一株烟草肠杆菌菌株65B7及其应用、产品和方法与流程

一株烟草肠杆菌菌株65b7及其应用、产品和方法
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株烟草肠杆菌菌株65b7及其应用、产品和方法。


背景技术：

2.青枯病由罗尔斯通氏菌(ralstonia spp.)侵染引起，是作物重要的土传病害。罗尔斯通氏菌寄主范围广泛，能侵染400多种作物，在香蕉、番茄、马铃薯、烟草上为害较重。烟草青枯病主要由假茄科罗尔斯通氏菌(r.pseudosolanacearum)侵染引起，该病在我国长江流域及其以南各烟区普遍发生。卢灿华、刘俊莹、马俊红等于2019年发表的“云南省烟草青枯病病原多样性初探”([c].中国植物病理学会2019年学术年会论文集,2019:381.)一文已探明，该病在云南省文山、保山、临沧、红河、昆明、玉溪、曲靖、昭通、大理、丽江、楚雄和德宏等12个州市的43个区(县)有发生，其中文山、临沧、红河、普洱烟区发病较重。虽然烟草青枯病为害较重，但因抗病资源匮乏，加之无化学防治的特效药，该病一直是制约烟草产量和品质提升的重要因素。
[0003]
生物防治因其对环境友好而受到广泛关注。已有大量生防资源作为土传病害生物防治手段得到深入研究，例如已报道的青枯病生防菌主要包括假单胞菌(pseudomonas spp.)、芽孢菌(bacillus spp.)、链霉菌(streptomyces spp.)、不动杆菌(acinetobacter spp.)、伯克霍尔德氏菌(burkholderia spp.)和类芽孢菌(paenibacillus spp.)。
[0004]
我国已针对烟草青枯病开发注册9种生防菌，主要为荧光假单胞菌、解淀粉芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等杀菌剂，多数菌剂具有拮抗罗尔斯通氏菌的能力。国内已报道的烟草青枯病生防菌的相关专利主要包括：罗尔斯通氏菌(ralstonia sp.)56d2 (cn113502250a)、副黄假单胞菌(p.parafulva)dw15(cn114934001a)、韩国假单胞菌 (p.koreensis)clp-23(cn111705016a)、解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)tba03 (cn111117936a)、多粘类芽孢杆菌nx1-4-4(cn107365729a)、枯草芽孢杆菌(b.subtilis) 生防菌株trb3(cn102747013a)；复合菌剂主要有3株假单胞菌(p.lurida)fgd5-2、(p. koreensis)hch2-3和(p.rhodesiae)mtd4-1组合(cn112920965a)，细黄链霉菌 (streptomyces microflavus)cgmcc 12841、微白黄链霉菌(s.albidoflavus)cgmcc 12842、链霉菌(s.pratensis)cgmcc 12843和1株铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)组合 (cn106754563a)，浅多色链霉菌、累西菲链霉菌、沙福芽孢杆菌、中孢短芽孢杆菌、褐红木霉菌组合(cn106465734a)，里氏木霉(trichoderma ressei)accc 30150和黄赭色链霉菌(s.silaceus)accc 40021组合(cn103315005a)等。而肠杆菌在作物病害方面的应用较少。
[0005]
