工程化双稳态拨动开关及其用途

工程化双稳态拨动开关及其用途
1.相关申请
2.本技术根据35u.s.c.
§
119(e)要求2020年2月11日提交的美国临时申请no.62/972,807的权益，该美国临时申请通过引用以其整体并入本文。关于通过efs-web作为文本文件提交的序列表
3.本技术包含序列表，其已通过efs-web以ascii格式提交并在此通过引用以其整体并入。所述ascii副本创建于2020年12月15日，命名为m065670476wo00-seqtxt，并且大小为9千字节。


背景技术：

4.在哺乳动物系统中工程化合成基因回路的重要挑战是表观基因沉默。由于当前的基因回路通常完全依赖于转录控制，因此它们容易受到表观基因沉默的影响。很少拨动开关的例子已被制备能够在哺乳动物细胞中发挥好的作用并且抵抗表观基因沉默。此外，合成生物学领域还没有生产出哺乳动物拨动开关，其已显示好的在高与低状态之间的倍数变化、在很多天内这些状态的稳定性以及对切换事件的响应性。


技术实现要素：

5.本公开至少部分涉及使用可编程内切核苷酸切断诱导的稳定性调谐(programmable endonucleolytic scission-induced stability tuning(persist))平台通过rna切割(例如，rna切割介导的rna降解或rna切割介导的rna稳定)可控制的工程化双稳态拨动开关。这样的工程化双稳态拨动开关包括能够根据rna切割信号激活它们自身和相互抑制的两种表达盒。工程化双稳态拨动开关还能够响应一种信号长期维持一种状态，和响应不同的信号快速地切换至另一种状态。各种设计可与工程化双稳态拨动开关组合以施加开关的控制。本文所述的工程化双稳态拨动开关可用于诊断和治疗应用(例如，治疗性分子至受试者的长期递送)。
6.在一些方面，本公开提供一种工程化双稳态拨动开关，其包括：(i)第一表达盒，其从5’至3’包括：可操作地连接至编码第一rna切割位点的第一拷贝的核苷酸序列的第一启动子、第一rna切割效应子的第一拷贝的编码序列、编码第二rna切割位点的第一拷贝的核苷酸序列和编码多个rna降解基序的核苷酸序列；和(ii)第二表达盒，其从5’到3’包括：可操作地连接至编码第二rna切割位点的第二拷贝的核苷酸序列的第二启动子、第二rna切割效应子的第一拷贝的编码序列、编码第一rna切割位点的第二拷贝的核苷酸序列和编码多个rna降解基序的核苷酸序列，其中第一rna切割效应子正交于(orthogonal to)第二rna切割效应子，其中第一rna切割效应子能够切割第二rna切割位点，和其中第二rna切割效应子能够切割第一rna切割位点。
7.在一些实施方式中，第一表达盒进一步包括编码位于第一rna切割效应子的第一拷贝的编码序列的3’处的第一转录物稳定序列的核苷酸序列；和/或第二表达盒进一步包括编码位于第一rna切割效应子的第一拷贝的编码序列的3’处的第一转录物稳定序列的核
苷酸序列。在一些实施方式中，第一转录物稳定序列和第二转录物稳定序列各自是三链体(triplex)。在一些实施方式中，三链体是肺腺癌转移相关转录物1(malat1)三链体。
8.在一些实施方式中，第一表达盒进一步包括可操作地连接至第一rna切割效应子的编码序列的第二输出分子的编码序列和位于第一rna切割效应子的编码序列与第二输出分子的编码序列之间的第一间隔区；和第二表达盒进一步包括可操作地连接至第二rna切割效应子的编码序列的第一输出分子的编码序列和位于第二rna切割效应子的编码序列与第一输出分子的编码序列之间的第二间隔区。在一些实施方式中，第一间隔区和第二间隔区是编码内部核糖体进入位点(ires)或2a肽的核苷酸序列。
9.在一些实施方式中，本文所述的工程化双稳态拨动开关进一步包括：(iii)第三表达盒，其包括可操作地连接至第一融合蛋白的编码序列的第三启动子，其中第一融合蛋白包括融合至第一蛋白降解结构域的第一rna切割效应子的第二拷贝；和(iv)第四表达盒，其包括可操作地连接至第二融合蛋白的编码序列的第四启动子，其中第二融合蛋白包括融合至第二蛋白降解结构域的第二rna切割效应子的第二拷贝，其中第三启动子和第四启动子各自是组成型启动子，其中第一蛋白降解结构域能够结合至第一小分子，其中第二蛋白降解结构域能够结合至第二小分子，和其中第一小分子和第二小分子是不同的。在一些实施方式中，第一rna切割效应子的第二拷贝直接或通过接头融合至第一蛋白降解结构域和/或其中第二rna切割效应子的第二拷贝直接或通过接头融合至第二蛋白降解结构域。
10.在一些实施方式中，第一融合蛋白包括多于一个第一蛋白降解结构域；和/或第二融合蛋白包括多于一个第二蛋白降解结构域。
11.在一些实施方式中，第一蛋白降解结构域融合至第一rna切割效应子的n-末端；和/或第二蛋白降解结构域融合至第二rna切割效应子的n-末端。
12.在一些实施方式中，第一蛋白降解结构域和第二蛋白降解结构域是ddd、dde或ddf。在一些实施方式中，第一蛋白降解结构域是dde和第一小分子是4-羟基他莫昔芬(4-oht)；和第二蛋白降解结构域是ddd和第二小分子是甲氧苄啶(tmp)。
13.在一些实施方式中，第一rna切割位点的第一和第二拷贝各自包括能够结合至第一小分子的第一适配体序列，并且结合第一小分子至第一rna切割位点能够阻断第二rna切割效应子切割第一rna切割位点；第二rna切割位点的第一和第二拷贝各自包括能够结合至第二小分子的第二适配体序列，并且结合第二小分子至第二rna切割位点能够阻断第二rna切割效应子切割第一rna切割位点；和第一小分子和第二小分子是不同的。
14.在一些实施方式中，第一表达盒包括编码可操作地连接至第一启动子的第一rna自切割位点的核苷酸序列，并且其中编码第一rna自切割位点的核苷酸序列位于编码第一rna切割位点的第一拷贝的核苷酸序列的5’处；和第二表达盒包括编码可操作地连接至第二启动子的第二rna自切割位点的核苷酸序列，并且其中编码第二rna自切割位点的核苷酸序列位于编码第二rna切割位点的第二拷贝的核苷酸序列的5’处，其中第一rna自切割位点不同于第二rna自切割位点。在一些实施方式中，第一rna自切割位点和第二rna自切割位点是核酶。在一些实施方式中，核酶选自由反基因组戴尔他肝炎病毒(hdv)核酶、基因组hdv核酶和strsv锤头状核酶(hhr)组成的组。
15.在一些实施方式中，第一rna自切割位点能够响应第一小分子而自切割，第二rna自切割位点能够响应第二小分子而自切割，和第一小分子和第二小分子是不同的。
16.在一些实施方式中，第一启动子和第二启动子是组成型启动子或诱导型启动子。
17.在一些实施方式中，第一输出分子和第二输出分子是不同的，并且其中第一输出分子和第二输出分子选自由下述组成的组：核酸、治疗性蛋白、可检测蛋白。
18.在一些实施方式中，第一rna切割效应子和第二rna切割效应子是crispr内切核糖核酸酶(endornase)。在一些实施方式中，crispr endornase是cas6、csy4、case、cse3、lwacas13a、pspcas13b、rancas13b、pgucas13b或rfxcas13d。
19.在一些实施方式中，第一转录物稳定序列和第二转录物稳定序列各自是三链体。在一些实施方式中，三链体是肺腺癌转移相关转录物1(malat1)三链体。
20.在一些实施方式中，多个rna降解基序是能够募集脱腺苷化复合物、mirna靶位点、包括用于rna降解相关蛋白的结合位点的适配体、包括用于引起rna降解的工程化蛋白的结合位点的适配体的rna序列。
21.在一些方面，本公开还提供一种载体，其包括本文所述的工程化双稳态拨动开关。在一些实施方式中，载体是质粒、rna复制子或病毒载体。在一些实施方式中，病毒载体是慢病毒载体。
22.在一些方面，本公开还提供一种细胞，其包括本文所述的工程化双稳态拨动开关或载体。在一些实施方式中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方式中，哺乳动物细胞是人诱导多能干细胞(hipsc)、患病细胞、免疫细胞或重组蛋白产生细胞。在一些实施方式中，细胞在其基因组中包括工程化双稳态拨动开关。
23.在一些方面，本公开还提供一种非人动物，其包括本文所述的工程化双稳态拨动开关、载体或细胞。在一些实施方式中，非人动物是哺乳动物。
24.在一些方面，本公开还提供一种组合物，其包括本文所述的工程化双稳态拨动开关、载体或细胞。在一些实施方式中，组合物进一步包括药学上可接受的载体。
25.在一些方面，本公开还提供一种在第一输出分子与第二输出分子之间切换基因表达的方法，所述方法包括：向需要其的受试者施用本文所述的工程化双稳态拨动开关、载体或细胞或组合物。在一些方面，本公开还提供一种维持输出分子表达的长期开/关调节的方法，所述方法包括：向需要其的受试者施用本文所述的工程化双稳态拨动开关、载体或细胞或组合物。在一些实施方式中，本文所述的方法进一步包括向受试者施用第一小分子或第二小分子。
附图说明
26.图1a-1c是显示rna-水平开和关切换以及在在基于rna的开和关切换中并入crispr endornase的图。图1a是由rna切割调节的基于rna的关-切换和开-切换基序设计的示意图。图1b包括显示crispr endornase激活persist-开基序并抑制persist-关基序的图表。图1c包括显示cas endornase成对正交性的评估的图表。
27.图2a-2c是显示工程化双稳态拨动开关的配置和功能的图。图2a是使用通过persist系统相互抑制并激活它们自身的两个endornase的工程化双稳态拨动开关的图示。带有星号(*)的发夹是可被csy4切割的，而带有加号( )的发夹是可被case切割的。两种报告蛋白—mko2和eyfp—被用来反应拨动开关的行为。csy4可切割的发夹被放置在mko2的5’处，并且case可切割的发夹被放置在eyfp的5’处。图2b显示了由于转染引起的不同细胞接
收不同拷贝数的质粒导致的双稳态拨动开关跨越宽范围的比率上的双稳态行为。递送至每个细胞的基因回路本质上执行加权随机决策，以展现csy4高或case高状态。图2c显示了双稳态拨动开关的切换行为，以第1-3天(此时另外的csy4(中图)或case(下图)被添加至用双稳态拨动开关转染的细胞)表达eyfp或mko2的细胞的百分比表示。
28.图3a-3j是显示具有蛋白-水平降解结构域的双稳态拨动开关的配置和功能的图。图3a是具有不稳定结构域(其在没有稳定配体的情况下引起蛋白的降解)的融合蛋白的示意设计。图3b是显示筛选启动子和与csy4的降解结构域组合以及在存在或不存在4-oht或tmp的情况下对双稳态基序的影响进行量化的图表。图3c是显示筛选ddd与case的组合以及在存在或不存在tmp的情况下对双稳态基序的影响进行量化的图表。图3d-3f是显示具有dde-dde-csy4和ddd-case融合蛋白的双稳态拨动开关的结构，以及这样的拨动开关如何响应4-oht或tmp的示意图。图3g是显示响应4-oht的拨动开关的行为的图表。图3h是显示响应tmp的拨动开关的行为的图表。图3i是显示双稳态拨动开关能够响应tmp而切换状态，并在至少48小时内维持高case高状态的图表。图3j是显示24小时剂量的4-oht可以在去除4-oht之后将细胞维持在csy4-高/case-低状态(mko2-高/eyfp低)72小时，以及24小时剂量的tmp可以在去除tmp之后将细胞维持在csy4-低/case-高状态(mko2-低/eyfp-高)72小时的图表。图3b-3c中与流式细胞术图相邻的叠段柱显示1)eyfp
高
tagbfp
高
、2)eyfp
高
tagbfp
低
、3)eyfp
低
tagbfp
高
和4)eyfp
低
tagbfp
高
亚群中的细胞比例。3h
–
3i中的叠段图显示1)eyfp
高
mko2
高
、2)eyfp
高
mko2
低
、3)eyfp
低
mko2
高
和4)eyfp
低
mko2
低
亚群中的细胞比例。
29.图4a-4e是显示具有小分子响应适配体的双稳态拨动开关的配置和功能的图。图4a是显示具有小分子响应适配体的crispr靶发夹的示意图。在同源小分子的存在下靶位点的结合和切割被阻断。图4b-4c是显示在没有茶碱(图4b)和有茶碱(图4c)的情况下，通过用case和5’utr中含有杂合case识别基序-茶碱适配体的eyfp共转染的hek293ft细胞的eyfp表达的图表。图4d是显示在不存在小分子(2和4)的情况下具有小分子响应适配体的工程化双稳态拨动开关的行为的示意图，其中所有rna结合和切割事件都发生。图4e是显示在存在一个小分子(4*)和不存在另一个小分子(2)的情况下，具有小分子响应适配体的工程化双稳态拨动开关的行为的示意图，其中csy4结合和切割事件被阻碍。
30.图5a-5c是显示具有核酶的双稳态拨动开关的配置和功能的图。图5a是显示核酶能够激活persist-开基序并抑制persist-关基序的图表。图5b是具有核酶位点的工程化双稳态拨动开关的示意性配置。图5c是具有能够响应小分子的核酶位点的工程化双稳态拨动开关的示意性配置，其显示当一个小分子存在(1*)并且另一个小分子不存在(4)时的拨动开关活性。
具体实施方式
31.本公开至少部分涉及使用可编程内切核苷酸切断诱导的稳定性调谐(persist)平台通过rna切割(例如，rna切割介导的rna降解或rna切割介导的rna稳定)可控制的工程化双稳态拨动开关。这样的工程化双稳态拨动开关包括能够根据rna切割信号激活它们自身和相互抑制的两种表达盒。工程化双稳态拨动开关还能够响应一种信号长期维持一种状态，和响应不同的信号快速地切换至另一种状态。各种设计可与工程化双稳态拨动开关组合以施加开关的控制。本文所述的工程化双稳态拨动开关可用于诊断或治疗应用(例如，治
疗性分子至受试者的长期递送)。
32.i.工程化双稳态拨动开关
33.本公开的一些方面提供工程化双稳态拨动开关。如本文所用，工程化双稳态拨动开关，是指设计成具有两种表达状态的一套两种表达盒。第一表达盒控制第一基因的表达，并且第二表达盒控制第二基因的表达。第一基因(例如，第一crispr内切核酸酶)的表达进一步激活其自身的表达，并且抑制第二基因的表达(第一基因高状态)。第二基因(第二crispr内切核酸酶)的表达进一步激活其自身的表达，并且抑制第一基因的表达(第二基因高状态)。在一些实施方式中，响应各种切换信号可在第一基因高状态和第二基因高状态之间切换工程化双稳态拨动开关。在一些实施方式中，在工程化双稳态拨动开关的第一基因高状态与第二基因高状态之间的切换可通过另外的调节元件(例如，蛋白降解结构域、小分子响应适配体或核酶)控制。
34.在一些实施方式中，本文所述的工程化双稳态拨动开关基于rna切割诱导的rna降解或稳定。这样的工程化双稳态拨动开关并入可编程内切核苷酸切断诱导的稳定性调谐(persist)平台至表达盒内，从而在拨动开关的不同状态之间控制、维持和切换。在一些实施方式中，persist平台包括用于rna稳定的rna水平开切换和用于rna降解的rna水平关切换。在一些实施方式中，rna水平关切换被设计成使得rna切割位点被放置在基因编码序列的5’处，并且随后在rna切割位点的切割导致rna降解和基因的抑制。在一些实施方式中，rna水平开切换被设计成使得rna切割位点被放置基因编码序列的3’处，并且随后在rna切割位点的切割导致rna稳定和基因的表达。rna水平开和关切换基于先前已经被描述的persist平台，如diandreth等，persist:a programmable rna regulation platform using crispr endornase,在2019年12月16日在biorxiv预印本首次网上发布(diandreth等，biorxiv.(2019).doi:10.1101/2019.12.15.867150)，其通过引用以其整体并入本文。
