹持”寡核苷酸的情况下的引物寡核苷酸(尽管被称为“引物”，它在本实验中并非如此使用)以及互补靶序列的tm。合成的靶寡核苷酸具有5’荧光标签(荧光素)，并且引物中掺入荧光猝灭部分(参见图6)。序列c具有2’o-甲基骨架。所测试的寡核苷酸序列列于下表4。图6的结构中所示的最右侧双螺旋区的tm是通过追踪荧光的增加来测量，所述荧光的增加是由于温度升高以及由于通过该双螺旋区解链分开荧光团(fluorophor)和猝灭剂而导致。
[0308]
如果如图6a所示，引物的靶标结合区域被所述夹子(clamp)限于b/b’结合，则预测该区域的tm将比图6b中具有ab/a’b’结合的情况下的tm低得多。在下表4中列出了本实验和后续实验中使用的寡核苷酸。表5中为在存在或不存在夹持寡核苷酸的情况下引物和靶寡核苷酸的预测的和实测的tm。
[0309]
表4——使用的寡核苷酸
[0310][0311]
a*＝2,6-二氨基嘌呤，u01＝dabcyl猝灭剂标记的尿嘧啶，小写字母为2
’‑
o-甲基核苷酸。寡核苷酸16142被阻断以防止延伸。
[0312]
表5——tm测量
[0313]
引物靶标夹子预测的tm(℃)实测的tm(℃)1614016145无76.4(ab/a’b’)78.51614116146无74.6(ab/a’b’)78.016140161451614268.3(b/b’)67.016141161461614262.0(b/b’)66.5
[0314]
所有杂交体解链分析的条件为：0.01m tris-hcl、0.05m kcl和0.006m mgcl2。所有的寡核苷酸为1μm。将上表4中的寡核苷酸混合物加热到95℃并缓慢冷却至45℃，使用cepheid smartcycler
tm
监测荧光素荧光。tm被测定为荧光变化率最大时的温度。
[0315]
使用软件(www.idtdna.com/analyzer/applications/oligoanalyzer)预测b/b’和ab/a’b’的tm。实测的tm与这样的结构一致：即其中在存在夹持寡核苷酸的情况下，靶标中的d
’‑
a’区保持单链并可用于杂交。
[0316]
如图7a所图解的，也为1μm的侧翼引物(16147至16149)的存在对测量的tm中几乎没有影响。
[0317]
实施例2：外(侧翼)引物的可延伸性
[0318]
在表6中所示的条件下，在pcr反应中测试图7a中示意性地示出的外(侧翼)引物的可延伸性。
[0319]
表6
[0320]
反应侧翼引物1161472161483161494无
[0321]
所有的反应包含10mm tris-hcl；datp、dttp、dctp和dgtp各0.125mm；0.15μm来自上表5的引物寡核苷酸16140；0.125μm来自表1的靶寡核苷酸16145；0.125μm来自表1的夹持寡核苷酸16142；45mm kcl；3.5mm mgcl2；14单位的amplitaqcs，其具有dna聚合酶活性但是既不是5’至3’也不是3’至5’外切核酸酶活性；以及15单位的taq聚合酶的抗体，其提供扩增反应的温度激活的“热启动”。
[0322]
按照上表6添加0.125mm或不添加侧翼引物；使用smartcycler随时间监测反应，将温度升至95℃以分开寡核苷酸，同时激活聚合酶，然后降低温度至60℃以允许寡核苷酸退火并允许任何引物延伸发生。结果示于图7b。三条上升迹线是具有略微不同的夹子的单独反应；水平迹线没有外(侧翼)置换引物存在。这些结果表明，当存在外(侧翼)引物时，发生置换猝灭剂的链置换反应。
[0323]
实施例3：使用修饰的引物产生具有令人满意的延伸时间的基数-3扩增
[0324]
如本实施例举例说明的，通过包括修饰的碱基，可以进一步缩短每个扩增循环中的引物延伸时间。
[0325]
图10a和10b比较修饰的测试引物组(“8系列”)与未修饰的测试引物组(“6系列”)的实时pcr生长曲线。使用对数y轴刻度将荧光(y轴)相对于pcr循环数作图。所有寡核苷酸序列均可在下表7中找到，其也示出了修饰的核苷酸2,6-二氨基嘌呤和2-硫代胸腺嘧啶的位置。
[0326]
表7
[0327]
[0328][0329]
a*＝2,6-二氨基嘌呤，c01＝5-甲基胞嘧啶，小写字母为2
’‑
o-甲基核苷酸。夹子b’c’6为3
’‑
阻断的以防止延伸。夹子b’c’8也可以为3
’‑
阻断的以防止延伸。
[0330]