近年来，已报道多株肠杆菌属(enterobacter spp.)细菌在作物病虫害防治中的应用。例如，e.cancerogenus haec1防治鳞翅目害虫棉铃虫(cn113832076a)，肠杆菌ippbiote33 防治暗黑鳃金龟(cn111996152a)，阴沟肠杆菌(e.cloacae)sneb572防治大豆孢囊线虫 (cn105112341a)、zts-10防治辣椒疫霉(cn111808783a)，肠杆菌cyw72防治黄瓜霜霉病(cn102321561a)，路德维希肠杆菌(e.ludwiggi)bg10-1防治黄曲霉
(cn105586300a)， e.asburiae 1bqn14防治黄瓜曲叶病毒病(cn103013878a)，e.cowanii b-6-1防治果蔬采后病害(cn103952327a)。肠杆菌与其他生防菌复配，主要有肠杆菌与泛菌、假芽孢杆菌、类芽孢杆菌、芽袍八叠球菌、芽孢杆菌和绿脓杆菌复配组成复合菌剂防治花生根腐病 (cn111763643a)，肠杆菌与无色杆菌、苍白杆菌、寡养单胞菌、枯草芽孢杆菌组配防治烟草赤星病(cn110402964a)，巨大芽孢杆菌bs13和肠杆菌bjn15组合防治黄瓜霜霉病 (cn102428964a)。
[0006]
但目前无肠杆菌属细菌在作物青枯病防治中的应用，更未见可防治或抑制烟草青枯病的烟草肠杆菌的报道。


技术实现要素：

[0007]
基于本领域现有技术存在的上述空白，本发明提供了一种能够防治烟草青枯病的烟草肠杆菌(enterobacter tabaci)65b7及其应用、产品和方法。
[0008]
本发明的技术方案如下：
[0009]
一株烟草肠杆菌(enterobacter tabaci)菌株65b7，其特征在于，其保藏编号为cctccno：m 2019920。
[0010]
保藏编号为cctcc no：m 2019920的烟草肠杆菌(enterobacter tabaci)菌株65b7在防治青枯病方面的应用。
[0011]
所述青枯病指烟草青枯病，由假茄科罗尔斯通氏菌(ralstonia solanacearum)或假茄科罗尔斯通氏菌(ralstonia pseudosolanacearum)或蒲桃罗尔斯通氏菌(ralstonia syzygii)侵染引发的疾病。
[0012]
烟草肠杆菌(enterobacter tabaci)菌株65b7不通过拮抗或抑制茄科罗尔斯通氏菌 (ralstonia solanacearum)或假茄科罗尔斯通氏菌(ralstonia pseudosolanacearum)或蒲桃罗尔斯通氏菌(ralstonia syzygii)来防治青枯病。
[0013]
一种菌剂，其特征在于，包括：保藏编号为cctcc no：m 2019920的烟草肠杆菌 (enterobacter tabaci)菌株65b7。
[0014]
所述的菌剂还包括：辅料。
[0015]
所述的菌剂的剂型选自：发酵液、粉剂、悬乳剂。
[0016]
一种防治青枯病的方法，其特征在于，保藏编号为cctcc no：m 2019920的烟草肠杆菌(enterobacter tabaci)菌株65b7防治青枯病。
[0017]
采用菌浓度为10
7-109cfu/ml的烟草肠杆菌(enterobacter tabaci)菌株65b7的发酵稀释液或菌浓度为10
7-10
10
cfu/g的菌粉悬浮液对发病植株进行灌根处理。
[0018]
所述发病植株指：由茄科罗尔斯通氏菌(ralstonia solanacearum)或假茄科罗尔斯通氏菌(ralstonia pseudosolanacearum)或蒲桃罗尔斯通氏菌(ralstonia syzygii)侵染引发青枯病的烟草植株。
[0019]
本发明提供一株烟草肠杆菌(enterobacter tabaci)，命名为65b7。经鉴定为烟草肠杆菌 (enterobacter tabaci)的一个株系，是从植烟土壤中分离得到，已于2019年11月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为cctcc no：m 2019920。