35.在一些实施方式中，通过将两种正交的rna切割效应子可识别的不同rna切割位点放置在rna切割效应子的编码序列的上游和下游，本公开的工程化双稳态拨动开关并入rna水平开切换和关切换二者至配置内。在一些实施方式中，本公开提供一种工程化双稳态拨动开关，其包括：(i)第一表达盒，其从5’至3’包括：可操作地连接至编码第一rna切割位点的第一拷贝的核苷酸序列第一启动子、第一rna切割效应子的第一拷贝的编码序列、编码第二rna切割位点的第一拷贝的核苷酸序列和编码多个rna降解基序的核苷酸序列；和(ii)第二表达盒，其从5’到3’包括：可操作地连接至编码第二rna切割位点的第二拷贝的核苷酸序列的第二启动子、第二rna切割效应子的第一拷贝的编码序列、编码第一rna切割位点的第二拷贝的核苷酸序列和编码多个rna降解基序的核苷酸序列；其中第一rna切割效应子正交于第二rna切割效应子，其中第一rna切割效应子能够切割第二rna切割位点，和其中第二rna切割效应子能够切割第一rna切割位点。
36.如本文所用，rna切割效应子是指这样的分子，其切割两种核糖核苷之间的磷酸二酯键，因此产生rna分子的两种片段(5
′
片段和3
′
片段)，例如由第一表达盒和第二表达盒产生的rna转录物。本公开的rna切割效应子以序列特异性方式切割rna转录物。示例性序列特异性rna切割效应子包括不限于内切核糖核酸酶、rna干扰(rnai)分子和核酶(例如，顺式作用核酶或反式作用核酶)。本公开的rna切割效应子可直接切割rna转录物(例如，内切核糖核酸酶或核酶)或间接导致rna转录物的切割(例如，经由其他执行切割的因子的募集)。间
接切割rna转录物的rna切割效应子的非限制性示例是rnai分子，其被并入在结合和切割rna转录物中的靶序列的rna-诱导的沉默复合物(risc)中。
37.在一些实施方式中，rna切割效应子是内切核糖核酸酶。如本文所用，“内切核糖核酸酶”是指以序列特异性方式(例如在识别位点)切割rna分子的核酸酶。序列特异性内切核糖核酸酶已在本领域中被描述。例如，火球菌(pyrococcus furiosus)crispr-相关内切核糖核酸酶6(cas6)被发现以序列特异性方式切割rna分子(carte等，genes&dev.2008.22:3489-3496)。在另外的示例中，工程化了以序列特异性方式切割rna分子的内切核糖核酸酶，其识别8-核苷(nt)rna序列和在靶中进行单个切割(choudhury等，nature communications 3,1147(2012))。
38.在一些实施方式中，内切核糖核酸酶属于crispr-相关内切核糖核酸酶。在一些实施方式中，内切核糖核酸酶属于crispr-相关内切核糖核酸酶6(cas6)家族。可使用来自不同细菌种类的cas6核酸酶。cas6家族核酸酶的非限制性示例包括cas6、csy4(还称为cas6f)、cse3和case。在一些实施方式中，内切核糖核酸酶属于crispr-相关内切核糖核酸酶13(cas13)家族。可使用来自不同细菌种类的cas13核酸酶。cas13家族核酸酶的非限制性示例包括cas13a、cas13b、cas13c和cas13d。在一些实施方式中，cas13家族核酸酶是wacas13a、pspcas13b、rancas13b、pgucas13b和rfxcas13d。
39.在一些实施方式中，由第一表达盒编码的第一rna切割效应子正交于由第二表达盒编码的第二rna切割效应子。如本文所用，“彼此正交”意指在工程化双稳态拨动开关中使用的两种rna切割效应子具有与彼此的识别位点最小的串扰。在一些实施方式中，在本文所述的工程化双稳态拨动开关中使用一对正交的crispr-相关内切核酸酶。在一些实施方式中，该对正交的crispr-相关内切核酸酶是case和csy4。内切核酸酶的正交性可通过本领域已知的方法评估，并基于正交性评估结果可选择不同对的内切核酸酶用于本文所述的工程化双稳态拨动开关。
40.编码csy4的示例性核苷酸序列以seq id no:1阐释：
41.atggaccactatctcgacattcggctgcgacctgacccggagtttcctcccgcccaacttatgagcgtgctgttcggcaaattgcaccaggccctggtagctcaaggcggtgaccgaattggagtgagcttccctgacctggatgagtctaggtcccgactgggtgagagactcagaatccacgcatccgccgacgacctcagagcactgctggcccgcccctggctggagggcctcagagatcacttgcagtttggagagccagccgtcgtgcctcaccctaccccatacaggcaagtgtctagagtccaggccaagagtaaccccgaacggctgcggcggaggttgatgaggcggcacgacctgtccgaagaagaggcacggaaaagaattcccgacaccgttgctagggctcttgatttgcccttcgtcacccttcgatcacagtccaccggacaacatttccgcctgttcattaggcacgggcctctgcaggtcactgccgaagagggcggattcacttgctacgggctgtccaagggagggttcgttccatggttctga
42.编码case的示例性核苷酸序列以seq id no:2阐释：
43.atgtacctcagtaagatcatcatcgcccgcgcttggtcccgtgacctgtaccaactgcaccaagagctctggcacctcttccccaacaggccagatgccgctagagacttcctgttccacgtggagaagcgtaacacccccgaagggtgccacgtgctgttgcagagtgcccagatgccagtgagtaccgctgttgccactgtcatcaagactaaacaagttgaattccaactgcaagtgggcgtccctctgtatttccgcctcagggccaaccccatcaaaaccatcctggacaaccagaagcggctggatagcaaaggtaatatcaagagatgccgcgtgcctctgatcaaggaggccgagcagatcgcttggctgcaacgcaagctgggtaacgccgcgagagtggaagatgtgcacccaatctccgagcgcccgcagtatttctccgggg
aggggaagaacggcaaaattcagactgtctgcttcgagggggtgctcactattaacgacgcccctgctctgatcgacctcctgcagcagggcattgggcccgcgaagagcatgggatgcggattgttgagcctggcacccctgtgagctttga
44.当内切核糖核酸酶用作rna切割效应子时，在rna转录物中rna切割效应子的rna切割位点包括内切核糖核酸酶的一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)识别位点。“内切核糖核酸酶的rna切割位点”是指被内切核糖核酸酶识别、结合和切割的核糖核苷酸序列。内切核糖核酸酶的识别位点可以是4-20个核苷酸长。例如，rna切割位点可以是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸长。在一些实施方式中，使用短于4个核糖核苷酸或长于20个核苷酸的内切核糖核酸酶切割位点。
45.在一些实施方式中，工程化双稳态拨动开关的第一表达盒包括：第一crispr-相关内切核酸酶的编码序列的5’处的第一rna切割位点的第一拷贝，和第一crispr-相关内切核酸酶的编码序列的3’处的第二rna切割位点的第一拷贝；和第二crispr-相关内切核酸酶的编码序列的5’处的第二rna切割位点的第二拷贝，和第二crispr-相关内切核酸酶的编码序列的3’处的第一rna切割位点的第二拷贝。在一些实施方式中，第一crispr-相关内切核酸酶和第二crispr-相关内切核酸酶彼此正交，第一crispr-相关内切核酸酶识别第二rna切割位点的第一和第二拷贝，和第二crispr-相关内切核酸酶识别第一rna切割位点的第一和第二拷贝。在一些实施方式中，通过第二rna切割效应子切割第一rna切割位点的第一拷贝和第二拷贝导致第二rna切割效应子的表达和第一rna切割效应子的抑制。在一些实施方式中，通过第一rna切割效应子切割第二rna切割位点的第一拷贝和第二拷贝导致第一rna切割效应子的表达和第二rna切割效应子的抑制。
46.在一些实施方式中，工程化双稳态拨动开关包括第一和第二分子的表达盒。在一些实施方式中，第一表达盒进一步包括可操作地连接至第一rna切割效应子的编码序列的第二输出分子的编码序列和位于第一rna切割效应子的编码序列与第二输出分子的编码序列之间的第一间隔区；和，第二表达盒进一步包括可操作地连接至第二rna切割效应子的编码序列的第一输出分子的编码序列和位于第二rna切割效应子的编码序列与第一输出分子的编码序列之间的第二间隔区。在一些实施方式中，第一和/或第二间隔区是内部核糖体进入位点(ires)或2a肽(例如，t2a或p2a)。在一些实施方式中，第一和第二输出分子被编码在来自第一和第二表达盒的不同构建体上。在一些实施方式中，工程化双稳态拨动开关进一步包括第一输出分子表达盒，其从5’至3’包括可操作地连接至下述的启动子：(i)任选地编码第二rna切割位点的第三拷贝的核苷酸序列、第一输出分子编码序列、和任选地编码第一rna切割位点的第三拷贝的核苷酸序列；和第二输出分子表达盒，其从5’至3’包括，可操作地连接至下述的启动子：(i)任选地编码第一rna切割位点的第三拷贝的核苷酸序列、第二输出分子编码序列、和任选地编码第二rna切割位点的第三拷贝的核苷酸序列。在一些实施方式中，第一输出分子和第二输出分子是不同的。
47.如本文所用，“输出分子”是指由工程化双稳态拨动开关产生的下游分子。在一些实施方式中，当工程化双稳态拨动开关偏向第一rna切割效应子高状态(第一高状态)时，第二输出分子的表达提高。在一些实施方式中，当工程化双稳态拨动开关偏向第二rna切割效应子高状态(第二高状态)时，第一输出分子的表达提高。在一些实施方式中，与第一高状态相比，当工程化双稳态拨动开关偏向第二高状态时，第一输出分子具有基础表达水平和表达水平提高(例如，相对于基础表达水平至少20％)。在一些实施方式中，与第二高状态相
比，当工程化双稳态拨动开关偏向第一高状态时，第二输出分子具有基础表达水平和表达水平提高(例如，相对于基础表达水平至少20％)。在一些实施方式中，与第一高状态相比，当在第二高状态时，第一输出分子的表达水平可以相对于基础表达水平是至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少100倍、至少1000倍或更高。在一些实施方式中，与第二高状态水平相比，当在第一高状态时，第二输出分子的表达水平可以相对于基础表达水平是至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少100倍、至少1000倍或更高。
48.在一些实施方式中，第一和第二输出分子是可检测的蛋白。在一些实施方式中，可检测的蛋白是荧光蛋白。荧光蛋白是当暴露于适当波长的光源(例如，蓝或紫外范围内的光)时发射荧光的蛋白。根据本公开可使用的合适的荧光蛋白包括但不限于：eyfp、mko2、tagbfp、egfp、ecfp、mkate2、mcherry、mplum、mgrape2、mraspberry、mgrape1、mstrawberry、mtangerine、mbanana和mhoneydew。在一些实施方式中，可检测的蛋白是水解底物产生可检测的信号(例如，化学发光信号)的酶。这样的酶包括但不限于β-半乳糖苷酶(由lacz编码)、辣根过氧化物酶或萤光素酶。在一些实施方式中，输出分子是荧光rna。荧光rna是当结合至荧光团并暴露于适当波长的光源(例如，蓝或紫外范围内的光)时发射荧光的rna适配体。可在本公开的传感器回路中用作输出分子的合适的荧光rna包括但不限于菠菜和西兰花(例如，如paige等，science vol.333,issue 6042,第642-646页，2011中描述的))。
49.在一些实施方式中，第一和第二输出分子是治疗性分子。“治疗性分子”是对疾病或病况具有治疗性效果，并且可用于治疗疾病或病况的分子。本公开的治疗性分子可以是基于核酸或基于蛋白或多肽的。
50.在一些实施方式中，基于核酸的治疗性分子可以是rna干扰(rnai)分子(例如，microrna、sirna或shrna)或核酸酶(例如，核酶)。rnai分子以及它们在沉默基因表达中的用途是本领域技术人员熟悉的。在一些实施方式中，rnai分子靶向癌基因。癌基因是在某些情况下可将细胞转化为肿瘤细胞的基因。癌基因可以是编码生长因子或分裂素(例如，c-sis)、受体酪氨酸激酶(例如，egfr、pdgfr、vegfr或her2/neu)、胞质酪氨酸激酶(例如，src家族激酶、syk-zap-70家族激酶或btk家族激酶)、胞质丝氨酸/苏氨酸激酶或它们的调控亚基(例如，raf激酶或细胞周期素依赖性激酶)、调节gtp酶(例如，ras)或转录因子(例如，myc)的基因。本领域技术人员熟悉可靶向癌症治疗的基因。
51.基于蛋白或多肽的治疗性分子的非限制性示例包括酶、调节蛋白(例如，免疫调节蛋白)、抗原、抗体或抗体片段以及结构蛋白。在一些实施方式中，基于蛋白或多肽的治疗性分子用于癌症疗法。
52.用于本公开的一些实施方式的合适的酶(用于可操作地连接至合成启动子)包括例如氧化还原酶、转移酶、聚合酶、水解酶、裂解酶、合成酶、异构酶和连接酶、消化酶(例如蛋白酶、脂肪酶、糖酶和核酸酶)。在一些实施方式中，酶选自由乳糖酶、β-半乳糖苷酶、胰酶、油降解酶、粘多糖酶、纤维素酶(cellulase)、异麦芽糖酶、藻酸酶(alginase)、消化脂肪酶(例如，舌脂肪酶、胰脂肪酶、磷脂酶)、淀粉酶、纤维素酶(cellulases)、溶菌酶、蛋白酶(例如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶、弹性蛋白酶)、酯酶(例如甾醇酯酶)、双糖酶(例如，蔗糖酶、乳糖酶、β-半乳糖苷酶、麦芽糖酶、异麦芽糖酶)、dna酶和rna酶组成的
组。
53.抗体及其片段的非限制性示例包括：贝伐单抗曲妥珠单抗阿尔妥珠单抗(指示用于b细胞慢性淋巴细胞性白血病)、吉妥珠单抗(hp67.6，抗cd33，指示用于白血病例如急性髓系白血病)、利妥昔单抗托西莫单抗(抗cd20，指示用于b细胞恶性肿瘤)、mdx-210(双特异性抗体，其同时结合至her-2/neu癌基因蛋白产物和免疫球蛋白g(igg)的i型fc受体(fcγri))、奥戈伏单抗(指示用于卵巢癌)、依决洛单抗达克珠单抗帕利妥珠单抗(指示用于呼吸道病况如rsv感染)、替伊莫单抗(指示用于非霍奇金淋巴瘤)、西妥昔单抗mdx-447、mdx-22、mdx-220(抗tag-72)、ior-c5、ior-t6(抗cd1)、ior egf/r3、西洛果瓦(ov103)、依帕珠单抗派姆妥莫单抗(pemtumomab)戈利奥单抗-h(gliomab-h)(指示用于脑癌、黑素瘤)。在一些实施方式中，抗体是抑制免疫检查点蛋白的抗体，例如抗pd-1抗体如派姆单抗或纳武单抗或抗ctla-4抗体如伊匹单抗如本文提供的，其他抗体和抗体片段可以可操作地连接至合成启动子。
54.在一些实施方式中，调节蛋白可以是转录因子或免疫调节蛋白。非限制性示例性转录因子包括：nfkb家族的那些，例如rel-a、c-rel、rel-b、p50和p52；ap-1家族的那些，例如fos、fosb、fra-1、fra-2、jun、junb和jund；atf；creb；stat-1、-2、-3、-4、-5和-6；nfat-1、-2和-4；maf；甲状腺因子；irf；oct-1和-2；nf-y；egr-1；和usf-43、egr1、sp1和e2f1。如本文提供的，其他转录因子可以可操作地连接至合成启动子。
