一种长双歧杆菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种长双歧杆菌及其应用。


背景技术：

2.光老化是皮肤外在老化最主要的形式，而导致皮肤光老化的主要原因就是紫外线辐射。皮肤在老化的过程中，细胞增殖降低，细胞凋亡增加，细胞外基质成分(胶原蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖等)随着皮肤衰老而显着减少。此外，多种因素如线粒体损伤、炎症反应等产生的活性氧增加，使得氧化应激增加，老化受损细胞无法及时清除，从而导致了皮肤衰老。
3.在衰老机制的研究中发现，细胞自噬能够延缓器官功能退化，清除细胞内受损的蛋白质和脂质，修复dna，帮助细胞恢复代谢稳态，为光老化受损的皮肤提供保护作用。另外，减少细胞凋亡，降低细胞炎症，增加细胞外基质的合成以及减少其降解，提升细胞的抗氧化能力等都已被证实能够减缓皮肤细胞衰老，寻求多层次多维度的抗衰老物质是目前的研究热点。
4.近年来研究发现，皮肤能分泌一些具有抗菌作用的蛋白和多肽，这些抗菌作用的多肽称为抗菌肽(antimicrobial peptides，amps)，它是一类天然免疫系统的效应分子，能够接触微生物膜，溶解细胞，具有广谱抗微生物作用。此外，它们还参与干扰细胞增殖、免疫应答、伤口愈合、细胞因子释放、白细胞趋化、蛋白酶抗蛋白酶平衡等反应过程。
5.皮肤微生物在皮肤免疫的成熟和稳态中发挥着重要作用，大多数生活在皮肤上的微生物在稳态条件下表现为共生或互利共生，最新的研究证明皮肤微生物群调节各种先天因子的表达。皮肤微生物分解磷脂、固醇类、角质蛋白也可使皮肤细胞吸收并促进细胞生长、延缓衰老和减少皱纹产生。当皮肤因为外部原因的侵害，例如空气污染、化妆品过度使用或使用了含激素的化妆品后，就可能导致皮肤表面菌群失调，从而造成各种肌肤问题。研究表明，皮肤微生态的变化与银屑病、特应性皮炎、痤疮和慢性伤口等多种炎症性和感染性疾病的发生和发展相关。当益生菌减少甚至消失时，皮肤会出现抵抗力降低、易发炎、感染、过敏、长痘、水油失衡等多种问题。因此，提供一种利用皮肤微生物技术开发的益生菌相关产品，具有重要的现实意义。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了一种长双歧杆菌及其应用。
7.本发明提供了长双歧杆菌(bifidobacterium longum)，该菌株为长双歧杆菌profmic-231，已于2022年9月13日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址为:武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，邮编430072)，其保藏编号为cctcc no:m 20221386的长双歧杆菌)；
8.本发明的另一目的在于提供了上述长双歧杆菌在制备改善肌肤状况的产品中的应用。
9.在一些实施方式中，所述改善皮肤状况为抗衰老、提高细胞抗菌能力、改善脱发中的至少一种。
10.在一些实施方式中，所述抗衰老为上调细胞外基质相关基因的表达；所述细胞外基质相关基因为col1a1、col13a1、sptssa、timp1和/或smad3中的至少一种；
11.所述抗衰老为上调抑制细胞凋亡相关基因bcl-2的表达；
12.所述抗衰老为上调细胞自噬相关基因lc3b的表达；
13.所述抗衰老为上调免疫调节因子相关基因mor的表达；
14.所述抗衰老为上调抗氧化相关基因pten的表达。
15.在一些实施方式中，所述抗衰老为下调降解细胞外基质相关基因的表达；所述降解细胞外基质相关基因为mmp家族中的至少一种；
16.所述抗衰老为下调细胞凋亡相关基因的表达；所述细胞凋亡相关基因为bax和/或caspase家族中的至少一种的表达；
17.所述抗衰老为下调细胞炎症因子相关基因il-6和/或tnf-α的表达。
18.在一些实施方式中，所述提升皮肤抗菌能力为上调抗菌肽相关基因s100a7、s100a8和/或defb4的表达。
19.在一些实施方式中，所述改善脱发包括如下a)～f)所示至少一种：
20.a)、上调毛囊生长期相关基因β-catenin和/或lef1的表达；
21.b)、上调毛囊细胞生长因子相关基因vegf、igf-1、fgf-2的表达；
22.c)、上调毛囊细胞周期调控因子相关基因c-myc、pp2a和/或cyclin d1的表达；