[0020]
本发明的有益效果如下：
[0021]
1、防病机理不同：常规青枯病生防菌筛选是通过室内平板拮抗初筛选、温室生测
复筛选，而本发明中的烟草肠杆菌(enterobacter tabaci)65b7的防效评价时不以拮抗效果为评价指标，直接以控病能力为指标，经平板拮抗能力测定发现菌株65b7对罗尔斯通氏菌的无抑菌能力，说明菌株65b7的控病机理与传统的拮抗菌不同，可能通过生态位竞争、诱导植株抗病、调节根际微生物群落等机制防病；
[0022]
2、不产生抗药性：菌株65b7对罗尔斯通氏菌生长无抑制能力，说明菌株65b7发挥控病作用不以产生抗生素为主。因此在田间施用菌株65b7防治烟草青枯病时不会产生罗尔斯通氏菌对菌株65b7或菌株代谢产物的耐受性，施用菌株65b7具有较好的安全性；
[0023]
3、丰富生防资源：烟草青枯病生防菌以芽孢菌、假单胞菌、链霉菌为主，无肠杆菌(enterobacter spp.)在作物青枯病生物防治中的报道，本发明涉及的烟草肠杆菌 (enterobacter tabaci)65b7为作物青枯病的防治提供新的生防资源。
[0024]
本发明的烟草肠杆菌(enterobacter tabaci)65b7的保藏信息如下：
[0025]
保藏编号：cctcc no:m 2019920；
[0026]
分类命名：enterobacter tabaci 65b7；
[0027]
保藏日期：2019年11月27日；
[0028]
保藏单位：中国典型培养物保藏中心；
[0029]
保藏地址：中国、武汉、武汉大学。
附图说明
[0030]
图1为本发明实验例1对烟草肠杆菌65b7培养48h的菌落形态图。
[0031]
图2为本发明实验例3对烟草肠杆菌65b7基于全基因组构建的系统发育树图。
[0032]
图3为本发明实验例5的粉剂65b7防治烟草青枯病的效果。
[0033]
图4为本发明实验例6的烟草肠杆菌65b7与罗尔斯通氏菌qbrs-1对峙培养菌落形态对比图。
具体实施方式
[0034]
下面结合具体实施例、实验例和附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不局限于以下技术方案。
[0035]
生物材料的来源
[0036]
一、实验例2、实验例4和实验例5使用的烟草材料为公知公用的烟草品种红花大金元，由申请人实验室保存，也可商购获得。
[0037]
二、实验例4使用的7株罗尔斯通氏菌：
[0038]
假茄科罗尔斯通氏菌(ralstonia pseudosolanacearum)rs已完成基因组测序，序列提交至genbank数据库，bioproject number为prjna594457，genbank assembly accession号为gca_018243235.1，该菌已于2022年7月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为gdmcc 1.3533。
[0039]
蒲桃罗尔斯通氏菌(ralstonia syzygii)llrs-1为“can-hua lu,jun-ying li,meng-ge mi, et al.complete genome sequence of ralstonia syzygii subsp.indonesiensis strain llrs-1, isolated from wilted tobacco in china.phytopathology,2021,111:12:2392-2395)”一文中记载的llrs-1菌株。
65b7、65b7菌株、烟草肠杆菌均指：本发明的保藏编号为cctcc no：m 2019920的烟草肠杆菌(enterobacter tabaci)菌株65b7。