55.如本文所用，免疫调节蛋白是调节免疫响应的蛋白。免疫调节蛋白的非限制性示例包括：抗原，佐剂(例如，鞭毛蛋白、胞壁二肽)、细胞因子包括白介素(例如，il-2、il-7、il-15或这些细胞因子的超激动剂/突变形式、il-12、ifn-γ、ifn-α、gm-csf、flt3-配体)和免疫刺激抗体(例如，抗ctla-4、抗cd28、抗cd3或这些分子的单链/抗体片段)。如本文提供的，其他免疫调节蛋白可以可操作地连接至合成启动子。
56.如本文所用，抗原是被抗体的抗原结合位点结合的分子或分子的一部分。在一些实施方式中，抗原是当施用于受试者的细胞中或在受试者的细胞中表达时，激活或提高特异性结合抗原的抗体的产生的分子或部分。病原体的抗原对于本领域技术人员是公知的，并且包括但不限于细菌、病毒和其他微生物的部分(壳、荚膜、细胞壁、鞭毛、菌毛和毒素)。根据本公开可使用的抗原的示例包括但不限于癌抗原、自身抗原、微生物抗原、过敏原和环境抗原。如本文提供的，其他抗原可以可操作地连接至合成启动子。
57.在一些实施方式中，本公开的抗原是癌抗原。癌抗原是优选由癌细胞表达的抗原(即，其以比非癌细胞上更高的水平在癌细胞中表达)，并且在一些情况下，其仅由癌细胞表达。癌抗原可表达在癌细胞内或癌细胞的表面上。根据本公开可使用的癌抗原包括但不限于mart-1/melan-a、gp100、腺苷脱氨酶结合蛋白(adabp)、fap、亲环素b、结直肠相关抗原(crc)
‑‑
c017-1a/ga733、癌胚抗原(cea)、cap-1、cap-2、etv6、aml1、前列腺特异性抗原
(psa)、psa-1、psa-2、psa-3、前列腺特异性膜抗原(psma)、t细胞受体/cd3-ζ链和cd20。癌抗原可选自由mage-a1、mage-a2、mage-a3、mage-a4、mage-a5、mage-a6、mage-a7、mage-a8、mage-a9、mage-a10、mage-a11、mage-a12、mage-xp2(mage-b2)、mage-xp3(mage-b3)、mage-xp4(mage-b4)、mage-c1、mage-c2、mage-c3、mage-c4和mage-c5组成的组。癌抗原可选自由gage-1、gage-2、gage-3、gage-4、gage-5、gage-6、gage-7、gage-8和gage-9组成的组。癌抗原可选自由bage、rage、lage-1、nag、gnt-v、mum-1、cdk4、酪氨酸酶、p53、muc家族、her2/neu、p21ras、rcas1、α-胎蛋白、e-钙黏素、α-连环素、β-连环素、γ-连环素、p120ctn、gp100pmel117、prame、ny-eso-1、cdc27、腺瘤性结肠息肉病蛋白(apc)、胞衬蛋白、接合素37、ig-独特型、p15、gp75、gm2神经节苷脂、gd2神经节苷脂、人乳头瘤病毒蛋白、肿瘤抗原的smad家族、lmp-1、p1a、ebv-编码核抗原(ebna)-1、脑糖原磷酸化酶、ssx-1、ssx-2(hom-mel-40)、ssx-3、ssx-4、ssx-5、scp-1和ct-7、cd20和c-erbb-2组成的组。如本文提供的，其他癌抗原可以可操作地连接至合成启动子。
58.在一些实施方式中，基于蛋白或多肽的治疗性分子是融合蛋白。融合蛋白是包括直接或间接(例如，经由接头)、经由肽键相互共价结合的两种异源蛋白、蛋白结构域或蛋白片段的蛋白。在一些实施方式中，融合蛋白由包括蛋白的编码区(其与另外的蛋白的编码区在框内，而无介于中间(interveneing)的终止密码子)的核酸编码，因此导致被该蛋白融合在一起的单个蛋白的翻译。
59.在一些实施方式中，第一和第二输出分子是功能分子。“功能分子”是指能够与其他分子或回路相互作用以发挥功能(例如，转录调节、dna或rna切割或任何酶活性)的分子。示例性功能分子包括而不限于酶(例如，不限于核酸酶)、转录调节物(例如，不限于激活剂和抑制剂)、rnai分子(例如，不限于sirna、mirna、shrna)和抗体。在一些实施方式中，功能分子是核酸酶(例如，位点特异性核酸酶例如csy4、cas6、case和cse3)。在一些实施方式中，功能分子是转录阻遏物(例如，不限于tetr、cnot7、ddx6、ppr10和l7ae)。在一些实施方式中，具有作为本文所述的切割-诱导的转录物稳定物的输出分子的功能分子允许切割-诱导的转录物稳定物进一步与下游基因回路相互作用，下游基因回路包括响应由切割-诱导的转录物稳定物产生的功能分子的元件。因此，可以实现基因回路的“分层”，允许多个水平的复杂调节。
60.在一些实施方式中，工程化双稳态拨动开关的第一表达盒在其3’处进一步包括多个rna降解基序，和/或工程化双稳态拨动开关的第二表达盒在其3’处进一步包括多个rna降解基序。“rna降解基序”是指指导rna转录物降解的顺式作用核苷酸序列，例如经由募集参与rna降解的酶至rna分子。为“顺式作用”是指rna降解基序是其指导降解的rna转录物的一部分。在一些实施方式中，降解基序存在于3’非翻译区(3’utr)或rna转录物中。在一些实施方式中，降解基序被附加在rna转录物的3’末端。在一些实施方式中，工程化双稳态拨动开关的第一表达盒和/或第二表达盒各自包括一个或多个rna降解基序。在一些实施方式中，如果第一表达盒的rna转录物或第二表达盒的rna转录物二者其一上的3’rna降解基序未被切割(例如，切割发生在位于转录物的5’末端的rna切割位点)，由于rna转录物中rna降解基序的存在，rna转录物会被快速降解。在一些实施方式中，如果第一表达盒的rna转录物或第二表达盒的rna转录物二者其一上的3’rna降解基序被切割(例如，切割发生在位于转录物的3’末端的rna切割位点，其去除rna降解基序)，rna转录物会是稳定的。
61.在一些实施方式中，工程化双稳态拨动开关的第一表达盒和/或第二表达盒各自包括多个rna降解基序。在一些实施方式中，工程化双稳态拨动开关的第一表达盒和/或第二表达盒各自包括一个或多个rna降解基序。在一些实施方式中，工程化双稳态拨动开关的第一表达盒和/或第二表达盒各自包括1-50个重复的rna降解基序。例如，工程化双稳态拨动开关的第一表达盒和/或第二表达盒各自包括1-10、1-20、1-30、1-40、1-50、10-50、10-40、10-30、10-20、20-50、20-40、20-30、30-50、30-40或40-50个重复的rna降解基序。在一些实施方式中，工程化双稳态拨动开关的第一表达盒和/或第二表达盒各自包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个rna降解基序。在一些实施方式中，工程化双稳态拨动开关的第一表达盒和/或第二表达盒各自包括多于50(例如，60、70、80、90、100或更多)个重复的rna降解基序。
62.rna降解基序的非限制性示例是募集脱腺苷化复合物、mirna靶位点、结合rna降解相关蛋白的适配体、或结合引起rna降解的工程化蛋白的适配体的序列。在一些实施方式中，rna降解基序是5-30个核苷酸长。例如，rna降解基序可以是5-30、5-25、5-20、5-15、5-10、10-30、10-25、10-20、10-15、15-30、15-25、15-20、20-30、20-25或25-30个核苷酸长。在一些实施方式中，rna降解基序是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸长。在一些实施方式中，使用更长(例如，》30nt)或更短(例如，《5nt)的rna降解基序。在一些实施方式中，rna降解基序包括天然存在于人转录物的3’utr并指导转录物降解的8-nt rna基序(例如，如geissler等，genes&dev.2016.30:1070-1085中描述的)。其他已知的导致rna转录物的降解的rna降解基序(例如，如wo2019027869；matoulkova等，rna biology,9:5,563-576,2012中描述的)也根据本公开可被使用，包括不限于：富含au元件、富含gu元件、富含ca元件和内含子。
63.在一些实施方式中，在rna转录物中rna降解基序的存在降低rna转录物的水平和/或半衰期至少30％。例如，在rna转录物中rna降解基序的存在可降低rna转录物的水平和/或半衰期至少30％、至少40％、至少50％、至少100％、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或更多。在一些实施方式中，在rna转录物中rna降解基序的存在降低rna转录物的水平和/或半衰期30％、40％、50％、100％、3倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多。
[0064]“启动子”是指核酸序列的控制区，在该控制区，核酸序列的剩余部分的转录起始和速率被控制。启动子驱动其调节的核酸序列的表达或驱动其调节的核酸序列的转录。启动子还可包括调节蛋白和分子可结合(例如rna聚合酶和其他转录因子)的亚区。启动子可以是组成型、诱导型、可激活的、可抑制的、组织特异性的或其任何组合。当启动子关于它所调节以控制(驱动)核酸序列的转录起始和/或表达的该核酸序列处于正确的功能位置和取向时，其被认为是“可操作地连接的”。在一些实施方式中，工程化双稳态拨动开关中的第一启动子和第二启动子是诱导型启动子或组成型启动子。
[0065]
在一些实施方式中，启动子是组成型启动子。组成型启动子的示例包括但不限于逆转录劳斯病毒肉瘤病毒(rsv)ltr启动子(任选地与rsv增强子)、巨细胞病毒(cmv)启动子(任选地与cmv增强子)(参见，例如，boshart等，cell,41:521-530(1985))、sv40启动子、二
氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(pgk)启动子和ef1α启动子[invitrogen]。在一些实施方式中，启动子是增强的鸡β-肌动蛋白启动子。在一些实施方式中，启动子是u6启动子。
[0066]
在一些实施方式中，启动子是“诱导型启动子”，其是指当在存在诱导物信号的情况下、由诱导物信号影响或由诱导物信号接触时，通过调节(例如，启动或激活)转录活性来表征的启动子。诱导物信号可以是内源的或通常的外源条件(例如，光)、化合物(例如，化学或非化学化合物)或以在调节来自诱导型启动子的转录活性方面是活性的这样的方式来接触诱导型启动子的蛋白。因此，核酸的“调节转录的信号”是指作用在诱导型启动子上的诱导物信号。根据所使用的调节系统，调节转录的信号可激活或灭活转录。转录的激活可涉及直接作用在启动子上以驱动转录或通过灭活阻止启动子驱动转录的阻遏物来间接作用在启动子上。相反，转录的失活可涉及直接作用在启动子上以阻止转录或通过激活然后作用在启动子上的阻遏物来间接作用在启动子上。本公开的诱导型启动子可由一种或多种生理条件例如光、ph、温度、辐射、渗透压、盐水梯度、细胞表面结合和一种或多种外在或内在诱导剂的浓度的变化来诱导(或抑制)。外在诱导物信号或诱导剂可包括但不限于氨基酸和氨基酸类似物、糖和多糖、核酸、蛋白转录激活物和阻遏物、细胞因子、毒素、石油基化合物、含金属化合物、盐、离子、酶底物类似物、激素或其组合。本公开的诱导型启动子包括本文描述的或本领域普通技术人员已知的任何诱导型启动子。诱导型启动子的示例包括但不限于化学/生化调节的和物理调节的启动子，例如醇调节的启动子、四环素调节的启动子(例如，无水四环素(atc)响应性启动子和其他四环素响应性启动子系统，其包括四环素阻遏蛋白(tetr)、四环素操纵序列(teto)和四环素反式激活融合蛋白(tta))、类固醇调节的启动子(例如，基于大鼠糖皮质激素受体、人雌激素受体、蛾蜕皮激素受体的启动子和类固醇/类视黄醇/甲状腺受体超家族的启动子)、金属调节的启动子(例如，源自来自酵母、小鼠和人的金属硫蛋白(结合和隔离金属离子的蛋白)基因的启动子)、发病机制调节的启动子(例如，由水杨酸、乙烯或苯并噻二唑(bth)诱导的)、温度/热可诱导的启动子(例如热激启动子)和光调节的启动子(例如，来自植物细胞的光响应启动子)。
[0067]
在一些实施方式中，工程化双稳态拨动开关的第一表达盒进一步包括编码位于第一rna切割效应子的第一拷贝的编码序列的3’处的第一转录物稳定序列的核苷酸序列；和/或工程化双稳态拨动开关的第二表达盒进一步包括编码位于第一rna切割效应子的第一拷贝的编码序列的3’处的第一转录物稳定序列的核苷酸序列。如本文所用，“转录物稳定序列”是指当存在于rna分子(例如，在5’末端或3’末端)中时保护rna分子不降解的rna序列。在一些实施方式中，转录物稳定序列形成阻断核糖核酸外切酶进入rna分子的未受保护的末端的二级结构。本公开的转录物稳定序列位于rna切割效应子(例如，crispr相关内切核酸酶)编码序列和3’rna切割位点之间，并且阻止rna切割效应子(例如，crispr相关内切核酸酶)的编码序列的降解。根据本公开可使用的rna稳定物的非限制性示例包括：合成聚腺苷酸化尾部、和稳定rna三螺旋结构(三链体)例如malat1(如brown等，nature structural&molecular biology 21,633
–
640,2014中描述的)，menβ三链体、kshv pan三链体和组蛋白茎环。在一些实施方式中，转录物稳定序列是三链体。在一些实施方式中，三链体是肺腺癌转移相关转录物1(malat1)三链体。
[0068]
转录物稳定序列稳定包括编码rna切割效应子和/或输出分子的核苷酸序列的rna
片段，通过rna切割效应子切割rna转录物而产生。与没有rna稳定物相比，当rna片段的半衰期比rna稳定物长至少20％时，认为rna片段被稳定。例如，与没有rna稳定物相比，当rna片段的半衰期被提高至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍或更多时，认为rna片段被稳定。在一些实施方式中，与没有rna稳定物相比，rna片段的半衰期被rna稳定物提高20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍或更多。
[0069]
在一些实施方式中，稳定物进一步有助于稳定包含编码输出分子的核苷酸序列的rna片段，通过rna切割物切割rna转录物而产生。在一些实施方式中，与没有rna稳定物相比，rna转录物的半衰期被rna稳定物提高至少30％。例如，与没有rna稳定物相比，rna转录物的半衰期可被rna稳定物提高至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍或更多。在一些实施方式中，与没有rna稳定物相比，rna片段的半衰期被rna稳定物提高20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍或更多。
[0070]
在一些实施方式中，rna转录物的稳定导致输出分子的提高的表达。在一些实施方式中，与降解信号被切割之前相比，当降解信号被切割时，输出分子的表达水平被提高至少20％。例如，与降解信号被切割之前相比，当降解信号被切割时，输出分子的表达水平可被提高至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍或更多。在一些实施方式中，与降解信号被切割之前相比，当降解信号被切割时，输出分子的表达水平被提高20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、5倍、10倍、50倍、100倍或更多。
[0071]
本公开还提供了被并入至工程化双稳态拨动开关中用于控制拨动开关行为的另外的元件。
[0072]
(i)具有蛋白水平降解结构域的工程化双稳态拨动开关
[0073]