23.d)、上调抑制毛囊细胞凋亡相关基因hsp27的表达；
24.e)、上调毛囊细胞外基质相关基因cspg4和/或hspg2的表达；
25.f)、下调毛囊休止期相关基因bmp4的表达。
26.在一些实施方式中，所述产品为食品、药品或化妆品。
27.本发明的另一目的在于提供了一种改善皮肤状况的产品，由包括上述的长双歧杆菌的原料制成。
28.在一些实施方式中，所述产品中的长双歧杆菌包括如下(1)或(2)所示的一种或两种：
29.(1)权利要求1所述的长双歧杆菌的菌群和/或菌剂；
30.(2)权利要求1所述的长双歧杆菌的培养物、外泌体、溶胞物和/或提取物。
31.本发明公开的长双歧杆菌profmic-231，其保藏编号为cctcc no:m20221386。实验表明，profmic-231具有抗衰老、提高细胞抗菌能力、改善脱发的功能，可用于制备食品、药品、化妆品等。
32.生物保藏说明
33.长双歧杆菌(bifidobacterium longum)profmic-231，于2022年9月13日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址为:武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，邮编430072)，其保藏编号为cctcc no:m 20221386。
具体实施方式
34.本发明提供了长双歧杆菌及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改
进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
35.本发明的长双歧杆菌菌株profmic-231，来源于八岁健康女童粪便，经16srdna鉴定为长双歧杆菌(bifidobacterium longum)。该菌株革兰氏阳性，显微镜下呈杆状；在bbl平板上生长，可形成表面光滑不透明的圆形菌落，白色，边缘整齐；在bbl液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀，最适生长温度37℃。
36.长双歧杆菌(bifidobacterium longum)profmic-231，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏日期：2022年9月13日，保藏编号为cctcc no:m 20221386。
37.进一步，本发明提供的长双歧杆菌profmic-231在本发明所述的应用或产品中,存在形式是活的或死的或经间歇灭菌的，或为发酵溶胞物和/或提取物的形式，或为细菌产物的形式或为发酵滤液形式或衍生物形式，所述衍生物形式优选地选自：代谢产物、代谢生物产物、外泌体、益生素、细胞壁及其成分、胞外多糖，和含有免疫原性成分的化合物，优选地选自：发酵滤液、发酵溶胞物。
38.体外细胞实验表明，本发明的长双歧杆菌profmic-231具有上调hacat细胞外基质相关的i型胶原蛋白α链基因col1a1，丝氨酸棕榈酰转移酶基因sptssa，组织金属蛋白酶抑制物i基因timp1，信号转导蛋白基因smad3，以及细胞自噬相关基因微管相关蛋白1轻链3β基因lc3b表达的作用，基因相对表达倍数1.12～2.04；具有下调降解细胞外基质相关的基质金属蛋白酶基因mmp1，细胞炎症因子相关的肿瘤坏死因子α基因tnf-α表达的作用，基因相对表达倍数0.44～0.75。
39.体外细胞实验表明，本发明的长双歧杆菌profmic-231具有上调hff细胞外基质相关的类胶原膜蛋白13α链基因col13a1，丝氨酸棕榈酰转移酶基因sptssa，免疫调节因子相关的β-内啡肽受体基因mor，抗氧化相关的10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物pten，以及抑制细胞凋亡相关的b淋巴细胞瘤-2基因bcl-2表达的作用，基因相对表达倍数1.10～3.51倍；具有下调降解细胞外基质相关的基质金属蛋白酶家族基因mmp，细胞凋亡相关的bcl2-associated x蛋白基因bax，半胱氨酸蛋白酶家族基因caspase，以及细胞炎症因子相关的白介素6基因il-6表达的作用，基因相对表达倍数0.33～0.83
40.体外细胞实验表明，本发明的长双歧杆菌profmic-231具有上调抗菌肽相关基因s100a7、s100a8和defb4表达的作用，基因相对表达倍数1.20～1.91。