[0061]
第2组实施例、本发明的菌株65b7的应用
[0062]
本组实施例提供保藏编号为cctcc no：m 2019920的烟草肠杆菌(enterobacter tabaci) 菌株65b7在防治青枯病方面的应用。
[0063]
在一些实施例中，所述青枯病指烟草青枯病，由假茄科罗尔斯通氏菌(ralstoniasolanacearum)或假茄科罗尔斯通氏菌(ralstonia pseudosolanacearum)或蒲桃罗尔斯通氏菌(ralstonia syzygii)侵染引发的疾病。
[0064]
在另一些实施例中，烟草肠杆菌(enterobacter tabaci)菌株65b7不通过拮抗或抑制茄科罗尔斯通氏菌(ralstonia solanacearum)或假茄科罗尔斯通氏菌(ralstoniapseudosolanacearum)或蒲桃罗尔斯通氏菌(ralstonia syzygii)来防治青枯病。
[0065]
第3组实施例、本发明的菌剂
[0066]
本组实施例提供一种菌剂。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述菌剂包括：保藏编号为cctcc no：m 2019920的烟草肠杆菌(enterobacter tabaci)菌株65b7。
[0067]
在进一步的实施例中，所述菌剂还包括：辅料。
[0068]
在更具体的实施例中，所述药用辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、ph值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。
[0069]
在具体的实施例中，剂型为粉剂。
[0070]
本发明的菌剂剂型不限于粉剂，本领域技术人员根据本发明的教导和启发，出于实际生产需要，结合微生物工艺领域常用技术手段(例如，《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》等)，选择合适的辅料加以调配，将本发明保藏编号为cctcc no：m 2019920的烟草肠杆菌(enterobacter tabaci)菌株65b7制成各种符合各类符合工艺生产要求的其他剂型产品，例如，片剂、液体剂、喷雾剂、颗粒剂等。
[0071]
第4组实施例、本发明防治青枯病的方法
[0072]
本组实施例提供一种防治青枯病的方法。本组所有的实施例都具备如下共同特征：保藏编号为cctcc no：m 2019920的烟草肠杆菌(enterobacter tabaci)菌株65b7防治青枯病。
[0073]
在优选的实施例中，采用菌浓度为10
7-109cfu/ml的烟草肠杆菌(enterobacter tabaci) 菌株65b7的发酵稀释液或菌浓度为10
7-10
10
cfu/g的菌粉悬浮液对发病植株进行灌根处理。
[0074]
在具体的实施例中，所述发病植株指：由茄科罗尔斯通氏菌(ralstonia solanacearum) 或假茄科罗尔斯通氏菌(ralstonia pseudosolanacearum)或蒲桃罗尔斯通氏菌(ralstoniasyzygii)侵染引发青枯病的烟草植株。
[0075]
实验例1、菌株获取
[0076]
一、诱集、分离与培养
[0077]
将土壤样品去除杂质和较大的块状物后，装入直径120mm的玻璃培养皿中，土层厚
度约为1.5cm，用蒸馏水采用滴定瓶将土壤润湿；
[0078]
制备微生物诱集装置：首先在直径50mm、孔径为0.45μm的微孔滤膜边缘涂布胶水，将不锈钢平底垫圈置于微孔滤膜上；然后向垫圈内腔加入3ml固体培养基(1.2％结冷胶和 1.0％维生素)；再用胶水涂布金属垫圈上表面，盖上另一孔径为0.45μm微孔滤膜；
[0079]