本公开的工程化双稳态拨动开关可通过添加除由第一表达盒产生的第一rna切割效应子的量之外的第一rna切割效应子而被调制以偏向第一高状态；或工程化双稳态拨动开关可通过添加除由第二表达盒产生的第二rna切割效应子的量之外的第二rna切割效应子而被调制以偏向第二高状态。为了在两种状态之间容易地切换的目的，当它们融合至蛋白降解结构域时，另外的第一rna切割效应子和另外的第二rna切割效应子可被递送至已经包括工程化双稳态拨动开关的细胞。如本文所用，“蛋白降解结构域”是指诱导其融合的蛋白/多肽的降解的氨基酸序列。在一些实施方式中，这样的蛋白降解结构域响应小分子。在一些实施方式中，在不存在同源小分子的情况下，融合至蛋白降解结构域的蛋白被快速降解。在一些实施方式中，在存在同源小分子的情况下，融合至蛋白降解结构域的蛋白是稳定的并且可引发(elicit)其功能。在一些实施方式中，添加rna切割效应子-蛋白降解结构域融合蛋白的同源小分子可稳定融合蛋白并使rna切割效应子能够切割rna切割位点，从而使系统偏置至一种状态。
[0074]
在一些方面，本文所述的工程化双稳态拨动开关进一步包括：(iii)第三表达盒，其包括可操作地连接至第一融合蛋白的编码序列的第三启动子，其中第一融合蛋白包括融合至第一蛋白降解结构域的第一rna切割效应子的第二拷贝；和(iv)第四表达盒，其包括可
操作地连接至第二融合蛋白的编码序列的第四启动子，其中第二融合蛋白包括融合至第二蛋白降解结构域的第二rna切割效应子的第二拷贝，其中第三启动子和第四启动子各自是组成型启动子，其中第一蛋白降解结构域能够结合至第一小分子，其中第二蛋白降解结构域能够结合至第二小分子，和其中第一小分子和第二小分子是不同的。
[0075]
融合蛋白是包括直接或间接(例如，通过接头)或通过肽键相互共价结合的两种异源蛋白、蛋白结构域或蛋白片段的蛋白。在一些实施方式中，融合蛋白由包括蛋白的编码区(其与另外的蛋白的编码区在框内，无介于中间的终止密码子)的核酸编码，因此导致被该蛋白融合在一起的单个蛋白的翻译。
[0076]
在一些实施方式中，工程化双稳态拨动开关的第三表达盒的第一融合蛋白是第一rna切割效应子与一种或多种第一蛋白降解结构域之间的融合蛋白，和/或工程化双稳态拨动开关的第四表达盒的第二融合蛋白是第二rna切割效应子与一种或多种第二蛋白降解结构域之间的融合蛋白。在一些实施方式中，一种或多种第一蛋白降解结构域被融合至第一rna切割效应子的n-末端；和/或一种或多种第二蛋白降解结构域被融合至第二rna切割效应子的n-末端。
[0077]
在一些实施方式中，蛋白降解结构域是募集泛素、募集sumo、触发未折叠的蛋白响应、结合蛋白降解机制或通过任何其他方法提高蛋白的降解速率的序列。在一些实施方式中，蛋白降解结构域是ddd、dde或ddf。在一些实施方式中，融合蛋白是一个或多个ddd、ddd或ddf结构域和crispr相关内切核酸酶之间的任何组合。融合蛋白的非限制性示例是dde-csy4、dde-dde-csy4、ddd-csy4、ddd-ddd-csy4、dde-case、dde-dde-case、ddd-case、ddd-ddd-case、dde-cas6、dde-dde-cas6、ddd-cas6、ddd-ddd-cas6、dde-cse3、dde-dde-cse3、ddd-cse3、ddd-ddd-cse3、dde-lwacas13a、dde-dde-lwacas13a、ddd-lwacas13a、ddd-ddd-lwacas13a、dde-pspcas13b、dde-dde-pspcas13b、ddd-pspcas13b、ddd-ddd-pspcas13b、dde-rancas13b、dde-dde-rancas13b、ddd-rancas13b、ddd-ddd-rancas13b、dde-pgucas13b、dde-dde-pgucas13b、ddd-pgucas13b、ddd-ddd-pgucas13b、dde-rfxcas13d、dde-dde-rfxcas13d、ddd-rfxcas13d或ddd-ddd-rfxcas13d。在一些实施方式中，第一融合蛋白和第二融合蛋白是dde-dde-csy4和ddd-case。
[0078]
编码ddd结构域的示例性核苷酸序列以seq id no:3阐释：
[0079]
atgatcagtctgattgcggcgttagcggtagattacgttatcggcatggaaaacgccatgccgtggaacctgcctgccgatctcgcctggtttaaacgcaacaccttaaataaacccgtgattatgggccgccatacctgggaatcaatcggtcgtccgttgccaggacgcaaaaatattatcctcagcagtcaaccgagtacggacgatcgcgtaacgtgggtgaagtcggtggatgaagccatcgcggcgtgtggtgacgtaccagaaatcatggtgattggcggcggtcgcgttattgaacagttcttgccaaaagcgcaaaaactgtatctgacgcatatcgacgcagaagtggaaggcgacacccatttcccggattacgagccggatgactgggaatcggtattcagcgaattccacgatgctgatgcgcagaactctcacagctattgctttgagattctggagcggcgatga
[0080]
编码dde结构域的示例性核苷酸序列以seq id no:4阐释：
[0081]
atgagccttgccctgtcacttacagccgaccagatggtttccgcgcttctcgacgctgaacctccaattctctattccgaatacgacccaaccaggccgttctccgaggcatctatgatgggtctgctgacaaatctggcagacagggaactggtgcacatgatcaattgggcgaagcgcgtacccggattcgtcgatcttgcactccatgatcaggtgcacttgctggagtgcgcttggatggagatcctcatgatcgggctggtgtggcggagtatggaacaccccggcaagttgctg
tttgcgcctaacctcctgttggacaggaaccaggggaaatgtgtggagggcggtgtggaaatctttgacatgctcctcgctacctcaagccggtttaggatgatgaatctgcagggcgaagagttcgtgtgtctcaaatctatcatactgttgaacagcggagtctacaccttcctctccagtactctgaaatctctggaggagaaagatcatatccatcgcgtgctggacaagataaccgacacgttgattcacttgatggccaaagctgggctcactctgcaacaacaacatcagcgactggcacagctgttgctgattttgagccacattcggcacatgtccagcaagagaatggagcacctctatagtatgaagtgcaagaacgtcgtacccctgtcagatctgcttcttgaaatgcttgatgcccaccggtga
[0082]
编码dde-dde-csy4融合蛋白的示例性核苷酸序列以seq id no:5阐释：
[0083]
atgagccttgccctgtcacttacagccgaccagatggtttccgcgcttctcgacgctgaacctccaattctctattccgaatacgacccaaccaggccgttctccgaggcatctatgatgggtctgctgacaaatctggcagacagggaactggtgcacatgatcaattgggcgaagcgcgtacccggattcgtcgatcttgcactccatgatcaggtgcacttgctggagtgcgcttggatggagatcctcatgatcgggctggtgtggcggagtatggaacaccccggcaagttgctgtttgcgcctaacctcctgttggacaggaaccaggggaaatgtgtggagggcggtgtggaaatctttgacatgctcctcgctacctcaagccggtttaggatgatgaatctgcagggcgaagagttcgtgtgtctcaaatctatcatactgttgaacagcggagtctacaccttcctctccagtactctgaaatctctggaggagaaagatcatatccatcgcgtgctggacaagataaccgacacgttgattcacttgatggccaaagctgggctcactctgcaacaacaacatcagcgactggcacagctgttgctgattttgagccacattcggcacatgtccagcaagagaatggagcacctctatagtatgaagtgcaagaacgtcgtacccctgtcagatctgcttcttgaaatgcttgatgcccaccggctgatgagccttgccctgtcacttacagccgaccagatggtttccgcgcttctcgacgctgaacctccaattctctattccgaatacgacccaaccaggccgttctccgaggcatctatgatgggtctgctgacaaatctggcagacagggaactggtgcacatgatcaattgggcgaagcgcgtacccggattcgtcgatcttgcactccatgatcaggtgcacttgctggagtgcgcttggatggagatcctcatgatcgggctggtgtggcggagtatggaacaccccggcaagttgctgtttgcgcctaacctcctgttggacaggaaccaggggaaatgtgtggagggcggtgtggaaatctttgacatgctcctcgctacctcaagccggtttaggatgatgaatctgcagggcgaagagttcgtgtgtctcaaatctatcatactgttgaacagcggagtctacaccttcctctccagtactctgaaatctctggaggagaaagatcatatccatcgcgtgctggacaagataaccgacacgttgattcacttgatggccaaagctgggctcactctgcaacaacaacatcagcgactggcacagctgttgctgattttgagccacattcggcacatgtccagcaagagaatggagcacctctatagtatgaagtgcaagaacgtcgtacccctgtcagatctgcttcttgaaatgcttgatgcccaccggctgatggaccactatctcgacattcggctgcgacctgacccggagtttcctcccgcccaacttatgagcgtgctgttcggcaaattgcaccaggccctggtagctcaaggcggtgaccgaattggagtgagcttccctgacctggatgagtctaggtcccgactgggtgagagactcagaatccacgcatccgccgacgacctcagagcactgctggcccgcccctggctggagggcctcagagatcacttgcagtttggagagccagccgtcgtgcctcaccctaccccatacaggcaagtgtctagagtccaggccaagagtaaccccgaacggctgcggcggaggttgatgaggcggcacgacctgtccgaagaagaggcacggaaaagaattcccgacaccgttgctagggctcttgatttgcccttcgtcacccttcgatcacagtccaccggacaacatttccgcctgttcattaggcacgggcctctgcaggtcactgccgaagagggcggattcacttgctacgggctgtccaagggagggttcgttccatggttctga
[0084]
编码ddd-case融合蛋白的示例性核苷酸序列以seq id no:6阐释：
[0085]
atgtacctcagtaagatcatcatcgcccgcgcttggtcccgtgacctgtaccaactgcaccaagagctctggcacctcttccccaacaggccagatgccgctagagacttcctgttccacgtggagaagcgtaacacccccgaagggtgccacgtgctgttgcagagtgcccagatgccagtgagtaccgctgttgccactgtcatcaagactaaacaagttgaattccaactgcaagtgggcgtccctctgtatttccgcctcagggccaaccccatcaaaaccatcctggacaaccag
aagcggctggatagcaaaggtaatatcaagagatgccgcgtgcctctgatcaaggaggccgagcagatcgcttggctgcaacgcaagctgggtaacgccgcgagagtggaagatgtgcacccaatctccgagcgcccgcagtatttctccggggaggggaagaacggcaaaattcagactgtctgcttcgagggggtgctcactattaacgacgcccctgctctgatcgacctcctgcagcagggcattgggcccgcgaagagcatgggatgcggattgttgagcctggcacccctgatgatcagtctgattgcggcgttagcggtagattacgttatcggcatggaaaacgccatgccgtggaacctgcctgccgatctcgcctggtttaaacgcaacaccttaaataaacccgtgattatgggccgccatacctgggaatcaatcggtcgtccgttgccaggacgcaaaaatattatcctcagcagtcaaccgagtacggacgatcgcgtaacgtgggtgaagtcggtggatgaagccatcgcggcgtgtggtgacgtaccagaaatcatggtgattggcggcggtcgcgttattgaacagttcttgccaaaagcgcaaaaactgtatctgacgcatatcgacgcagaagtggaaggcgacacccatttcccggattacgagccggatgactgggaatcggtattcagcgaattccacgatgctgatgcgcagaactctcacagctattgctttgagattctggagcggcgatga
[0086]
如本文所用，术语“小分子”是指具有相对低的分子量的分子，无论是天然存在的还是人工创建的(例如，经由化学合成)。通常，小分子是有机化合物(即，其包含碳)。小分子可包含多个碳-碳键、立体中心和其他官能团(例如，胺、羟基、羰基和杂环等)。在某些方面，小分子的分子量是至多约1,000g/mol、至多约900g/mol、至多约800g/mol、至多约700g/mol、至多约600g/mol、至多约500g/mol、至多约400g/mol、至多约300g/mol、至多约200g/mol、或至多约100g/mol。在某些方面，小分子的分子量是至少约100g/mol、至少约200g/mol、至少约300g/mol、至少约400g/mol、至少约500g/mol、至少约600g/mol、至少约700g/mol、至少约800g/mol、或至少约900g/mol、或至少约1,000g/mol。上述范围的组合(例如，至少约200g/mol和至多约500g/mol)也是可能的。在某些方面，小分子是治疗活性剂例如药物(例如，由美国食品和药物管理局批准的如美国联邦法规(c.f.r.)中提供的分子)。小分子也可以与一种或多种金属原子和/或金属离子络合。在这种情况下，小分子也称为“小的有机金属分子”。优选的小分子是生物活性的，因为它们在动物，优选哺乳动物，更优选人类中产生生物效应。在某些方面，小分子是药物。优选地，尽管不必要，药物是已被适当的政府机构或监管机构认为用于人类或动物中是安全且有效的药物。例如，由fda在21c.f.r.