所有pcr使用相同的正向f1引物(seq id no:1)，其被包括在主混合物中。evagreen染料(biotium)是一种绿色荧光核酸嵌入染料，用于实时pcr。使用每种引物的终浓度为0.4μm，并添加了1.25e .07拷贝的模板(seq id no:9)、69个核苷酸的合成的寡核苷酸或水对照(ntc或“无模板对照”条件)。使用链置换(sd)聚合酶(bioron)，其是一种提供强置换活性的热稳定的聚合酶。在所有pcr中通用的试剂的pcr主混合溶液包括20单位sd聚合酶、1x sd聚合酶缓冲液、1x evagreen染料、5mm mgcl2、0.4mm dntp，以及0.4μm的f1引物。所有反应均在冰上准备，然后使用cepheid smartcycler实时pcr仪进行3-温度热循环仪方案：95℃下15秒、68℃下16秒以及56℃下37秒，25个循环。
[0331]
在图10a中，“cba8”和“b8”反应用作“双引物”，对照条件由正向引物f1加上反向引物cba8(seq id no:3)组成，与b’c’8(seq id no:4)“夹持”寡核苷酸或反向引物b8(seq id no:8)一起使用。“8测试”结合了所有三种引物，“8测试ntc”用作测试条件的无模板对照。在荧光阈值为50时，三引物测试条件导致最早的ct为7.7，比二引物的对照条件提前了约5个循环。在荧光阈值时或接近荧光阈值时，对于“8测试”pcr可以看到荧光水平超过两倍，而两引物对照pcr的荧光水平不超过两倍。
[0332]
在图10b中，反应“cba6”(其包括引物cba6(seq id no:3)和寡核苷酸b’c’6(seq id no:5))，“b6”(其包括引物b6(seq id no:7))，“6测试”和“6测试ntc”(包括cba6、b’c’6和b6)分别类似于图9a的“cba8”、“b8”、“8测试”和“8测试ntc”，不同之处在于任何寡核苷酸中都不存在修饰的核苷酸2,6-二氨基嘌呤和2-硫代胸腺嘧啶。
[0333]
在这些引物中使用修饰的碱基在每个循环中产生三倍生长，每个循环的延伸时间少于60秒。
[0334]
实施例4：在扩增子的两端使用修饰的引物产生基数-6扩增，有效扩增所需的循环数显著减少
[0335]
图11a示出了实时pcr荧光生长曲线，所述曲线通过由减少的模板dna分子的数量开始的基数-6(每个循环约6个重复)的pcr扩增产生。化脓链球菌基因组dna的log 10稀释用作dna模板输入。图11b示出了达到荧光阈值水平所需的扩增循环数(ct)相对于起始dna模板分子数目的log 10作图。所有寡核苷酸序列可在表8中找到。
[0336]
表8
[0337][0338]
该实验中用于所有反应的试剂的pcr主混合物溶液包括80单位链置换(sd)聚合酶、1x sd聚合酶缓冲液、1x evagreen荧光染料、5mm mgcl2、0.4mm dntp、0.5μm的表8中每种寡核苷酸。
[0339]
化脓链球菌基因组dna(atcc 12433d-5)用水稀释至1.27e7拷贝/μl、1.27e6拷贝/μl、1.27e5拷贝/μl、1.27e4拷贝/μl和1.27e3拷贝/μl。将1μl的每种稀释的模板溶液加入到pcr主混合物溶液中，并加水至25μl的总体积。这导致5个模板反应下降10倍，从1.27e7拷贝到1270拷贝，并且没有模板对照反应。所有反应均在冰上准备，然后置于cepheid smartcycler实时pcr仪中进行2-温度热循环仪实验方案：92℃下1秒，62℃下30秒，25个循环。
[0340]
图11a示出为了减少模板量，通过荧光阈值(虚线)所需的循环数增加。在存在荧光、dsdna结合染料、evagreen的情况下，双链dna扩增子的量增加会产生该增加的荧光。图1b绘制了循环数(ct)相对于模板的起始拷贝数的log 10的图。这条线的负斜率的倒数(inverse negative slope)约为每log 10稀释约1.3个循环，这与大约6的每个循环的复制因子一致。在标准的基数-2pcr中，每log 10稀释约有3.3个循环。
[0341]
实施例5：使用循环探针的基数-6扩增
[0342]
图12示出了在荧光寡核苷酸探针的存在下，由基数-6pcr生成实时pcr荧光生长曲线。扩增从模板dna分子的数量减少开始。化脓链球菌基因组dna的log 10稀释被用作dna模板输入。除了加入表9所示的rnase h2活化的寡核苷酸探针外，使用了与表8所示相同的寡核苷酸。
[0343]
表9
[0344][0345]
该实验中用于所有反应的试剂的pcr主混合物溶液包括80单位链置换(sd)聚合酶、1x sd聚合酶缓冲液、5mm mgcl2、0.4mm dntp、0.5μm的表8中每种寡核苷酸(oligo)、0.5
μm的表9中所示的寡核苷酸探针、0.1单位的rnase h2(idt)、3.98e13分子的热启动单克隆抗体、以及3.77μm的与dna聚合酶活性位点结合的适配体。。
[0346]