将微生物诱集装置置于(1)中湿润的土壤上，轻轻压实装置，确保微孔滤膜与土壤充分接触，再用剩余土壤将装置完全覆盖，并用蒸馏水采用滴定瓶再次润湿土壤；
[0080]
盖好培养皿，用封口膜将培养装置封好，并置于30℃培养箱培养7d，期间观察土壤湿度，若土壤湿度低则用无菌水补足；
[0081]
从培养箱中取出经过诱集的培养装置，将固体培养基捣碎，加入3ml无菌水放置10min 后，梯度稀释至10-4
；
[0082]
取10-4
、10-5
菌液涂布于寡营养培养基cn(含0.1％酪蛋白氨基酸，0.1％营养肉汤，1.5％琼脂)，每个梯度涂布5皿，于超净工作台吹干，并置于30℃培养箱中培养7d；
[0083]
二、实验结果
[0084]
通过上述实验，从cn培养皿上挑取再次划线于cn培养基，获得纯菌65b7；挑取65b7 的单一菌落接种于盛有2.5ml lb液体培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母浸出物、1％氯化钠和0.5％蔗糖)的试管，置于28℃225r/min恒温振荡培养48h，其菌落形态如图1所示。
[0085]
实验例2、生防菌65b7防治烟草青枯病的防效评价：
[0086]
防效评价分为室内生测初筛选、复筛选，具体操作如下：
[0087]
步骤s1，生测初筛
[0088]
烟苗处理：漂浮育苗法培育烟苗至4～5叶期，用苗前1d从育苗池中取出备用烟苗晾干漂盘，次日用无菌刀片在烟苗根部距烟株中心1.5cm的两侧造伤，将烟苗分为试验组和对照组，每组2株烟苗；
[0089]
生防菌预处理：将试验组接种1ml供试细菌，以接接种lb培养液培养基的烟苗设为对照组；
[0090]
烟苗悬根培养：在28℃恒温人工气候室内的培养架上放置一张尺寸比培育烟苗的漂浮盘略大的厚塑料布，并在塑料布的4角和中心共放置5个一次性培养皿作为支撑，将漂浮盘置于其上培养1d，其间分早、中、晚三次用喷水器具浇水，浇水量以漂盘孔内的水不下滴为宜；
[0091]
病原菌接种：生防菌预处理1d后，对试验组和对照组接种0.5ml罗尔斯通氏菌rs 10 倍稀释液，在28℃恒温人工气候室内继续培养15～20d，其间分早、中、晚三次用喷水器具浇水保湿；
[0092]
观察记录：观察试验组和对照组发病情况，当对照组发病率＞80％时，记录实验组烟株发病情况，烟株健康记为1，烟株发病但未枯死赋值为0.5，烟株枯死赋值为0，每株供试细菌处理的烟株的数值为两株烟株赋值的总和，选择供试细菌中赋值最高的菌株为潜力生防菌，用于室内复筛选。
[0093]
步骤s2，生测复筛
[0094]
步骤s2生测复筛，除以下试验不同外，其余操作步骤与步骤s1生测初筛相同。
[0095]
1)供试菌株为步骤s1生测初筛获得的潜力生防菌；
[0096]
2)生测复筛中增加处理烟株数量，处理组和对照组均处理8株烟苗；
[0097]
3)分别于接种罗尔斯通氏菌后10、20d调查各处理组烟株的病害发生情况，如表1所示。
[0098]
表1.生长室内菌株65b7防治烟草青枯病的效果
[0099][0100]
实验结果表明，在初筛选中，经菌株65b7处理的两株烟一株萎蔫、一株健康，故赋值 1.5；在温室复筛选中，接种10、20dpi分别有8、6株烟株健康，而对照处理的烟株已全部死亡。上述结果说明65b7具有较好的防治效果，可用作温室大棚盆栽评价其防效。
[0101]
实验例3、菌株鉴定与保藏
[0102]
一、菌株鉴定
[0103]
常规细菌鉴定参照文献《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著.科学出版社.2001年)。
[0104]
采用biolog gen iii板分析菌株65b7的化合物代谢特征。
[0105]