§§
330.5,331至361和440至460中列出批准用于人类用途的药物(通过引用并入本文)；由fda在21c.f.r.
§§
500至589中列出用于的兽医用途的药物(通过引用并入本文)。所有列出的药物都被认为用于根据本发明的用途是可接受的。
[0087]
在一些实施方式中，能够结合本文所述的蛋白降解结构域的小分子是4-羟基他莫昔芬(4-oht)和甲氧苄啶(tmp)。在一些实施方式中，可通过小分子4-羟基他莫昔芬(4-oht)稳定dde-dde-csy4，并且可通过甲氧苄啶(tmp)稳定ddd-case。
[0088]
此外，通过结合小分子至蛋白降解结构域能够使蛋白降解的逆向设计也在本公开的范围内。
[0089]
(ii)具有小分子响应适配体的工程化双稳态拨动开关
[0090]
可替代地，本公开的工程化双稳态拨动开关可被设计成将小分子响应适配体序列并入第一和第二rna切割位点的拷贝中。在一些实施方式中，小分子至在rna切割位点内的适配体的结合诱导rna切割发夹的构象变化，从而阻碍这样的rna切割位点通过其同源rna切割效应子(例如，crispr相关内切核酸酶)的结合和切割。
[0091]
在一些实施方式中，其中第一rna切割位点的第一和第二拷贝各自包括能够结合
至第一小分子的第一适配体序列，并且第一小分子至第一rna切割位点的结合能够阻断第二rna切割效应子切割第一rna切割位点；其中第二rna切割位点的第一和第二拷贝各自包括能够结合至第二小分子的第二适配体序列，并且第二小分子至第二rna切割位点的结合能够阻断第二rna切割效应子切割第一rna切割位点，并且其中第一小分子和所述第二小分子是不同的。
[0092]
在一些实施方式中，为了进一步调节rna降解速率和/或来自在工程化双稳态拨动开关中的第一和第二表达盒的转录物的翻译效率，上游开放阅读框(上游orf)可被放置在每个转录物的5’utr中。在一些实施方式中，上游开放阅读框是弱上游orf。在一些实施方式中，上游开放阅读框是强上游orf。编码弱上游orf的示例性核苷酸序列是cttatgggttga(seq id no:7)。编码强上游orf的示例性核苷酸序列是accatgggttga(seq id no:8)。
[0093]
此外，其中通过小分子至rna切割位点内的适配体序列的结合诱导的构象变化，使通过rna切割位点的同源rna切割效应子(例如，crispr相关内切核酸酶)能够结合和切割rna切割位点的逆向设计也在本公开的范围之内。
[0094]
(iii)具有核酶的工程化双稳态拨动开关
[0095]
可替换地，本公开的工程化双稳态拨动开关可被设计成在第一rna切割位点的第一拷贝和第二rna切割位点的第二拷贝的5’处并入rna自切割位点。
[0096]
在一些方面，工程化双稳态拨动开关的第一表达盒包括编码可操作地连接至第一启动子的第一rna自切割位点的核苷酸序列，并且其中编码第一rna自切割位点的核苷酸序列位于编码第一rna切割位点的第一拷贝的核苷酸序列的5’处；和其中第二表达盒包括编码可操作地连接至第二启动子的第二rna自切割位点的核苷酸序列，并且其中编码第二rna自切割位点的核苷酸序列位于编码第二rna切割位点的第二拷贝的核苷酸序列的5’处，其中第一rna自切割位点不同于第二rna自切割位点。
[0097]
在一些实施方式中，rna自切割位点是核酶。“核酶”是能够催化特定的生化反应(类似于蛋白酶的作用)的rna分子。在一些实施方式中，核酶是顺式作用核酶。“顺式作用核酶”是指从包含核酶自身的rna分子催化自切割(分子内或“顺式”催化)的核酶。在这些情况下，本公开的rna转录物中的rna切割器的切割位点包括顺式作用核酶，其一旦切割，切除自身并留下rna转录物的两个分离的片段。在一些实施方式中，核酶是反式作用核酶。如本文所用，“反式作用核酶”是指以特定方式切割外部底物的核酶。在这些情况下，本公开的rna转录物中的rna切割器的切割位点包括反式作用核酶的识别和切割位点。根据本公开可使用的合适的核酶及其各自的序列包括但不限于：rnase p、锤头状核酶、戴尔他肝炎病毒核酶、发夹状核酶、twister核酶、twister sister核酶、手枪型核酶、斧头状核酶、glms核酶、varkud卫星核酶和剪接体酶(spliceozyme)。可使用天然存在的核酶。此外，核酶被工程化，使得它们以顺式或反式切割它们的底物，例如，如carbonell等，nucleic acids res.2011mar；39(6):2432
–
2444中描述的。也可根据本公开使用最小的核酶(即，如scott等，prog mol biol transl sci.2013；120:1
–
23中所述的，核酶为其功能所需的最小序列)。
[0098]
在一些实施方式中，核酶能够在不存在小分子的情况下自切割。在一些实施方式中，小分子至核酶的结合诱导核酶的自切割。在一些实施方式中，第一小分子和第二小分子是不同的。
[0099]
此外，其中通过核酶同源小分子结合核酶来抑制核酶的自切割的逆向设计也在本公开的范围内。
[0100]
本文还提供了包括本文所述的工程化双稳态拨动开关的载体。工程化双稳态拨动开关的每个组分可被包括在一个或多个(例如，2、3或更多个)核酸分子(例如，载体)中并且被引入细胞中。“核酸”是共价连接在一起的至少两个核苷酸，并且在一些情况下，可包括磷酸二酯键(例如，磷酸二酯键“主链”)。核酸可以是dna(基因组和/或cdna二者)、rna或杂交体，其中核酸包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸(例如，人工或天然)的任何组合，以及碱基(包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷，黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤)的任何组合。本公开的核酸可使用标准分子生物学方法(参见，例如green和sambrook,molecular cloning,实验室手册,2012,cold spring harbor press)产生。
[0101]
在一些实施方式中，核酸使用gibsoncloning(参见，例如gibson,d.g.等，nature methods,343
–
345,2009；和gibson,d.g.等，nature methods,901
–
903,2010)产生。gibson典型地在单管反应中使用三种酶活性：5’外切核酸酶，dna聚合酶的3’延伸活性和dna连接酶活性。5’外切核酸酶活性咀嚼(chew back)5’末端序列并暴露互补序列进行退火。然后，聚合酶活性填充在退火区上的间隙中。然后，dna连接酶密封切口并将dna片段共价连接在一起。邻接片段的重叠序列比在golden gate assembly中使用的片段长得多，因此导致更高百分比的正确组装。
[0102]
在一些实施方式中，工程化双稳态拨动开关通过载体递送至细胞。“载体”是指用作媒介以将基因材料(例如，工程化核酸)人工携带至细胞(其中，例如它可被复制和/或表达)中的核酸(例如，dna)。在一些实施方式中，载体是附加型载体(episomal vector)(参见，例如van craenenbroeck k.等，eur.j.biochem.267,5665,2000)。载体的非限制性示例是质粒、rna复制子、病毒载体(例如raav、慢病毒)。质粒是能够在宿主细胞中自动复制的双链的大体环形的dna序列。质粒载体典型地包括允许质粒在宿主并且还有转基因插入物中半独立复制的复制起点。质粒可具有更多特征，包括例如“多克隆位点”，其包括用于插入核酸插入物的核苷酸悬臂(overhang)，以及至插入物的任一侧的多个限制性酶共有位点。载体的另一非限制性示例是病毒载体(例如，逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、辅助依赖性腺病毒系统、混合腺病毒系统、单纯性疱疹病毒、痘病毒、慢病毒、巴尔病毒)。在一些实施方式中，病毒载体源自腺相关病毒(aav)。在一些实施方式中，病毒载体源自单纯性疱疹病毒(hsv)。
[0103]
包含工程化双稳态拨动开关的表达盒的核酸或载体可通过本领域已知的用于递送核酸的任何方法递送至细胞。例如，为了将核酸递送至原核细胞，方法包括但不限于转化、转导、缀合和电穿孔。为了将核酸递送至真核细胞，方法包括但不限于转染、电穿孔和使用病毒载体。
[0104]
本文还提供了包括本文所述的工程化双稳态拨动开关或编码其的载体的细胞。“细胞”是所有已知的独立活的生物体的基本结构和功能单元。它被分类为生物的最小生命单元。一些生物体(例如大多数细菌)是单细胞的(由单个细胞组成)。其他生物体(例如人)是多细胞的。
[0105]
在一些实施方式中，用于根据本公开的用途的细胞是原核细胞，其可包括细胞被膜和胞质区，胞质区包括细胞基因组(dna)和核糖体以及各种种类的包含物。在一些实施方
式中，细胞是细菌细胞。如本文所用，术语“细菌”涵盖细菌的所有变体，例如原核有机体和蓝藻门。细菌是小的(典型的约1微米的线性尺寸)、非隔室化的、具有环形dna和70s的核糖体。术语细菌还包括真细菌和古细菌的细菌亚门。真细菌可进一步细分为革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，其取决于细胞壁结构中的差异。本文还包括单独基于总体形态学分类的那些(例如，球菌、杆菌)。在一些实施方式中，细菌细胞是革兰氏阴性细胞，和在一些实施方式中，细菌细胞是革兰氏阳性细胞。根据本发明可使用的细菌细胞的示例包括但不限于来自耶尔森氏菌属(yersinia spp.)、埃希氏菌属(escherichia spp.)、克雷伯氏菌属(klebsiella spp.)、博代氏菌属(bordetella spp.)、奈瑟氏菌属(neisseria spp.)、气单胞菌属(aeromonas spp.)、弗朗西氏菌属(franciesella spp.)、棒状杆菌属(corynebacterium spp.)、枸橼酸杆菌属(citrobacter spp.)、衣原体属(chlamydia spp.)、嗜血杆菌属(hemophilus spp.)、布鲁氏菌属(brucella spp.)、分枝杆菌属(mycobacterium spp.)、军团菌属(legionella spp.)、红球菌属(rhodococcus spp.)、假单胞菌属(pseudomonas spp.)、螺杆菌属(helicobacter spp.)、沙门氏菌属(salmonella spp.)、弧菌属(vibrio spp.)、芽孢杆菌属(bacillus spp.)、丹毒丝菌属(erysipelothrix spp.)、沙门氏菌属(salmonella spp.)、链霉菌属(stremtomyces spp)的细胞。在一些实施方式中，细菌细胞来自金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、丁酸梭菌(clostridium butyricum)、乳发酵短杆菌(brevibacterium lactofermentum)、无乳链球菌(streptococcus agalactiae)、乳酸乳球菌(lactococcus lactis)、乳酸明串珠菌(leuconostoc lactis)、链霉菌属(streptomyces)、放线共生放线杆菌(actinobacillus actinobycetemcomitans)、拟杆菌(bacteroides)、蓝细菌(cyanobacteria)、大肠杆菌(escherichia coli)、幽门螺杆菌(helobacter pylori)、反刍月形单胞菌(selnomonas ruminatium)、宋内志贺菌(shigella sonnei)、运动发酵单胞菌(zymomonas mobilis)、蕈状支原体(mycoplasma mycoides)、密螺旋体(treponema denticola)、苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis)、路邓葡萄球菌(staphlococcus lugdunensis)、酒明串珠菌(leuconostoc oenos)、干燥棒状杆菌(corynebacterium xerosis)、朗姆酒植物乳杆菌(lactobacillus planta rum)、粪链球菌(streptococcus faecalis)、凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)、蜡样芽孢杆菌(bacillus ceretus)、金龟子芽孢杆菌(bacillus popillae)、集胞藻属菌株pcc6803(synechocystis strain pcc6803)、液化芽孢杆菌(bacillus liquefaciens)、深海火球菌(pyrococcus abyssi)、名义单胞菌(selenomonas nominantium)、希氏乳杆菌(lactobacillus hilgardii)、野鼠链球菌(streptococcus ferus)、戊糖乳杆菌(lactobacillus pentosus)、脆弱类杆菌(bacteroides fragilis)、表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)、运动发酵单胞菌(zymomonas mobilis)、暗产色链霉菌(streptomyces phaechromogenes)、加纳链霉菌(streptomyces ghanaenis)、盐杆菌菌株grb(halobacterium strain grb)或嗜盐古菌菌株aa2.2(halobaferax sp.strain aa2.2).