41.体外细胞实验表明，本发明的长双歧杆菌profmic-231具有上调毛囊生长期相关的β-链蛋白基因β-catenin,淋巴细胞结合增强因子1lef1，毛囊细胞生长因子相关的血管内皮细胞生长因子vegf，胰岛素样生长因子1igf-1，成纤维细胞生长因子2fgf-2，毛囊细胞外基质相关的硫酸软骨素蛋白聚糖基因cspg,硫酸肝素蛋白聚糖基因hspg,毛囊细胞周期调控因子相关的myc家族蛋白基因c-myc，细胞周期蛋白d1 cyclin d1，蛋白磷酸酶2a pp2a抑制毛囊细胞凋亡相关的热休克蛋白27基因hsp27表达的作用，基因相对表达倍数1.10～2.04。下调毛囊发育休止期相关的骨形态发生蛋白4bmp4，基因相对表达倍数0.47～0.73。
42.本发明采用的试材皆为普通市售品，均可市售购买得到，下面结合实施例，进一步
阐述本发明：
43.实施例1
44.profmic-231的分离：
45.于八岁健康女童中采样。将样品适当处理后于生理盐水中震荡混匀，取上清划线于bbl固体平板，37℃恒温厌氧培养48h后，挑取白色菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为profmic-231。
46.革兰氏染色镜检：菌株profmic-231为革兰氏染色阳性，显微镜下呈杆状；在bbl平板上生长，可形成白色、表面光滑圆润不透明圆形小菌落，边缘整齐；在bbl液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。
47.实施例2
48.profmic-231的核酸鉴定：
49.1、16s rdna基因序列分析：
50.挑取单菌落置mrs液体培养基中，37℃厌氧培养过夜后，12000转离心1min收集菌体，按照dna提取试剂盒步骤进行操作。引物采用细菌通用引物27f，1492r，pcr扩增体系为50μl体系，95℃预变性5min；94℃15s，57℃15s，72℃40s，35个循环；72℃延伸10min。
51.2、结果
52.pcr产物测序结果与genbank中已发表的标准序列进行同源性比较(blastn)后得出profmic-231菌株为长双歧杆菌(bifidobacterium longum)。
53.实施例3
54.profmic-231调节光老化hacat细胞外基质/细胞自噬/降解细胞外基质/炎症因子相关基因表达实验：
55.1、profmic-231发酵滤液及发酵溶胞物制备：
56.挑取长双歧杆菌profmic-231单菌落于bbl液体培养基，37℃培养箱厌氧静置培养16～18h，酶标仪检测并以pbs稀释调整od
600
＝0.2，121℃，30min高压灭活，12000转离心2min，经0.22μm滤膜过滤为发酵滤液。离心后分离沉淀的菌体以pbs清洗两次后加入液氮研磨破碎，收集破碎菌泥以pbs重悬至离心时体积，再以超声波破碎20分钟，121℃，30min高压灭活，即得发酵溶胞物。
57.2、hacat细胞制备及紫外线损伤
58.将hacat细胞消化后以0.5ml/孔(内含2
×
105细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。对孔内细胞进行总剂量为2j/cm2的紫外线uvb照射损伤。
59.3、profmic-231添加
60.将发酵滤液5％(v/v)、发酵溶胞物10％(v/v)分别加入刺激过的hacat细胞(对照组分别以等体积pbs替代发酵滤液/发酵溶胞物)。每组3平行，37℃培养过夜。
61.4、qpcr法检测细胞外基质/细胞自噬/降解细胞外基质/炎症因子相关基因相对表达倍数
62.将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总rna，检测rna浓度及纯度后反转录为cdna，以gapdh为内参基因，采用实时qpcr检测细胞外基质相关基因col1a1、sptssa、timp1、smad3，细胞自噬相关基因lc3b，降解细胞外基质相关基因mmp1以及炎症因子相关基因tnf-α的表达。以对照组基因相对表达倍数f＝1，利用2-δδct
法计算各样品f值。
63.公式：f＝2-δδct
，其中：
64.△
ct
实验
＝ct
实验-ct
内参(实验)
；
65.△
ct
对照
＝ct
对照-ct
内参(对照)
；
66.△△
ct＝
△
ct
实验
‑△
ct
对照
。