分子鉴定方法如下：细菌基因组dna的提取试剂盒，方法参见试剂盒说明书。用通用引物f27/r1492进行pcr扩增16s rdna序列，常规条件扩增，扩增产物经胶回收后，连接于载体peazy-t5 zero载体，热激转化大肠杆菌感受态细胞dh5α，挑取菌落以 m13f/m13r为引物进行菌落pcr鉴定。阳性克隆送上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。运用ezbiocloud数据库(https://www.ezbiocloud.net/)，分析与菌株65b7相近的模式种，初步确认菌株的属一级分类地位。
[0106]
进一步地，运用基因组测序技术获取菌株的全基因组。运用type数据库进行比对，计算专利菌株与亲缘关系最近的种的dna分子杂交值(dddh)，最终确定菌株的分子分类地位，如图2和表2所示。
[0107]
综合形态学和分子生物学特征，确定生防菌的分类地位。
[0108]
二、实验结果记录如下：
[0109]
1、培养特性与形态特征：
[0110]
菌株65b7在na培养基于28℃培养，36h即可见圆形菌落形成，菌落初期浅，后期淡黄色。菌株65b7在smm半固体游动性培养基(每升含有0.l g葡萄糖、胰蛋白胨0.l g、乙二胺四乙酸二钠0.038g、10ml ph 7.0磷酸缓冲液)上游动能力较强。菌株65b7在lb液体培养基中于20～40℃条件下均能生长。挑取菌株置于显微镜下镜检，细菌呈杆状，鞭毛较少，极生。细菌革兰氏染色呈阴性。
[0111]
3、化合物代谢特征：
[0112]
gen iii鉴定结果表明，65b7能利用的碳源包括：水苏糖、l-组胺、果胶、龙胆二糖、 l-苹果酸、α-羟基-丁酸、丙酸、乙酰乙酸、l-乳酸、甘油、l-丝氨酸、3-甲酰葡糖、d-海藻糖、蜜二糖、d-葡糖酸、d-麦芽糖、d-水杨苷、α-d-葡糖、l-精氨酸、n-乙酰-d-葡糖胺、 d-葡糖醛酸、糊精、n-乙酰-β-d-甘露糖胺、蔗糖、d-果糖、d-甘露糖、d-丝氨酸、肌苷、明胶、d-天冬氨酸、蜜三糖、粘酸、d-半乳糖、d-阿拉伯醇、α-酮-丁酸、α-d-乳糖、d
‑ꢀ
甘露醇、l-谷氨酸、l-半
乳糖醛酸内酯、d-果糖、奎宁酸、β-羟基-d,l丁酸、l-果糖、糖质酸、d-山梨醇、吐温40、d-苹果酸、n-乙酰神经氨酸、甲酸、氨基乙酰-l-脯氨酸、l-天冬氨酸、柠檬酸、d-葡糖-6-磷酸、葡糖醛酰胺、溴-丁二酸、p-羟基-苯乙酸、丙酮酸甲酯、 d-乳酸甲酯、α-酮-戊二酸、γ-氨基-丁酸；不能利用的碳源有：l-焦谷氨酸、肌醇、n-乙酰-d-半乳糖胺、d-半乳糖醛酸、d-纤维二糖、l-鼠李糖、β-甲酰-d-葡糖苷、乙酸、d-松二糖、d-果糖-6-磷酸、l-丙氨酸；不能在含有硫酸四癸钠、丁酸钠、8％ nacl、利福霉素 sv、二甲胺四环素、梭链孢酸、溴酸钠的条件下生长，而在含有1％ nacl、4％ nacl、四唑蓝、醋竹桃霉素、四唑紫、ph 5、ph 6、1％乳酸钠、d-丝氨酸、盐酸胍、氯化锂、万古霉素、萘啶酮酸、亚碲酸钾、氨曲南的条件下生长。
[0113]
3、菌株的分子鉴定：
[0114]
16s rdna序列分析表明菌株65b7与近罗根坎普氏肠杆菌(e.quasiroggenkampii) wchecl-1060
t
相似性最高，为99.79％，与烟草肠杆菌(e.tabaci)lmg 25706
t
、四川肠杆菌(e.sichuanensis)wchecl1597
t
的序列相似性分别为99.38％和99.04％，上述结果表明菌株65b7属于肠杆菌属。经type(strain)genome server(https://tygs.dsmz.de/)数据库分析，结果表明菌株65b7与烟草肠杆菌相似性最高，为80.5％(dddh4)，大于新种的鉴定阈值70.0％；菌株65b7与e.quasimori 090044
t
