闭管恒温变色检测金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法与流程

闭管恒温变色检测金黄色葡萄球菌的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种闭管恒温变色检测金黄色葡萄球菌的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法。


背景技术：

2.金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性，是一种无芽孢，鞭毛，乳酸发酵，兼性厌氧的球状细菌，为一种常见的食源性致病微生物，常寄生于人和动物的皮肤、鼻腔、咽喉、肠胃、疮口中，环境中也无处不在，往往对人体造成侵害。
3.目前常用的金黄色葡萄球菌检测方法包括显色培养基培养法、常规pcr法、荧光定量pcr等，均可以有效地检测。但显色培养法存在耗时长、人为因素大、难以标准化等缺点，检测一个样本往往需要1周，还存在结果不一致性。荧光定量pcr通量大，检测时间短，只需要2-4小时，但需要经过变性、退火、延伸等步骤，要依托精密昂贵的仪器及专业检测人员，成本高，不利于推广。
4.环介导恒温扩增技术是一种不需要精确控温过程的基因诊断技术，借助6条特异性引物和一种具有链置换特性的dna聚合酶，可在等温条件下快速，高特异性和灵敏的扩增靶序列，检测全过程只需要在60-65℃条件下扩增40-60min，具有操作简单、反应时间短、特异性高、灵敏度高等特点，广泛应用于病原菌检测领域。
5.目前对金黄色葡萄球菌进行检测的靶标基因主要集中在nuc耐热核酸酶基因、脱氢酶基因aroe等，但现实研究过程中发现其他菌种也具有nuc等基因，存在假阳性隐患。