化脓链球菌基因组dna(atcc 12433d-5)用水稀释至1.27e7拷贝/μl、1.27e6拷贝/μl、1.27e5拷贝/μl、1.27e4拷贝/μl、1.27e3拷贝/μl和1.27e2/μl。将1μl的每种稀释的模板溶液加入到pcr主混合物溶液中，并加水至25μl的总体积。这导致6个模板反应下降了10倍，从1.27e7拷贝到127拷贝，并且没有模板对照反应。所有反应均在冰上准备，然后置于cepheid smartcycler实时pcr仪中进行2-温度热循环仪实验方案：92c下1秒和62c下30秒，25个循环。
[0347]
图12示出类似于图11a的生长曲线，除了使用了序列特异性探针来产生荧光。序列特异性探针允许在相同实时pcr(即多重检测)内产生特异性针对不同靶标的生长曲线。目前能够在仪器(诸如cepheid genexpert)上检测和区分最高达10条这样的探针特异性生长曲线，其中每个探针标记有响应于和/或发射可区分的光波长的不同荧光体(fluor)。
[0348]
所用的探针是循环探针的一个实例，其中在探针的靶序列特异性裂解时产生探针信号，所述裂解由于探针序列中存在核糖核苷酸取代而发生(表9)。这种裂解使寡核苷酸结合的荧光体与荧光猝灭剂分离，导致荧光的净增长。此处的裂解用酶rnase h2完成，热稳定的rnase h2可禁受pcr中使用的dna变性温度，并且甚至当杂交对存在单个核糖取代的核苷酸时也能裂解rna/dna杂交体。名称“循环探针”意味着裂解可发生得足够快，以使得在单个pcr循环内可发生多个裂解事件，允许靶标被再循环。
[0349]
实施例6：在基数大于2的核酸扩增反应中包括聚乙二醇(peg)的影响
[0350]
为了进一步减少检测所需的扩增循环数，高分子量的聚乙二醇(peg)被包括在基数大于3的扩增反应中。大分子可增加溶液中的分子聚集，其可增加反应物的有效浓度，由此有利于反应中的分子间关联(associate)，如核酸扩增。peg 8000包括足够大的分子以在适当的条件下产生显著的分子聚集。因此，测试了在基数-6扩增反应中包括不同浓度的peg 8000的效果。
[0351]
聚(乙二醇)/te溶液是通过将8克干燥颗粒(sigma，89510-250g-f，lot bccb3467)溶解于10mm tris，1mm edta ph 8.0(fisher bp2473-580，lot 204107)中制备。通过涡旋完成混合，并将溶液(～31％w/v)在室温下储存过夜。
[0352]
根据表10制备通用pcr混合物(um)。
[0353]
表10
[0354][0355][0356]
根据表11制备逆转录(rt)混合物。
[0357]
表11
[0358][0359]
根据表12制备稀释的peg/te/mbgh2o溶液，通过将分子生物学等级的水与或不与～31％w/v peg/te溶液组合以获得具有不同peg/te浓度的peg/te/mbgh2o溶液，以在稀释至85μl的最终体积时实现0％、7％、8％和9％的最终peg浓度。将这些溶液与～39.2μl um混合以获得65μl peg/te/mbgh2o/um。
[0360]
表12
[0361] peg8000(μl)水(μl)peg浓度10.0025.81peg浓度219.346.47peg浓度322.103.71peg浓度424.860.95
[0362]
将rt混合物(25μl)和peg/te/mbgh2o/um(65μl)分别装载进50μl反应盒室7和11中。将根据图13所示的反应盒布局图的其它试剂装载到反应盒中，并以10μl稀释至300μl te中的105cp n2 rna作为样品(扩增靶标是sars-cov-2的n基因的区域)。
[0363]
adf sars-cov-2iuo_fast11_v15在系统(cepheid，sunnyvale，ca)中运行。该方案的详细热循环程序如图14所示。
[0364]
如图15中所示，与仅加入mbg水相比，含有peg/te/mbgh2o的反应的发生的循环减少。与之相比，如果使用peg 200而不是peg 8000，则观察到循环未减少(数据未示出)。
[0365]
实施例7：peg在不同类型扩增反应中的影响
[0366]
为了评估peg 8000在不同类型反应中对靶标ct的影响，本发明人在基数-2、基数-3和基数-6核酸扩增反应中分别加入0％、2％、6％、8％和10％浓度的peg 8000。所有的反应都靶向sars-cov-2的n基因的相同区域。使用用染料和猝灭剂标记的寡核苷酸探针实现靶标扩增的检测。所述寡核苷酸探针中间还携带单个核糖核苷酸。当它与互补的靶dna链退火时，探针被rnase h2酶消化并释放出荧光染料(即循环探针)。结果显示，基数-2反应的ct没有随着peg 8000浓度的递增而改变。然而，基数-3和基数-6反应的ct值随着peg 8000浓度的递增而显著并逐渐提高。基数-6反应在各反应类型中在ct方面具有最明显的改进(参见图16)。
[0367]
参考文献
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