的ddh(d4)值为66.7％；菌株65b7与其他肠杆菌的dddh值小于60％。基于菌株65b7及其近缘种基因组构建系统发育树，结果表明菌株65b7与烟草肠杆菌(e.tabaci)的标准菌株lmg 25706
t
的亲缘关系最近，两者聚为一支(图2)。上述结果说明菌株65b7为烟草肠杆菌。
[0115]
表2.65b7与肠杆菌属细菌的基因组相似性比较分析
[0116][0117]
(2)烟草肠杆菌(enterobacter tabaci)65b7的保藏
[0118]
通过上述鉴定结果，确认菌株65b7为烟草肠杆菌(enterobacter tabaci)的一个株系，命名为65b7，并将该菌株送保藏，其保藏信息如下：
[0119]
保藏编号：cctcc no:m 2019920；
[0120]
分类命名：enterobacter tabaci 65b7；
[0121]
保藏日期：2019年11月27日；
[0122]
保藏单位：中国典型培养物保藏中心；
[0123]
保藏地址：中国、武汉、武汉大学。
[0124]
实验例4、菌株在烟草青枯病防治中的应用
[0125]
试验设置：于温控28～30℃温室大棚进行，试验设置罗尔斯通氏菌处理组、对照组(灌根等体积lb培养基 自来水)，每处理3次重复，每重复10株烟株；
[0126]
供试菌株培养：室内筛选获得的生防菌65b7用lb液体培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母浸出物、1％氯化钠和0.5％蔗糖)培养，在225r/min 30℃摇培48h，即获得菌剂65b7；试验选择实验室保存的来自云南省玉溪市(rs、llrs-1)、文山州(qbrs-1)、临沧市 (bsrs-1)、普洱市(pejg01)及福建省(fqy_4)的6株罗尔斯通氏菌为病原菌，病原罗尔斯通氏菌用cg液体培养基(0.1％酸水解酪蛋白、0.5％葡萄糖和2％蛋白胨)培养，在 225r/min 30℃摇培24h；
[0127]
烟苗移栽：采用漂浮育苗方式培育的烟苗，烟苗为二次剪叶的烟苗，约培育50d，移
栽时将红壤与有机质按3:1混匀后移栽烟苗；
[0128]
接种：移栽后将250ml生防菌发酵液稀释25倍，每株烟灌根200ml稀释液(稀释液中的65b7菌浓度为10
7-108cfu/ml)，以等体积lb稀释液处理对照组；次日将cg培养基摇陪24h的罗尔斯通氏菌稀释100倍，每株烟接种100ml罗尔斯通氏菌稀释液(接种浓度约为107cfu/ml)。
[0129]
调查统计：接种后每7d调查一次病情指数，共调查3-6次。烟草青枯病的发病率、病情指数和防治效果按下式计算：发病率＝发病植株/调查植株总数
×
100％；病情指数＝[σ(病情级数
×
此级菌株数)/(最高级数
×
总株数)]
×
100；防治效果＝(对照病情指数－处理病情指数)/ 对照病情指数
×
100％。病情指数按照中华人民共和国烟草行业标准烟草病害分级及调查方法调查(gb/t 23222-2008)，病害分级如下：全株无病为0级，病侧二分之一以下叶片凋萎为 1级，病侧二分之一至三分之二叶片凋萎为3级，病侧三分之二以上叶片凋萎为5级，病株叶片全部凋萎为7级，病株基本枯死为9级。
[0130]
试验结果：结果表明经菌剂65b7处理的烟株在观察期内病情指数均低于对照组，且菌剂65b7对不同地理来源的供试罗尔斯通氏菌均有防治效果，防效在31.75～69.47％，其中对来自普洱(pegj01)和玉溪(llrs-1)的罗尔斯通氏菌引发的青枯病防治效果较好，分别达61.34％和69.47％。菌剂65b7对来自云南省普洱市(pejg01)、玉溪市(rs、llrs-1)、文山州(qbrs-1)、临沧市(bsrs-1)的5株罗尔斯通氏菌引发的青枯病的防效优于对照药剂噻菌铜。菌剂65b7对来自福建的罗尔斯通氏菌fqy_4的防效与对照药剂噻菌铜相近。对照药剂噻菌铜仅对来自文山(llrs-1)和临沧(bsrs-1)和福建(fqy_4)的罗尔斯通氏菌引发的青枯病具有一定防效。上述结果说明菌剂65b7对不同地理来源的罗尔斯通氏菌引发的青枯病均具有较好的防治效果，具有一定开发价值(表3)。