技术实现要素：

6.本发明针对现有的检测方法对金黄色葡萄球菌检测容易出现假阳性的问题，提供一种闭管恒温变色检测金黄色葡萄球菌的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法，其针对金黄色葡萄球菌的isdd基因设计引物组，能够特异性的识别金黄色葡萄球菌，且采取闭管恒温变色体系，显色剂直接加入到反应体系中，无需开盖，降低气溶胶污染概率。
7.本发明通过以下技术方案实现：
8.第一方面，本发明提供一种闭管恒温变色检测金黄色葡萄球菌的lamp检测引物组，检测引物组针对金黄色葡萄球菌的isdd基因编码序列设计，检测引物组包括外引物f3、外引物b3、内引物fip、内引物bip和环引物lf；
9.外引物f3的核苷酸序列为：gcctttttactgaaaaaggatt，如seq id no.1所示；
10.外引物b3的核苷酸序列：gtaacgctttttctttttcaact，如seq id no.2所示；
11.内引物fip的核苷酸序列：atgctttaggtcgctcattttcaattattcct-gtacaaaaagataaagtg，如seq id no.3所示；
12.内引物bip的核苷酸序列：atagccctccaacagtaaaaaaggtgattt-ttcatctttatgtttcggt，如seq id no.4所示；
13.环引物lf的核苷酸序列：caacaagacagtaataaaaag，如seq id no.5所示。
14.第二方面，本发明提供一种闭管恒温变色检测金黄色葡萄球菌的lamp检测试剂盒，检测试剂盒含有上述检测引物组。
15.进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述试剂盒还包括以下一种或多种组分：dna聚合酶、dntps、显色剂、甜菜碱、ph调节剂、ddh2o、buffer。
16.进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述外引物f3和外引物b3的浓度均为0.15～0.25μm，内引物fip与内引物bip的浓度均为1.5～1.7μm，环引物lf的浓度为0.4～0.8μm。
17.进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述显色剂为酚红、甲酚或中性红。
18.进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述ph调节剂为tris-hcl或naoh。
19.进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述buffer中含有95～105mm的kcl、95～105mm的(nh4)2so4、100mm的mgso4、1～2％triton-100。
20.第三方面，本发明提供一种闭管恒温变色检测金黄色葡萄球菌的lamp检测方法，其利用上述检测试剂盒进行检测，包括：
21.将来自待测样品中的模板dna与lamp反应体系混合，进行lamp扩增。
22.进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述lamp扩增的温度为60～65℃，时间为50～70min。
23.进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述lamp反应体系为25μl，包括：0.2～0.4μm/l的外引物f3、0.2～0.4μmμm/l的外引物b3、1.2～2.0μm/l的内引物fip、1.2～2.0μm/l的内引物bip、0.4-0.8μm/l的环引物lf、8-12u活性单位的bst dna聚合酶、8-16mm/l的显色剂、0.8-1.2mm/l的ph调节剂以及0.6～0.8m/l的甜菜碱。
24.与现有技术相比，本发明至少具有如下技术效果：
25.分子生物学方面常用来检测金黄色葡萄球菌的目的基因多为nuc耐热核酸酶基因、脱氢酶基因aroe等，但现实研究过程中发现其他菌种也具有nuc等基因，存在假阳性隐患，本技术通过比对筛选出金黄色葡萄球菌特异性靶点基因isdd基因，isdd是金黄色葡萄球菌细胞膜表面的一种蛋白，是金黄色葡萄球菌isd系统中的重要成员，在转运铁离子过程中发挥着重要作用，具有高度菌种特异性，适合作为检测靶标。
26.本发明提供一种闭管恒温变色检测金黄色葡萄球菌的lamp检测引物组，以金黄色葡萄球菌isdd基因为检测靶标，这种isdd基因相比于nuc基因兼具特异性及保守型，所设计引物具有良好的特异性，和其它种属细菌的同源性非常低，无交叉反应。
27.本发明提供一种闭管恒温变色检测金黄色葡萄球菌的lamp检测试剂盒及及检测方法，采用闭管恒温变色体系，与sybr green、hnb、钙黄绿素不同，显色剂直接加入到反应体系中，无需开盖，降低气溶胶污染概率；同时，该闭管恒温变色体系特异性高，只有发生有效扩增时才会发生颜色变化，假阳性率低，检测的灵敏度高，检测限可达102cfu/ml，且结果判定简单，颜色变化明显，肉眼容易分辨，无需依托精密仪器，适合基层推广使用。
28.说明书附图
29.图1为本发明实施例3中lamp扩增结果目视图；
30.图2为本发明实施例3中lamp扩增结果荧光检测图；
31.图3为本发明实施例4中目视法恒温变色灵敏度；
32.图4为本发明实施例4中闭管恒温变色扩增体系灵敏度曲线；
33.图5为本发明实施例5中闭管恒温变色扩增体系特异性检测。
具体实施方式
34.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围，实施例中未注明的具体条件，按照常规条件或者制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
35.以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
36.实施例1lamp引物设计
37.通过查阅文献、对比筛选出金黄色葡萄球菌特有的特异性靶点基因isdd基因，应用专门的lamp引物设计软件以isdd基因为靶标序列进行引物设计，在primer-blast上对设计好的引物进行分析和优化，最终确定的引物序列如下：
38.外引物f3的核苷酸序列为：gcctttttactgaaaaaggatt(seq id no.1)；
39.外引物b3的核苷酸序列：gtaacgctttttctttttcaact(seq id no.2)；
40.内引物fip的核苷酸序列：atgctttaggtcgctcattttcaattattcct-gtacaaaaagataaagtg(seq id no.3)；
41.内引物bip的核苷酸序列：atagccctccaacagtaaaaaaggtgattt-ttcatctttatgtttcggt(seq id no.4)；
42.环引物lf的核苷酸序列：caacaagacagtaataaaaag(seq id no.5)。
43.实施例2建立lamp检测反应体系
44.本实施例中构建的lamp检测反应体系总体积为25μl，将待测样品的模板dna加入到如表1所示的lamp反应体系中，在60-65℃下，反应50-70min。
45.表1.lamp反应体系
46.组分名称浓度(μm)加入量(μl)dna模板-2-4外引物f3/b3100μm0.05-0.1内引物fip/bip100μm0.4-0.5环引物lf100μm0.1-0.2bst dna聚合酶8u1-1.5dntp10mm each3.0-4.0甜菜碱5m3-5显色剂200mm1ph调节剂50mm ph9.01.1-1.3buffer-2.5加水补齐至-25
47.其中，buffer为100mmkcl、100mm(nh4)2so4、100mmmgso4、1％triton-100)；
48.显色剂为酚红、甲酚或中性红，优选为酚红。
49.ph调节剂为tris-hcl或naoh，优选地，ph调节剂优选tris-hcl，naoh易受环境污
染，自我改变扩增体系ph。
50.结果判定：
51.(1)目视法：直接观察颜色变化，从而判定lamp扩增的情况及样品中金黄色葡萄球菌的存在与否。当反应体系发生有效扩增时，反应体系由红色变为亮黄色，当未发生有效扩增时，反应体系保持红色。
52.(2)恒温变色扩增法：可通过恒温变色扩增仪直接判读反应体系颜色变化，并可实时绘制颜色变化曲线，设定阈值，判读结果。
53.实施例3样本检测
54.本发明提供的试剂盒检测的真实样品，适用范围包括食品样品、粪便、呕吐物、环境拭子、水样等标本或需要对细菌存在进行检测的生物样本。
55.(1)样本处理：增菌后，取1ml增菌液，低速离心收集沉淀，加入200ul chelex100裂解液，震荡混匀，100℃煮沸5min，取上清作为待测模板dna。
56.(2)lamp扩增：采用如表2所示的lamp检测反应体系，反应温度为63℃，反应时间为60min。
57.表2.lamp检测反应体系
[0058][0059][0060]
(3)结果判定：
[0061]
a.目视法判定：结果如图1所示，反应结束后直接观察反应体系颜色变化，当反应体系由红色变为亮黄色(如管1～3所示)，说明成功发生了特异性扩增，待测样本中含有金黄色葡萄球菌；当反应体系保持红色(如管4所示)，说明未发生扩增，待测样本中不含金黄色葡萄球菌。
[0062]
b.恒温变色曲线判定：结果如图2所示，检测到典型的扩增曲线，说明待测样本中含有金黄色葡萄球菌。
[0063]
实施例3灵敏度评价
[0064]
将金黄色葡萄球菌增菌液进行十倍梯度稀释后，浓度依次为：107cfu/ml、106cfu/ml、105cfu/ml、104cfu/ml、103cfu/ml、102cfu/ml、101cfu/ml按照实施例2的样本处理和反应体系对各稀释度金黄色葡萄球菌样本进行lamp检测，以确定检测方法的灵敏度。
[0065]
结果如图3和图4所示，由图可以看出，将金黄色葡萄球菌增菌液进行10倍梯度稀释后，建立的金黄色葡萄球菌闭管恒温变色检测体系灵敏度可达到102cfu/ml。
[0066]
实施例4特异性评价
[0067]
将金黄色葡萄球菌和常见的食源性微生物(大肠杆菌o157：h7、志贺氏菌、单增李斯特氏菌、副溶血弧菌、溶血链球菌、沙门氏菌、蜡样芽胞杆菌、铜绿假单胞杆菌等)的基因组dna，按照实施例2的反应体系和条件进行特异性实验。
[0068]
结果如图5所示，由图可以看出，只有金黄色葡萄球菌对应的反应体系颜色发生变化，出现典型的荧光扩增曲线，呈现阳性反应。
[0069]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。