[0106]
在一些实施方式中，用于根据本公开的用途的细胞是真核细胞，其包括在其中发生特定的代谢活动的膜结合的隔室，例如细胞核。用于根据本发明的用途的真核细胞的示例包括但不限于哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞(例如酿酒酵母)和植物细胞。在一些实
施方式中，真核细胞来自脊椎动物。在一些实施方式中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方式中，细胞是人细胞。在一些实施方式中，细胞来自啮齿目动物，例如小鼠或大鼠。用于根据本公开的用途的脊椎动物细胞的示例包括但不限于生殖细胞(包括精子、卵细胞和胚胎细胞)，以及非生殖细胞(免疫、肾、肺、脾、淋巴、心脏、胃、肠、胰腺、肌肉、骨、神经、脑和上皮细胞)。还可使用干细胞，包括胚胎干细胞或诱导多能干细胞。
[0107]
在一些实施方式中，细胞是患病细胞。如本文所用，与非患病(正常)细胞相比，“患病细胞”是指其生物学功能异常的细胞。在一些实施方式中，患病细胞是癌细胞。
[0108]
在一些实施方式中，细胞是用于重组蛋白产生的细胞。重组蛋白产生细胞的非限制性示例是中国仓鼠卵巢(cho)细胞、人胚肾(hek)-293细胞、非洲绿猴肾细胞(vero)细胞、非分泌裸(ns0)细胞、人胚胎视网膜(per.c6)细胞、sp2/0细胞、幼仓鼠肾(bhk)细胞、madin-darby犬肾(mdck)细胞、madin-darby牛肾(mdbk)细胞和由sv40(cos)细胞转化的猴肾cv1系。
[0109]
在一些实施方式中，工程化双稳态拨动开关被插入细胞的基因组中。将基因回路插入细胞中的基因组中的方法是本领域技术人员已知的(例如，经由位点特异性重组、使用任何已知的基因组编辑工具、或使用其他重组dna技术)。在一些情况下，与工程化以简单表达转基因(例如，经由转录调节)的细胞相比，将切割诱导的转录物稳定物整合至细胞的基因组中对于其应用(例如，治疗应用或生物制造应用)是有利的。已知基因工程化细胞遭受整合的转基因的表观基因沉默。然而，转基因的连续转录有助于阻止它们的沉默，这对于依赖转录抑制的转录调节的基因回路是不可能的。相反，本文所述的切割诱导的转录物稳定物依赖于rna水平调节，并且可实现转基因的连续转录。
[0110]
本文还提供了包括如本文所述的工程化双稳态拨动开关、编码其的载体、或包括工程化双稳态拨动开关的细胞的动物。在一些实施方式中，非人动物是哺乳动物。非人哺乳动物的非限制性示例是：小鼠、大鼠、山羊、牛、绵羊、驴、猫、狗、骆驼或猪。
[0111]
ii.药物组合物
[0112]
在一些方面，本公开至少部分涉及包括如本文所述的工程化双稳态拨动开关、包括其的载体、细胞的药物组合物。本文所述的药物组合物可进一步包括药学上可接受的载体(赋形剂)以形成用于治疗目标疾病的用途的药物组合物。“可接受的”意指载体必须与组合物的活性成分相容(并且优选地，能够稳定活性成分)并且对被治疗的受试者是无害的。药学上可接受的赋形剂(载体)包括缓冲剂，其在本领域中是众所周知的。参见例如remington:the science and practice of pharmacy,第20版(2000)lippincott williams和wilkins,ed.k.e.hoover。
[0113]
用于体内施用的药物组合物必须是无菌的。这容易通过例如通过无菌过滤膜的过滤来实现。本文所述的药物组合物可被放置在具有无菌进入口的容器中，例如，具有可被皮下注射针穿透的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
[0114]
在其他实施方式中，本文所述的药物组合物可配制用于肌内注射、静脉内注射、瘤内注射或皮下注射。
[0115]
本文所述的用于本方法的药物组合物以冻干剂型或水溶液形式可包括药学上可接受的载体、缓冲剂、赋形剂、盐或稳定剂。参见例如remington:the science and practice of pharmacy,第20版(2000)lippincott williams和wilkins,ed.k.e.hoover。
可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且可包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷基酯例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或右旋糖酐(dextrans)；螯合剂，例如edta；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的抗衡离子，例如钠；金属络合物(例如，zn-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂如tween
tm
,pluronics
tm
或聚乙二醇(peg)。
[0116]
在一些示例中，本文所述的药物组合物包括脂质纳米颗粒，其可通过本领域已知的方法制备，例如在epstein等，proc.natl.acad.sci.usa 82:3688(1985)；hwang等，proc.natl.acad.sci.usa 77:4030(1980)；和美国专利号4,485,045和4,544,545中所述。具有增强的循环时间的脂质体在美国专利号5,013,556中公开。特别有用的脂质体可通过用包括磷脂酰胆碱、胆固醇和peg衍生的磷脂酰乙醇胺(peg-pe)的脂质组合物的反相蒸发法产生。通过限定孔径的过滤器挤出脂质体以产生具有所需直径的脂质体。
[0117]
在其他示例中，本文所述的药物组合物可以以缓释形式配制。缓释制剂的合适的示例包括含有工程化双稳态拨动开关、包括其的载体或包括其的细胞的固体疏水性聚合物的半渗透性基质，所述基质是成形制品(例如，膜或微胶囊)的形式。缓释基质的示例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美国专利号3,773,919)、l-谷氨酸和7乙基-l-谷氨酸的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如lupron depot
tm
(包括乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林的可注射微球)、蔗糖乙酸异丁酸酯和聚-d-(-)-3-羟丁酸。
[0118]
合适的表面活性剂包括，特别是非离子试剂例如聚氧乙烯山梨聚糖(例如，tween
tm
20、40、60、80或85)和其他山梨聚糖(例如，span
tm
20、40、60、80或85)。具有表面活性剂的组合物会方便地包括在0.05％和5％之间的表面活性剂，并且可以在0.1和2.5％之间。应当理解，如果需要，可以添加其他成分，例如甘露醇或其他药学上可接受的载体。
[0119]
本文所述的药物组合物可以是单位剂量形式，例如片剂、丸剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、溶液或混悬剂、或栓剂，用于口服、肠胃外或直肠施用、或通过吸入或吹入施用。
[0120]
为制备固体组合物例如片剂，主活性成分可与药学上的载体(例如常规的压片组分，例如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶)以及其他药学上的稀释剂(例如水)混合，以形成包含本发明的化合物或其无毒的药学上可接受的盐的均匀混合物的固体预制剂组合物。当提及为均匀的这些预制剂组合物时，意味着活性成分遍及组合物均匀地分散，使得组合物可容易地细分为相等功效的单位剂量形式例如片剂、丸剂和胶囊。然后，将该固体预制剂组合物细分成包含从0.1至约500mg的本发明的活性成分的上述类型的单位剂量形式。新型组合物的片剂或丸剂可被涂覆或以其他方式混合以提供给予延长作用的优点的剂量形式。例如，片剂或丸剂可包括内部剂量和外部剂量组分，后者是以包络前者的形式。两种组分可通过用于抵抗胃中的分解，并允许内部组分完整地通过十二指肠或延迟释放的肠溶层分开。各种材料可用于这样的肠溶层或涂层，这些材料
包括许多聚合酸和聚合酸与这样的材料如虫胶、鲸蜡醇和乙酸纤维素的混合物。
[0121]
合适的乳液可使用商业可得的脂肪乳液例如intralipid
tm
、liposyn
tm
、infonutrol
tm
、lipofundin
tm
和lipiphysan
tm
制备。活性成分可溶解在预混合乳液组合物中或者可选地其可溶解在油(例如，大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)以及与磷脂(例如，蛋磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合后形成的乳液中。应当理解，其他成分可被添加，例如甘油或葡萄糖，以调整乳液的张力。合适的乳液典型地包含多达20％油，例如在5和20％之间。脂肪乳液可包括具有合适大小的脂肪滴并且可具有在5.5至8.0的范围内的ph。
[0122]
用于吸入或吹入的药物组合物包括在药学上可接受的水性或有机溶剂或它们的混合物中的溶液和悬浮液，以及粉末。液体或固体组合物可包括如上所述的合适的药学上可接受的赋形剂。在一些实施方式中，组合物通过口或鼻呼吸途径施用以用于局部或全身作用。
[0123]
在优选无菌的药学上可接受的溶剂中的组合物可通过使用气体雾化。雾化溶液可直接从雾化装置吸入，或者雾化装置可以连接至面罩、帐篷或间歇式正压呼吸机。溶液、悬浮液或粉末组合物可以以适当的方式从递送剂型的装置施用，优选口或鼻。
[0124]
iii.应用
[0125]
本公开至少部分涉及本文所述的工程化双稳态拨动开关的用途。
[0126]
在一些实施方式中，本公开提供了一种在第一输出分子与第二输出分子之间切换基因表达的方法，所述方法包括：向需要其的受试者施用本文所述的载体、细胞或组合物的工程化双稳态拨动开关。
[0127]
在一些实施方式中，本公开提供了一种维持长期开/关调节输出分子表达的方法，所述方法包括：向需要其的受试者施用本文所述的载体、细胞或组合物的工程化双稳态拨动开关。
[0128]
在一些实施方式中，本文所述的方法进一步包括向受试者施用第一小分子或第二小分子。在一些实施方式中，工程化双稳态拨动开关的施用被执行一生一次、每10年一次、每5年一次、每年一次、每六个月一次或每月一次。在一些实施方式中，与工程化双稳态拨动开关(例如，每月一次、每周一次、每隔一天一次、一天一次、一天两次或更多次)相比，更频繁执行保持工程化拨动开关处于一种状态的小分子的施用。
[0129]
本文所述的工程化双稳态拨动开关、载体、细胞和药物组合物可用于治疗各种疾病(例如，由工程化双稳态拨动开关产生的治疗性分子可治疗的疾病)。
[0130]
为实践本文公开的方法，本文所述的任何药物组合物的有效量可经由合适的途径(例如瘤内施用)，通过静脉内(例如，作为弹丸或通过一段时间的连续输注)，通过肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口、吸入或局部途径施用至需要治疗的受试者(例如人)。用于液体制剂的商业可得的雾化器(包括喷气式雾化器和超声雾化器)对于施用是有用的。液体制剂可以是直接雾化的，并且冻干粉末可以在重构之后雾化。可替代地，本文所述的药物组合物可以使用氟碳制剂和计量剂量吸入器雾化，或作为冻干和研磨的粉末吸入。在一些示例中，本文所述的药物组合物被配制用于瘤内注射。在特定的示例中，药物组合物可以经由例如注射至局部位点(例如肿瘤位点或感染位点)的局部途径施用至受试者(例如，人患者)。
[0131]
如本文所用，“有效量”是指单独或与一种或多种其他活性剂组合对受试者赋予治疗效果所需的每种活性剂的量。例如，治疗效果可降低肿瘤负荷、减少癌细胞、提高免疫活性、减少突变蛋白、减少过度活性免疫响应。确定工程化双稳态拨动开关的量是否达到治疗效果对于本领域技术人员会是显而易见的。如本领域技术人员所认识到的，有效量根据被治疗的特定病况、病况的严重性、个体患者参数(包括年龄、身体状况、大小、性别和体重)、治疗的持续时间、并行疗法(如果有的话)的性质、施用的具体途径和在健康从业者的知识和专业领域内的类似的因素而变化。这些因素对于本领域普通技术人员是公知的，并且可以用不超过常规实验来解决。通常优选使用各个组分或其组合的最大剂量，即，根据全面医学判断的最高安全剂量。
[0132]
经验方面的考虑例如半衰期通常会有助于剂量的确定。施用的频率可在治疗过程中被确定和调整，并且通常但不必要基于目标疾病/病症的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟。可替代地，本文所述的药物组合物的持续的缓释制剂可以是合适的。用于实现缓释的各种制剂和装置在本领域中是已知的。
[0133]
在一些实施方式中，治疗是本文所述的药物组合物的单一注射。在一些实施方式中，本文所述的方法包括向需要治疗的受试者(例如，人患者)施用本文所述的一个或多个剂量的药物组合物。
[0134]
在一些示例中，本文所述的药物组合物的剂量可在已经给予药物组合物的一次或多次施用的个体中凭经验确定。向个体给予本文所述的合成药物组合物的增量剂量。为了评估工程化双稳态拨动开关的功效，可以遵循疾病/病症的指示。对于几天或更长的重复施用，取决于病况，持续治疗直到发生期望的症状的抑制，或者直到达到足够的治疗水平以减轻目标疾病或病症或其症状。
[0135]
在一些实施方式中，给药频率是每周、每2周、每4周、每5周、每6周、每7周、每8周、每9周或每10周一次；或每个月、每2个月、或每3个月或更长时间一次。通过常规技术和测定容易地监测该疗法的进展。本文所述的药物组合物的给药方案可以随时间变化。
[0136]
出于本公开的目的，本文所述的药物组合物的适当剂量会取决于细胞的特定mirna特征和待表达mirna、疾病/病症的类型和严重性，本文所述的药物组合物用于预防或治疗目的、先前治疗、患者的临床历史和对工程化双稳态拨动开关的响应、以及主治医师的判断施用。临床医师可以施用本文所述的药物组合物，直到达到实现期望结果的剂量。确定剂量是否导致期望结果的方法对于本领域技术人员而言是显而易见的。本文所述的一种或多种药物组合物的施用可以是连续的或间歇的，取决于例如接受者的生理状况，无论施用的目的是治疗性的还是预防性的，以及本领域技术人员已知的其他因素。本文所述的药物组合物的施用可以在预选的时间段内基本上是连续的，或者可以以一系列间隔的剂量，例如在发展目标疾病或病症之前、期间或之后。
[0137]
如本文所用，术语“治疗”是指应用或施用包括一种或多种活性剂的组合物至具有目标疾病或病症、疾病/病症的症状或疾病/病症的倾向的受试者，目的是治愈、愈合、减轻、缓解、改变、补救、改良、改善或影响病症、疾病的症状或疾病或病症的倾向。
[0138]
减轻目标疾病/病症包括延迟疾病的发展或进展，或降低疾病严重程度。减轻疾病并不一定需要治疗结果。如其中所使用的，“延迟”目标疾病或病症的发展意味着推迟、阻碍、减慢、减缓、稳定和/或延缓疾病的进展。该延迟可以具有不同的时间长度，取决于所治
疗的疾病和/或个体的历史。与不使用所述方法相比，“延迟”或减轻疾病的发展，或延迟疾病的发作的方法，是降低在给定时间帧中发展疾病的一种或多种症状和/或减少给定时间帧中症状的程度的方法。这样的比较通常基于临床研究，使用足以给出统计学上显著的结果的多个受试者。
[0139]
疾病的“发展”或“进展”意指疾病的初始临床表现和/或随后的进展。可以使用本领域公知的标准临床技术来检测和评估疾病的发展。然而，发展也是指可以是无法检测的进展。出于本公开的目的，发展或进展是指症状的生物学过程。“发展”包括发生、复发和发作。如本文所用，目标疾病或病症的“发作”或“发生”包括初始发作和/或复发。
[0140]
通过本文所述的方法治疗的受试者可以是哺乳动物，例如人、家畜、运动动物(sport animals)、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠和大鼠。在一个实施方式中，受试者是人。
[0141]