[0131]
表3.菌剂65b7对不同罗尔斯通氏菌的防治效果
[0132][0133]
实验例5、生防菌剂65b7对烟草青枯病的温室防效评价
[0134]
实验例5除以下试验及结果不同外，其余操作步骤与实验例4相同。
[0135]
1、种子液培养：分别挑取一环生防菌接种于含有500ml种子培养液(蛋白胨10.0g/l、牛肉浸膏3.0g/l、氯化钠5.0g/l、琼脂15.0g/l，ph 7.0)的500ml离心管内，置于28℃恒温摇床培养15h。
[0136]
2、发酵：将生防菌的种子液按1：100比例转接至含有150l发酵培养基中发酵(葡萄糖20g/l，豆粕粉25g/l，酵母膏4g/l，磷酸氢二钾1.5g/l，ph 7.3)。发酵工艺参数如下： (1)灭菌：空消条件为：0.15mpa，123℃，1h；实消条件为：0.15mpa，123℃，35min； (2)接种：灭菌完成培养液温度下降至37℃时开始接种，接种比例为菌种/培养液1:100； (3)发酵：转速:保持120r/min至发酵结束；通气量：保持15m3/h时保持至发酵结束；整个过程保持罐压在0.05mpa；因设备原因允许通气量在短时间内浮动。温度：整个发酵过程保持温度在37℃，上
下可浮动0.5℃。发酵时间：运行发酵42h。
[0137]
3、制粉：将发酵液(约67.5亿cfu/ml)进行离心，收集离心菌体作为原料按1:1的质量比与硅藻土混合并添加占混合物料总质量5
‰
的蔗糖作为营养物质，将混合物料置于阴凉干燥通风处晾干，当水分含量达10％左右，进行粉碎后制得65b7粉剂(87亿cfu/g)。
[0138]
4、防治：每棵烟苗施用2.5g菌剂，兑水50ml，得到的菌浓度为4亿cfu/ml的菌粉悬浮液进行灌根，每重复15株，设置3次重复，设置清水为对照；次日接种罗尔斯通氏菌 qbrs-1，每株0.1od；每周调查一次病害等级，计算病情指数。
[0139]
试验结果：如图3，随着接种天数的增加，对照组病情逐渐加重，而菌剂65b7处理的烟株发病较轻，在接种后24d时病情指数曲线下面积为91.11
±
50.48，而对照组则为 473.00
±
48.72。以病情指数曲线下面积计算，菌剂65b7处理组的防效为80.74％，具有较好防效。
[0140]
实验例6、菌株65b7拮抗罗尔斯通氏菌的效果
[0141]
采用平板对峙培养法，测量菌株的抑菌带。操作步骤如下：分别将cg培养基(0.1％酸水解酪蛋白、0.5％葡萄糖和2％蛋白胨)培养24h的罗尔斯通氏菌qbrs-1、rs、llrs-1 和bsrs-1梯度稀释至10-4
；取100μl稀释液置于cga(0.1％酸水解酪蛋白、0.5％葡萄糖和2％蛋白胨、1.5％琼脂)培养基表面，用涂布株涂布均匀，置于超净工作吹干；挑取单菌落接种于含有罗尔斯通氏菌的培养基表面，培养2～3d后观测各菌株的抑菌情况，有抑菌效果的菌株用四点法对峙培养并测量菌株的抑菌圈和抑菌带(图4)。
[0142]
试验结果：结果表明菌株65b7对罗尔斯通氏菌rs、llrs-1、bsrs-1和qbrs-1均无拮抗作用。上述结果说明生防菌65b7不以抑菌作用控制青枯病，可能通过非拮抗的生态位竞争、诱导抗性、调节根际微生态结构而发挥作用。
[0143]
表4.生防菌65b7对不同罗尔斯通氏菌的拮抗能力
[0144]
罗尔斯通氏菌抑菌圈/cm抑菌带/cmrs0.00
±
0.000.00
±
0.00llrs-10.00
±
0.000.00
±
0.00bsrs-10.00
±
0.000.00
±
0.00qbrs-10.00
±
0.000.00
±
0.00