67.发酵滤液上调细胞外基质相关基因timp1；下调降解细胞外基质相关基因mmp1。结果见下表：
[0068][0069]
发酵溶胞物上调细胞外基质基因col1a1、sptssa、timp1和smad3，细胞自噬相关基因lc3b；下调炎症因子相关基因tnf-α。结果见下表：
[0070][0071]
结果显示加入profmic-231具有促进hacat细胞外基质合成、促进细胞自噬，减少细胞外基质的降解，减少炎症因子的抗衰老作用。
[0072]
实施例4
[0073]
profmic-231调节氧化损伤hff细胞外基质/免疫调节因子/抗氧化/抑制细胞凋亡/降解细胞外基质/细胞凋亡/炎症因子相关基因表达实验：
[0074]
1、profmic-231发酵滤液及发酵溶胞物制备：
[0075]
制备方法参照实施例3。
[0076]
2、hff细胞制备及h2o2诱导氧化损伤
[0077]
将dmem培养的hff细胞消化后以0.5ml/孔(内含2
×
105细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。每孔加入终浓度为200μm的h2o2进行刺激，37℃静置1h。
[0078]
profmic-231添加
[0079]
将发酵滤液5％(v/v)、发酵溶胞物10％(v/v)分别加入刺激过的hff细胞(对照组
分别以等体积pbs替代发酵滤液/发酵溶胞物)。每组3平行，37℃培养过夜。
[0080]
4、qpcr法检测细胞外基质/免疫调节因子/抗氧化/抑制细胞凋亡/降解细胞外基质/细胞凋亡/炎症因子相关基因相对表达倍数
[0081]
将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总rna，检测rna浓度及纯度后反转录为cdna，以gapdh为内参基因，采用实时qpcr检测细胞外基质相关基因col13a1和sptssa，免疫调节因子相关基因mor，抗氧化相关基因pten和抑制细胞凋亡相关基因bcl-2；以及降解细胞外基质相关基因mmp家族，细胞凋亡相关基因bax和caspase家族基因和炎症因子相关基因il-6的表达。以对照组基因相对表达倍数f＝1，利用2-δδct
法计算各样品f值。
[0082]
发酵滤液上调细胞外基质相关基因col13a1，免疫调节因子相关基因mor，抑制细胞凋亡相关基因bcl-2；下调降解细胞外基质相关基因mmp家族，细胞凋亡相关基因bax和caspase家族和炎症因子相关基因il-6。结果见下表：
[0083][0084][0085]
发酵溶胞物上调细胞外基质相关基因sptssa，抗氧化相关基因pten，抑制凋亡基因相关基因bcl-2；下调细胞凋亡相关基因bax和caspase-3。结果见下表：
[0086][0087]
结果显示加入profmic-231具有促进hff细胞外基质合成、增加细胞免疫调节因子、增加抗氧化、减少细胞凋亡、减少细胞外基质降解、减少炎症因子的抗衰老作用。
[0088]
实施例5
[0089]
profmic-231上调hacat抗菌肽相关基因表达实验：
[0090]
1、profmic-231发酵溶胞物的制备：
[0091]
制备方法参照实施例3。
[0092]
2、hacat细胞制备
[0093]
将hacat细胞消化后以0.5ml/孔(内含2
×
105细胞)接种至24孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。
[0094]
3、profmic-231添加及lps刺激
[0095]
将发酵溶胞物10％(v/v)加入培养过夜的hacat细胞中(对照组以等体积pbs替代)，2h后添加0.5ml浓度为0.2μg/ml的lps溶液，诱导细胞发炎，5％二氧化碳培养箱37℃培养20h。
[0096]
4、qpcr法检测抗菌肽相关基因相对表达倍数
[0097]
将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总rna，检测rna浓度及纯度后反转录为cdna，以gapdh为内参基因，采用实时qpcr检测s100a7、s100a8和defb4基因的表达。以等体积pbs处理组为对照(基因相对表达倍数f＝1)，利用2-δδct
法计算各样品f值。
[0098]
灭活菌体上调抗菌肽基因s100a7、s100a8和defb4，结果见下表：
[0099][0100]
结果显示profmic-231具有促进抗菌肽基因表达的作用。