在一些实施方式中，受试者可以是患有疾病、疑似患有疾病或处于患有疾病风险的人患者。适用于基于工程化双稳态拨动开关的疗法的疾病的非限制性示例是：α-1抗胰蛋白酶缺乏、高胆固醇血症、乙型肝炎感染(hepatitis b infection)、由于hiv感染引起的肝腺瘤、丙型肝炎病毒感染(hepatitis c virus infection)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏、肝细胞癌、肌萎缩性侧索硬化、脊髓小脑共济失调1型、亨廷顿氏病、帕金森病、脊髓延髓肌萎缩、丙酮酸脱氢酶缺乏症、增生、肥胖、兼性肱骨肌营养不良(facioscapulohumeral muscular dystrophy(fshd))、神经损伤诱导的神经性疼痛、年龄相关性黄斑变性、色素性视网膜炎、心力衰竭、心肌病、冷诱导的心血管功能障碍、哮喘、杜氏肌营养不良、感染性疾病或癌症。
[0142]
癌症的非限制性示例包括黑素瘤、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌(hepatocellular cancer)、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝细胞瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、胃癌以及各种类型的头颈癌包括鳞状细胞头颈癌。在一些实施方式中，癌症可以是黑素瘤、肺癌、结直肠癌、肾细胞癌、尿路上皮癌或霍奇金淋巴瘤。
[0143]
可通过常规医学检查(例如，实验室测试、器官功能测试、ct扫描或超声)来识别患有目标疾病或病症(例如，癌症或感染性疾病)的受试者。疑似患有任何这类目标疾病/病症的受试者可能显示疾病/病症的一种或多种症状。处于疾病/病症的风险下的受试者可以是具有与该疾病/病症相关一种或多种风险因素的受试者。这类受试者也可通过常规医学实践来识别。
[0144]
在一些实施方式中，本文所述的药物组合物可与另一合适的治疗剂(例如，抗癌剂、抗病毒剂或抗菌剂)和/或用于增强工程化双稳态拨动开关的效果的其他剂共同使用。在这类联合疗法中，本文所述的药物组合物和另外的治疗剂(例如本文所述的抗癌治疗剂或其他)可以顺序方式施用至需要治疗的受试者，即，每种治疗剂在不同的时间施用。可替代地，这些治疗剂或至少两种剂以基本上同时的方式施用至受试者。组合疗法还可以包括本文所述的剂的施用与其他生物活性成分(例如，不同的抗癌剂)和非药物疗法(例如，手术)进一步组合。
[0145]
iv.通用技术
[0146]
除非另有说明，否则本发明的实践会采用分子生物学(包括重组技术)，微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，其在本领域的技术范围内。molecular cloning:a laboratory manual,第二版(sambrook等，1989)cold spring harbor press；oligonucleotide synthesis(m.j.gait编辑，1984)；methods in molecular biology,humana press；cell biology:a laboratory notebook(j.e.cellis编辑，1998)academic press；animal cell culture(r.i.freshney编辑，1987)；introduction to cell and tissue culture(j.p.mather和p.e.roberts,1998)plenum press；cell and tissue culture:laboratory procedures(a.doyle,j.b.griffiths和d.g.newell编辑，1993-8)j.wiley和sons；methods in enzymology(academic press,inc.)；handbook of experimental immunology(d.m.weir和c.c.blackwell编辑)；gene transfer vectors for mammalian cells(j.m.miller和m.p.calos编辑，1987)；current protocols in molecular biology(f.m.ausubel等编辑，1987)；pcr:the polymerase chain reaction,(mullis等编辑，1994)；current protocols in immunology(j.e.coligan等编辑，1991)；short protocols in molecular biology(wiley和sons,1999)；immunobiology(c.a.janeway和p.travers,1997)；antibodies(p.finch,1997)；antibodies:a practical approach(d.catty.编辑，irl press,1988-1989)；monoclonal antibodies:a practical approach(p.shepherd和c.dean编辑，oxford university press,2000)；using antibodies:a laboratory manual(e.harlow和d.lane(cold spring harbor laboratory press,1999)；the antibodies(m.zanetti和j.d.capra编辑，harwood academic publishers,1995)。在没有进一步详细阐述的情况下，相信本领域技术人员可以基于以上描述来最大程度地利用本发明。因此，以下具体实施方式被解释为仅仅是说明性的，并且无论如何不以任何方式限制本公开的其余部分。
[0147]
在没有进一步详细阐述的情况下，相信本领域技术人员可以基于以上描述来最大程度地利用本发明。因此，以下具体实施方式被解释为仅仅是说明性的，并且无论如何不以任何方式限制本公开的其余部分。本文引用的所有出版物均通过引用并入用于本文参考的目的或主题。
[0148]
实施例
[0149]
实施例1：工程化双稳态拨动开关
[0150]
在哺乳动物系统中，工程化合成基因回路中的重要挑战是表观基因沉默。已在大量细胞类型(包括干细胞、神经元、用于抗体产生的cho细胞和hek293细胞)中观察到转基因沉默。表观基因沉默也已被显示为依赖于基因的转录状态，其中强组成型表达可消除沉默。由于当前基因回路通常完全依赖于改变转录活性，因此这类基因回路遭受表观基因沉默是不令人惊讶的。此外，许多基因回路以mrna递送。尽管基于rna的疗法相对于基于dna的疗法是有利的，诸如基于rna的回路不能被转录控制调节的事实等问题仍然存在。转录后调节平台可被设计以克服这些障碍。这样的平台会允许整合的转基因从验证的组成型启动子连续表达以对抗表观基因沉默，而调节可以在转录后进行编程。
[0151]
然而，合成生物学领域没有产生已显示好的在高与低状态之间的倍数变化、在很多天内这些状态的稳定性以及对切换事件的响应性的哺乳动物拨动开关。
[0152]
本公开的工程化双稳态拨动开关使细胞能够响应来自用户的输入而在稳定状态
之间切换，同时确保这些状态支持持久的且长期的细胞活性诸如基因表达。这些稳定状态包括但不限于打开和关闭感兴趣的蛋白的产生，以及在不同感兴趣的蛋白的产生之间进行切换。这些感兴趣的蛋白可以是分泌的或胞内的，并且可具有治疗功效，用于改变修饰的细胞或其他细胞的行为或者允许研究感兴趣的基因的作用。与需要连续的用户输入(例如，连续递送小分子)的“药物-开(drug-on)”系统不同，本公开的工程化双稳态拨动开关能够响应瞬态输入而切换状态，并且然后在没有进一步输入的情况下维持新状态。因此，拨动开关在治疗环境(其中维持连续药物浓度作为药物-开系统的输入在逻辑上具有挑战性)或者在生物制造环境(其中维持连续药物浓度可能非常昂贵)中特别有用。
[0153]
尽管在细菌系统中拨动开关的成功，但在长时间尺度上起作用的拨动的构建在哺乳动物细胞中是特别具有挑战性的。迄今已展现出长期生物稳定性和响应输入的切换的仅可用的拨动开关已经经由感兴趣的基因的转录调节来实现拨动，但是哺乳动物细胞倾向于表观沉默在转录水平合成调节的基因。例如，众所周知，非活性的合成转录单元(例如，处于关(off)状态的拨动的分支)难以(重)激活。本文呈现的拨动方法不同之处在于它采用基于rna降解的可编程内切核苷酸切断诱导的稳定性调谐(persist)平台，从而允许在组分被组成地表达的情况下创建拨动开关而无转录调节，并且因此可以在非常长的时间尺度上是稳定的。已经在2019年12月16日在biorxiv预印本首次网上发布的diandreth等，persist:a programmable rna regulation platform using crispr endornases(diandreth等，biorxiv.(2019).doi:10.1101/2019.12.15.867150)中描述了persist系统。persist平台提供rna切割事件以充当开或关切换。这些切割事件可以经由rnase、核酶、小rna和其他rna切割的效应子发生。如果切割事件发生在转录物的5’utr中，在转录物中编码的基因会缺乏对于翻译重要的5’转录物帽，并因此被抑制；如果切割事件发生在一系列rna降解基序之前和malat1三链体结构之后的3’utr中，切割会稳定转录物并导致编码基因的激活(图1a-1b)。persist平台包括在cas6和cas13b家族中使用crispr endornase来切割包含大约20个碱基对的识别序列的rna。persist平台中的9种endornase中的每一种对于其自身的识别序列是特异性的，从而允许一部分组成复杂的回路。
[0154]
首先，设计了通过转录物降解的调节来能够打开或关闭转基因表达的rna水平开关。设计了rna水平关-切换，使得转录物切割位点位于转基因的5’处，并且在该位点的切割(例如通过mirna或内切核糖核酸酶(例如，crispr内切核酸酶))可减少转基因表达(图1a，左)。接下来，设计了rna水平开切换以响应转录物切割来激活基因表达。这样的rna-水平开切换被设计成具有三个结构域(图1a，右)：(1)rna降解基序，其引起转录物的快速降解，(2)切割结构域，其允许降解标签的去除，和(3)稳定物，其允许有效翻译和在rna降解基序的去除之后保护mrna。因此，转录物在不存在切割事件的情况下被降解并在切割后被稳定。测试了9种内切核酸酶的每一种切割它们各自的靶位点作为rna水平开和关切换的能力(图1b)。
[0155]
为了证明平台的效用，评估了不同crispr内切核酸酶的正交性。特别地，为了作为可在基因回路中使用的平台，endornase平台应具有几种特征：(1)cas蛋白应相互正交，即，具有与相互的识别位点的最小交互；(2)cas蛋白识别位点对应是模块化的，使得识别位点可位于5
’‑
关或3
’‑
开persist开关位置二者其一(以任何顺序或组合)中并且具有可预测的行为，以及(3)由endornase启动的调节应是可组合的，也就是说，它应当能够连接endornase以创建分层回路。
[0156]
通过用每个成对组合的cas响应persist-关报告物测试每种endornase来评估endornase的正交性。值得注意的是，case强烈地切割cse3识别发夹，但是在cse3识别基序(cse3*)中的单个突变u5a使得其仅通过cse3并非case是可切割的。如图1c中所看到的，endornase的正交性表明，这些蛋白组可在相同的回路内使用。值得注意的是，应避免一些对(除非对回路设计有益)例如rancas13b:pgucas13b和case:cse3(具有野生型cse3识别位点)。鉴于具有识别和切割特异性rna识别基序的能力的大量表征的cas家族蛋白，persist存在扩展超过在此表征的九种蛋白的潜力，使persist可扩展对大且高度复杂的基因回路的构建。
[0157]
因此，将persist平台rna-水平开和关切换组合以配置本公开的工程化双稳态拨动开关。这样的工程化双稳态拨动开关包括两种endornase，它们相互抑制并且也激活它们自身(图2a-2c)。基于endornase的评价，首先选择在工程化双稳态拨动开关中测试的csy4和case对。工程化双稳态拨动开关被设计成具有两种表达盒：(i)csy4-pest，从5’至3’包括可操作地连接至case切割位点的第一拷贝的第一启动子、csy4的编码序列、csy4切割位点的第一拷贝、malt1三链体和多个rna降解基序；和(ii)case-pest，从5’至3’包括可操作地连接至csy4切割位点的第二拷贝的第二启动子、case的编码序列、case切割位点的第二拷贝、malt1三链体和多个rna降解基序(图2a)。当3’切割去除多个降解结构域(它不需要存在于工程化双稳态拨动开关中)时，malt1三链体提高rna稳定性。经由两种荧光蛋白(每种荧光蛋白由一种endornase抑制)读出拨动的状态。在这种情况下，由于mko2编码序列的5’csy4切割位点，csy4的表达抑制mko2表达；并且由于eyfp编码序列的5’case切割位点，case抑制eyfp表达。然而，可以在拨动开关的相同启动子或在不同启动子二者其一下表达输出分子的情况也在当前公开的范围内。
[0158]
将具有上文所示的persist基序的编码csy4和case的质粒，连同携带来自每种endornase的persist抑制基序的荧光报告物质粒通过多转染转染至hek293ft细胞中，并在转染后2天进行分析。双稳态拨动开关能够跨越宽范围的比率(其因由于转染引起的不同细胞接收不同拷贝数的质粒造成)显示生物稳定性。递送至每个细胞的基因回路基本上执行加权随机决策以展现csy4高(eyfp高)或case高(mko2高)状态。
[0159]
进行了另外的实验以显示上述双稳态拨动开关可通过添加csy4或case从一种状态切换至另一种状态。如图2c所示，一天后用诱导物endornase：csy4、case或假质粒(dummy plasmid)转染拨动开关转染的细胞，并分析两天以上。计算每个状态中的细胞百分比(高-mko2/低-eyfp、高-eyfp/低-mko2、高-eyfp/高-mko2和低-eyfp/低-mko2)。没有用荧光蛋白跟踪诱导物endornase转染效率，因此无论转染状态如何，值代表所有细胞的评估。数据表明，与没有引入诱导物endornase的拨动对照样本相比，用endornase转染的细胞的较大百分比显示切换至预期状态。
[0160]
实施例2：具有蛋白水平降解结构域的工程化双稳态拨动开关
[0161]
可以将另外的元件并入至基本的工程化双稳态拨动开关中，用于在一种状态下的长期稳定性以及在两种不同状态之间快速切换。在本公开的一个方面，为实现在实施例1中描述的工程化双稳态拨动开关的csy4高状态或case高状态，利用了响应小分子的蛋白水平降解结构域。测试了各种蛋白去稳定化结构域，例如ddd、dde和ddf。当这样的蛋白降解结构域融合至蛋白时，去稳定化结构域诱导其融合的任何蛋白的降解，除非它结合至小分子。在
该设计中，使用实施例1中相同的工程化双稳态拨动开关，以及两个另外的转录单元。另外的转录单元中的每一个分别组成地表达融合至不同蛋白降解结构域的persist rnase中的一个。在不存在可与相应的蛋白降解结构域结合的小分子的情况下，融合的persist rnase会被降解；然而，将相应的小分子引入系统会抑制persist rnase的降解。该设计允许工程化双稳态拨动开关如先前所示起作用，但取决于添加至系统的小分子配体来稳定或切换状态(图3a)。由于dde和ddd响应fda批准的小分子：分别为4-羟基他莫昔芬(4-oht)和甲氧苄啶(tmp)，选择了它们作为去稳定化结构域。编码ddd和dde结构域的核苷酸序列以在seq id no:3和seq id no:4阐释。ddd或dde被融合至persist rnase的n-末端。
[0162]
开发该体系的第一步是在persist rnase与ddd或dde的拷贝之间工程化融合蛋白。融合至csy4、case、cse3、pspcas13b和rfxcas13d的n末端的ddd、ddd-ddd、dde和dde-dde的所有组合都会被构建和测试。在不存在小分子的情况下，这样的融合蛋白会被降解并且缺乏rna切割活性；当相应的小分子存在(例如，4-oht用于dde以及tmp用于ddd)时，融合蛋白会被稳定，使得它们可切割它们各自的靶rna位点
[0163]
首先选择csy4分别与ddd结构域或dde结构域的一个拷贝或两个拷贝融合：dde-csy4、dde-dde-csy4、ddd-csy4和ddd-ddd-csy4。使用各种启动子(例如phef1a、pubc和pphlf)来驱动csy4或csy4-降解结构域融合蛋白的表达。在存在gal4-nls-vp64的情况下测试pphlf启动子。结果，产生以下构建体：phef1a-csy4、pubc-ddd-csy4、pubc-ddd-ddd-csy4、pphlf-ddd-ddd-csy4、pphlf-ddd-csy4-pest、pphlf-dde-csy4、pubc-dde-csy4、pubc-dde-csy4-pest、pphlf-dde-dde-csy4、pubc-dde-dde-csy4和pubc-dde-dde-csy4-pest。将实施例1中描述的构建体和工程化双稳态拨动开关中的每一个通过多转染递送至细胞(gam等，a
‘
poly-transfection’method for rapid,one-pot characterization and optimization of genetic systems,nucleic acids research,第47卷,第18期,2019年10月10日,第e106页)。输出分子是eyfp和tagbfp。该系统被设计成使得csy4抑制eyfp和case抑制tagbfp。在case高状态的细胞表达eyfp以及在csy4-高状态的细胞表达tagbfp。将case与csy4之间的比率设定为case是csy4的6.7倍，使系统在不存在另外的蛋白的情况下偏向case-高状态。
[0164]
如图3b所示，通过分箱(binning)多转染(多转染比率显示在每行中)来实现工程化双稳态基序与dd-csy4融合蛋白之间的比率。作为对照，在没有小分子、用4-oht或用tmp的情况下，没有dd的phef1a-csy4能够切换工程化双稳态基序至csy4高状态。不论启动子，相比于没有，当4-oht存在特别是在较高比例的箱(bin)中时，dde-csy4和dde-dde-csy4显示在tagbfp高状态的较高级分的细胞。例如，在不存在4-oht(顶行)和存在4-oht(底行)的情况下，显示了具有dde-csy4与工程化双稳态基序在1.5:1和30:1比率之间的细胞被分箱至(binned into)tagbfp-高、eyfp-高、tagbfp和eyfp-高或关状态中。如所预测的，在不存在4-oht的情况下eyfp高状态占主导，而在存在4-oht的情况下tagbfp高状态占主导。在该实验中，dde-csy4和dde-dde-csy4显示了(i)在不存在4-oht的情况下被降解；和(ii)在存在4-oht的情况下有效地切割rna的最佳能力(图2)。
[0165]
此外，如上所述类似地筛选case与一个或多个ddd结构域之间的融合蛋白。在该实验中，仅测试了hef1a启动子。将实施例1中描述的构建体和工程化双稳态拨动开关中的每一个通过多转染递送至细胞。输出分子是eyfp和tagbfp。该系统被设计成使得csy4抑制
eyfp并且case抑制tagbfp。在case高状态的细胞表达eyfp以及在csy4高状态的细胞表达tagbfp。将case与csy4之间的比率设定为case是csy4的1.6倍，使系统在不存在另外的蛋白的情况下偏向case-高状态。作为对照，在不用或用tmp的情况下，没有dd的case能够将工程化双稳态基序切换至case高状态。作为示例，在不存在tmp(顶行)和存在tmp(底行)的情况下，显示了具有ddd-case与工程化双稳态基序在1.5:1和15:1比率之间的细胞被分箱至tagbfp-高、eyfp-高、tagbfp和eyfp高或关状态中。ddd-case被鉴定为更好地(i)在不存在tmp的情况下被降解；和(ii)在存在tmp的情况下有效地切割rna(图3c)。
[0166]
进一步测试了ddd-case和dde-dde-csy4对在不存在小分子的情况下相互平衡，以及当添加4-oht或tmp时ddd-case和dde-dde-csy4对分别将工程化双稳态拨动开关偏向case或csy4高状态的能力。图3d显示了dd-endornase融合蛋白如何控制工程化双稳态拨动开关的示意性设计。在不存在相应的小分子的情况下，dde-dde-csy4和ddd-case被产生但被快速降解，对工程化双稳态拨动开关施加最小的影响。当添加4-oht时，dde-dde-csy4蛋白被稳定，抑制case-pest和eyfp并激活csy4-pest。在这种情况下，工程化双稳态拨动开关可以稳定在mko2高状态(图3e)。当添加tmp时，ddd-case蛋白被稳定，抑制csy4-pest和mko2并激活case-pest。输出荧光蛋白基因还可包含persist激活结构域以降低在关状态中的表达。在这种情况下，工程化双稳态拨动开关可被稳定在mko2高状态(图3f)。为测试图3d中的系统，将case-pest、csy4-pest、ddd-case和dde-dde-csy4瞬时转染至hek293细胞中并用10μm 4-oht(fig.3g)或10μm tmp(fig.3h)二者其一培养2天。然后通过流式细胞术分析细胞，并且流式细胞术图中所显示的数据分别指示由于mko2和eyfp每个细胞的红色和黄色荧光；条形图指示分箱至mko2-高(mko2》150a.u.&eyfp《150a.u.)、eyfp-高(mko2《150a.u.&eyfp》150a.u.)、两者-高和非高-箱的细胞的级分。mko2展现出7.7的平均倍数变化和16.2的中值倍数变化；eyfp显示3.5的平均倍数变化和6.1的中值倍数变化。进一步，用case-pest、csy4-pest、ddd-case和dde-dde-csy4瞬时转染hek293细胞，并且在没有小分子的情况下培养24小时。在添加小分子之前，流式细胞术运行24小时，指示大致相等水平的mko2和eyfp表达。接下来，在24小时将10μm tmp添加到系统中并维持48小时。此时，流式细胞术指示系统现在显示了比mko2表达更高的eyfp表达频率(图3i)。此外，一旦从系统中去除相应的小分子，工程化双稳态拨动开关就能够维持csy4-高/case-低或csy4-低/case-高状态二者其一。如图3j所示，添加4-oht至系统中24小时，诱导双稳态拨动开关稳定在csy4-高/case-低状态(mko2-高/eyfp-低)。有趣的是，在去除4-oht后，这样的状态维持至少72小时。类似地，添加tmp至系统中24小时，诱导双稳态拨动开关稳定在csy4-低/case-高状态(mko2-低/eyfp-高)，并且在去除tmp之后，这样的状态维持至少72小时。
[0167]
此外，可以调制该系统中的每个组分的表达水平，以达到在关状态最小化输出蛋白而在开状态下最大化输出蛋白。这样的调制可以在瞬时转染环境或基因组整合环境中进行。在瞬时转染的系统中，可操纵转染混合物中的每个构建体的量；在基因组整合环境中，可应用几种方法。例如，回路中的基因可被整合至基因组中多次(例如，以获得表达水平比基因b高两倍的基因a，编码基因a的转录单元会被整合为基因b位置的两倍)。可替代地，回路中使用的基因可被放置在响应输入信号的诱导型启动子(例如，teton或tetoff启动子)的控制下，并且表达的程度可通过添加至系统的输入信号的量来调制。此外，回路中的基因可被放置在不同强度的组成型启动子的控制下。而且，回路中的转录单元可包括调制不同
转录物的rna降解速率(诸如persist中使用的降解结构域)或转录物的翻译效率(例如5’utr中的上游开放阅读框(uorf))的元件。生成具有uorf的单一质粒构建体使得该系统中的每个组分具有调制它们的表达水平的uorf。
[0168]
实施例3：具有小分子响应适配体的工程化双稳态拨动开关
[0169]
可替代地，实施例1中描述的工程化双稳态拨动开关可被设计成能够响应不同的小分子以在不同的状态之间切换系统。在该系统中，endornase靶位点的每一个可包括小分子响应适配体。小分子至适配体的结合稳定阻断endornase切割其识别发夹的适配体rna的二级结构。如通过图4a说明的，crispr-endornase识别发夹包含能够结合至小分子的适配体序列。在不存在小分子的情况下，endornase能够切割识别发夹；然而，小分子至系统的添加诱导endornase靶发夹的构象变化，并且这样的构象变化使得endornase不能结合和切割其靶发夹。进行了概念测试的初步验证以证明上述概念。在该实验中，包含茶碱响应适配体的case靶发夹被放置在eyfp表达构建体中的eyfp编码序列的5’处。将该eyfp表达构建体与表达case的另一构建体共递送至hek293细胞。在不存在茶碱的情况下，case能够切割位于eyfp编码序列的5’处的靶发夹并抑制其表达(图4b)；然而，在存在茶碱的情况下，case对eyfp的抑制消失(lifted)，由eyfp表达的两倍提高来显示(图4c)。
[0170]
将此类适配体序列并入工程化双稳态拨动开关中的endornase靶位点中，会使工程化双稳态拨动开关能够通过小分子来控制。图4d-4e显示csy4对其靶位点(具有响应小分子的适配体序列的靶位点)的结合和切割如何通过在工程化双稳态拨动开关不存在小分子(fig.4d)或存在小分子(fig.4e)来控制的示意性设计。
[0171]
当前设计的相反设计也在目前公开的范围内，可以设计相反的工程化双稳态拨动开关，使得小分子至endornase靶位点中的适配体序列的结合可能够结合和切割这样的靶位点。
[0172]
实施例4：具有核酶的工程化双稳态拨动开关
[0173]
实施例1中的工程化双稳态拨动开关还可被设计为进一步并入用于控制工程化双稳态拨动开关的平衡和偏置的核酶。进行了概念实验的验证以显示，在eyfp编码序列的5’或3’二者其一处的核酶的存在能够类似于图1中所述的persist开关来抑制或激活eyfp表达。如图5a所示，persist激活和抑制eyfp通过肝炎戴尔他病毒核酶(hdv)、反基因组hdv核酶和锤头状核酶(hhr)的基因组感测方向(genomic sense direction)被成功地诱导。
[0174]
在没有小分子的情况下，能够自切割的核酶可被设计至工程化双稳态拨动开关中。第一核酶(1)被放置在case靶位点(2)的第一拷贝、csy4编码序列和csy4靶位点(3)(的上游)的5’；并且第二核酶(4)被放置在csy4靶位点(3)的第二拷贝、case编码序列和case靶位点(2)的5’。第一核酶(1)和第二核酶(2)是不同的核酶。第一核酶(1)的切割抑制csy4的表达，并且第二核酶(4)的切割抑制case的表达(图5b)。相反地，核酶可被放置在csy4或case编码序列(的下游)的3’处，使得核酶的自切割会打开csy4或case的表达。
[0175]
可替代地，核酶可以是小分子响应核酶，使得核酶的自切割可通过添加小分子而诱导。这样的设计在图5c中说明。在该系统中，结合至第一核酶(1*)(其是case靶位点(2)的第一拷贝、csy4编码序列和csy4靶位点(3)的5’)的小分子的添加会导致csy4的抑制，使得工程化双稳态拨动开关可被偏置至case高状态。
[0176]
其他实施方式
[0177]
本说明书中公开的所有特征可以以任何组合进行组合。本说明书中公开的每个特征可以由用于相同、等同或类似目的的替代特征来代替。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是通用系列的等同或类似特征的示例。
[0178]
从以上描述，本领域技术人员可容易地确定本发明的基本特征，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和修饰以使其适应各种用途和情况。因此，其他实施方式也在权利要求的范围内。
[0179]
等同物
[0180]
虽然本文已经描述和说明了若干发明实施方式，本领域普通技术人员会容易地想到用于执行功能和/或获得本文描述的结果和/或一个或多个优点的各种其他手段和/或结构，并且这些变型和/或修饰中的每一个被认为在本文描述的发明实施方式的范围内。更通常地，本领域技术人员会容易地理解，本文所述的所有参数、尺寸、材料和配置意在是示例性的，并且实际的参数、尺寸、材料和/或配置取决于使用本发明教导的具体的一个应用或多个应用。本领域技术人员会认识到或能够使用不多于常规实验来确定本文所述的具体的发明实施方式的许多等同物。因此，应当理解，前述实施方式仅以示例的方式呈现，并且在其所附的权利要求及其等同物的范围内，可以以不同于具体描述的和要求保护的方式来实践发明实施方式。本公开的发明实施方式涉及本文所述的每个单独的特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法。此外，如果此类特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法不相互不一致，则两个或更多个此类特征、系统、制品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合包括在本公开的发明范围内。
[0181]
如本文所定义和使用的，所有定义应被理解相对于字典定义、通过引用并入的文献中的定义和/或所定义的术语的普通含义具有主导地位(control)。
[0182]
本文所公开的所有参考文献、专利和专利申请均通过引用并入所引用的每个主题，在一些情况下，其可以涵盖整个文献。
[0183]
除非明确相反地指出，否则本说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一个/一种(a)”和“一个/一种(an)”应被理解为意指“至少一个/种”。如本文在说明书和权利要求书中所用，短语“和/或”应被理解为意指如此联合的元素的“二者其一或二者”，即，在一些情况下结合地存在以及在其他情况下分离地存在的元素。用“和/或”列出的多个元素应当以相同的方式解释，即，如此联合的元素的“一个或多个”。除通过“和/或”从句具体标识的那些元素外，其他元素可以任选地存在，不管与具体标识的那些元素相关或不相关。因此，作为非限制性示例，当用开放式语言(例如，“包括”)结合使用时，对“a和/或”的提及可以在一实施方式中指代仅a(任选地包括除b之外的元素)；在另一实施方式中，仅指代b(任选地包括除a之外的元素)；在又一实施方式中，指代a和b二者(任选地包括其他元素)等。
[0184]
如本文说明书和权利要求书中所用，“或”应该理解为具有与上文所定义的“和/或”相同的含义。例如，当分隔列表中的条目时，“或”或“和/或”应被解释为具有包容性，即包括至少一个，但也包括许多元素或元素列表中的多于一个，以及任选地其他未列出的条目。只有明确相反地指出的术语，例如“仅一个”或“确切地一个”、或当在权利要求中使用时“由...组成”将指代包含许多元素或元素列表中的精确的一个元素。一般而言，如果带有排他性术语，例如“二者其一”、“一个”、“仅一个”或“确切一个”，本文使用的术语“或”仅应被解释为指示排他性的替代(即“一个或另一个但不是二者”)。当用在权利要求中时，“基本上
由
……
组成”应具有专利法领域所使用的通常含义。
[0185]
如本文在说明书和权利要求书中所用，关于一个或多个元素的列表，短语"至少一个"应被理解为意指选自元素列表中的一个或多个元素的至少一个元素，但不一定包括元素列表内具体列出的每个元素的至少一个，并且不排除元素列表中的元素的任何组合。该定义还允许除了元素列表(短语"至少一个"所指代的)内具体标识的元素之外可任选地存在元素，无论与具体标识的那些元素相关或不相关。因此，作为非限制性示例，“a和b的至少一个”(或等同地，“a或b的至少一个”，或等同地“a和/或b的至少一个”)，在实施方式中，可以指至少一个，任选地包括多于一个a，不存在b(并且任选地包括除b之外的元素)；在另外的实施方式中，可以指至少一个，任选地包括多于一个b，不存在a(并且任选地包括除a之外的元素)；在又一实施方式中，可以指至少一个，任选地包括多于一个a，并且至少一个，任选地包括多于一个b(并且任选地包括其他元素)；等等。
[0186]
还应该理解的是，除非明确相反地指示，在本文要求保护的包括一个以上步骤或动作的任何方法中，该方法的步骤或动作的顺序不一定限于以所叙述的方法的步骤或动作的顺序。