[0101]
实施例6
[0102]
profmic-231调节氧化损伤hdpcs毛囊生长期/毛囊细胞生长因子/毛囊细胞外基质/毛囊细胞周期调控因子/毛囊休止期相关基因表达实验：
[0103]
1、profmic-231发酵滤液及发酵溶胞物制备：
[0104]
制备方法参照实施例3。
[0105]
2、hdpcs毛囊细胞制备及h2o2诱导氧化损伤
[0106]
将成纤维细胞培养基培养的hdpcs毛囊细胞消化后以2ml/孔(内含3
×
105细胞)接种至6孔板，5％二氧化碳培养箱37℃培养过夜。每孔加入终浓度为200μm的h2o2进行刺激，37℃静置1h。
[0107]
profmic-231添加
[0108]
将发酵滤液5％(v/v)、发酵溶胞物10％(v/v)分别加入刺激过的hdpcs细胞(对照组分别以等体积pbs替代发酵滤液/发酵溶胞物)。每组3平行，37℃培养过夜。
[0109]
4、qpcr法检测毛囊生长期/毛囊细胞生长因子/毛囊细胞外基质/毛囊细胞周期调控因子/毛囊休止期相关基因相对表达倍数
[0110]
将上述细胞弃去培养基后，加入裂解液，提取细胞总rna，检测rna浓度及纯度后反转录为cdna，以gapdh为内参基因，采用实时qpcr检测毛囊生长期相关基因β-catenin、lef1，毛囊细胞生长因子相关基因vegf、igf-1、fgf-2，毛囊细胞外基质相关基因cspg4、hspg2，抑制毛囊细胞凋亡相关基因hsp27，毛囊细胞周期调控因子相关基因c-myc、cyclin d1、pp2a；以及毛囊休止期相关基因bmp4的表达。以对照组基因相对表达倍数f＝1，利用2-δδct
法计算各样品f值。
[0111]
发酵滤液上调毛囊生长期相关基因β-catenin、lef1，毛囊细胞生长因子相关基因vegf、igf-1、fgf-2，毛囊细胞外基质相关基因cspg4、hspg2，抑制毛囊细胞凋亡相关基因hsp27，毛囊细胞周期调控因子相关基因c-myc、cyclin d1、pp2a；下调毛囊休止期相关基因bmp4，结果见下表：
[0112][0113][0114]
发酵溶胞物上调毛囊生长期相关基因lef1，毛囊细胞生长因子相关基因vegf、fgf-2，抑制毛囊细胞凋亡相关基因hsp27，毛囊细胞周期调控因子相关基因c-myc；下调毛囊休止期相关基因bmp4，结果见下表：
[0115][0116]
结果显示加入profmic-231具有促进hdpcs毛囊生长期、毛囊细胞生长因子、毛囊
细胞外基质、抑制毛囊细胞凋亡、毛囊细胞周期调控因子相关基因表达的作用；具有下调毛囊休止期相关基因表达改善脱发的作用。
[0117]
实施例7
[0118]
长双歧杆菌profmic-231发酵滤液冲剂制备实例：
[0119]
profmic-231发酵滤液冲剂的制备，组方如下表所示：
[0120]
原料质量比例(％)profmic-231发酵粉50重组胶原蛋白粉30水蜜桃果汁粉18.8维生素c0.8二氧化硅0.4
[0121]
制备工艺：取实施例3制备的profmic-231发酵滤液，喷雾干燥后制成profmic-231发酵粉，加入重组胶原蛋白粉、维生素c、水蜜桃果汁粉、二氧化硅，搅拌分散均匀即完成冲剂。所得profmic-231冲剂以水冲泡后味道酸甜，适口性佳，携带方便，可做为皮肤保养的口服饮品。
[0122]
实施例8
[0123]
长双歧杆菌profmic-231发酵溶胞物乳液制备实例：
[0124]
profmic-231灭活菌体乳液的制备，组方如下表所示
[0125]
原料质量比例(％)profmic-231发酵溶胞物50.00环戊硅氧烷15.00甘油12.00凡士林2.001,3-丁二醇1.50吐温-800.75维生素e醋酸酯0.20汉生胶0.20carbopol ultrez 100.10三乙醇胺适量去离子水至100
[0126]
制备工艺：将环戊硅氧烷、凡士林、吐温-80、维生素e醋酸酯、甘油一起混合加热至75℃，作为a相；再取实施例3制备的profmic-231发酵溶胞物，加入汉生胶、carbopol ultrez 10、1,3-丁二醇、去离子水一起混合分散均匀并加热至75℃，作为b相；将预热的a相缓慢加入到预热的b相中并均质完全，加入三乙醇胺调节至ph6-7，搅拌冷却至35℃即完成。所得profmic-231发酵溶胞物乳液体感润滑舒适。
[0127]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。