一种利用凝乳酶辅助提取山羊乳细胞外囊泡的方法

1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种利用凝乳酶辅助提取山羊乳细胞外囊泡的方法。


背景技术：

2.细胞外囊泡(extracellular vesicles，ev)是由细胞分泌的一种没有复制能力的纳米颗粒，它们存在于各种生物液体中，并已经被证实在细胞间通信中发挥关键作用。
3.细胞外囊泡在不同细胞类型之间起着交换运输蛋白质、脂质、mirna或dna的作用，目前已经被证明在肿瘤转移、组织再生等过程中发挥重要作用，并已被提出作为不同疾病的预后标志物。例如近年来研究较为广泛的间充质干细胞(msc)来源的ev具有与msc相似的生物学效应，如减少细胞凋亡、减轻炎症反应、促进血管生成、抑制纤维化、提高组织修复潜力等，而且易提取、改造，与干细胞移植相比致肿瘤风险低，在损伤修复的生物学治疗中具有广阔应用前景。目前各种细胞培养液上清等来源的细胞外囊泡较难获得且提取后浓度较低，难以大批量生产使用，由于ev的体积非常小，对其分离、观察和鉴定具有一定的挑战性，寻找高效的ev分离和鉴定方法是研究的前提。
4.在可能的来源中，乳汁无毒无害且易于获得，可以从中获得高产量、无害和成本效益的细胞外囊泡，因此探究从乳中提取高质量的细胞外囊泡方法具有重大意义。目前针对人乳、牛乳、猪乳、骆驼乳中细胞外囊泡的研究较为广泛，其无毒性和非免疫原性在健康模型中已被证实，且有研究证明可以作为预防药物载体的广泛应用。而针对山羊奶细胞外囊泡的相关研究还较为缺乏，对于山羊奶细胞外囊泡的具体功能也尚未见报道。
5.目前提取乳细胞外囊泡的方法运用较多的为超速离心法，但是提取得到的细胞外囊泡纯度不高，效果不好。在不需要使用超高速离心机的方法中使用较多的则是密度梯度离心法和试剂盒提取法，密度梯度离心操作复杂、耗时长且提取纯度较低，另外试剂盒提取法由于提取效率较低且价格昂贵，导致在行业内的认可程度也不高。特别是在乳源细胞外囊泡的相关研究中，如何稳定的得到高浓度高纯度的细胞外囊泡是一个有待解决的重要问题。因此开发一种提取高质量山羊乳细胞外囊泡的方法具有重要意义。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用凝乳酶辅助提取山羊乳细胞外囊泡的方法，能够减少提取的细胞外囊泡中的乳蛋白，同时能够保护细胞外囊泡的完整性以及细胞外囊泡中生物大分子的活性。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
8.本发明提供了一种利用凝乳酶辅助提取山羊乳细胞外囊泡的方法，所述方法包括以下步骤：
9.取乳样上清a，加入凝乳酶后，按照2000-3000g的转速离心收集上清b；
10.将所述上清b于4℃，按照80000-120000g的转速离心30-40min，收集上清c，使用微
滤膜过滤，收集滤液d；
11.将所述滤液d于4℃，按照80000-120000g的转速离心60-80min，收集沉淀f即为细胞外囊泡粗产物；
12.将所述细胞外囊泡粗产物重悬，获得的细胞外囊泡重悬样本加到蔗糖垫上，于4℃，按照80000-120000g的转速离心60-80min；
13.取出所述蔗糖垫，稀释后，于4℃，按照80000-120000g的转速离心60-80min，去除上清，所得沉淀即为山羊乳细胞外囊泡。
14.可选的，所述凝乳酶的使用浓度为0.03-0.05mg/ml，添加量为1.75mg/50ml乳液上清。
15.可选的，所述步骤还包括，将所述滤液d于4℃，按照80000-120000g的转速离心60-80min，收集沉淀e；将所述沉淀e重悬后，于4℃，按照80000-120000g的转速离心60-80min，收集沉淀f为细胞外囊泡粗产物。
16.可选的，所述蔗糖垫浓度为30％。
17.可选的，所述细胞外囊泡重悬样本与蔗糖垫的体积比为2:1-5:1。
18.可选的，所述山羊乳细胞外囊泡直接置于-80℃保存，或稀释后于-80℃保存。
19.可选的，所述乳样上清a的获得方法包括如下步骤：取乳样，于4℃，按照3000-5000g的转速离心10min，收集上清即为乳样上清a。
20.可选的，所述乳样为山羊乳，所述山羊乳为新鲜乳液，或冻存于-80℃，使用时于37℃下解冻后的乳液。
21.可选的，所述使用微滤膜过滤为使用0.45μm滤膜过滤。
22.本发明的另一目的是提供一种采用上述方法获得的山羊乳细胞外囊泡。
23.相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
24.本发明提供了一种利用凝乳酶辅助提取山羊乳细胞外囊泡的方法，在对山羊乳进行超高速离心之前添加了凝乳酶预处理的步骤，可以在超高速离心之前使酪蛋白沉降，提前去除乳中的酪蛋白，增强后续离心、过滤等步骤的效率，防止提取出的细胞外囊泡中混入过多的乳蛋白。
25.本发明用凝乳酶去除山羊乳中的酪蛋白后再进行多次的超速离心，超速离心分离可以准确地重复获取细胞外囊泡，同时最大限度减少蛋白质聚集体和其他膜粒子的共纯化，全程在4℃低温下操作也最大程度的保护了细胞外囊泡中各种生物大分子的活性。
26.本发明在得到山羊乳细胞外囊泡粗产物后又加入了蔗糖垫纯化步骤，不仅可以去除高密度蛋白质污染物，还能最大程度的保证细胞外囊泡的完整性。
附图说明
27.图1：500nm和100nm下凝乳酶辅助法提取山羊乳细胞外囊泡电镜图，其中，a为500nm倍数，b为100nm倍数；
28.图2：500nm和100nm下超速离心法提取山羊乳细胞外囊泡电镜图，其中，a为500nm倍数，b为100nm倍数；
29.图3：凝乳酶辅助法提取山羊乳细胞外囊泡粒径分布图；
30.图4：超速离心法提取山羊乳细胞外囊泡粒径分布图；
31.图5：凝乳酶辅助法提取山羊乳细胞外囊泡蛋白标准曲线；
32.图6：超速离心法提取山羊乳细胞外囊泡蛋白标准曲线；
33.图7：不同方法提取山羊乳细胞外囊泡wb蛋白鉴定图，其中，1为超速离心法提取细胞外囊泡，2为凝乳酶辅助法提取细胞外囊泡。
具体实施方式
34.本发明提供了一种利用凝乳酶辅助提取山羊乳细胞外囊泡的方法，利用凝乳酶沉降山羊乳中的酪蛋白，结合超速离心法提取山羊奶乳细胞外囊泡，再通过蔗糖垫进行纯化，能够稳定获得高纯度高浓度的山羊乳细胞外囊泡。
35.本发明所述方法包括以下步骤：取乳样上清a，加入凝乳酶后，按照2000-3000g的转速离心，收集上清b；将所述上清b于4℃，按照80000-120000g的转速离心30-40min，优选按照90000-110000g的转速离心33-38min，收集上清c，使用微滤膜过滤，收集滤液d；将所述滤液d于4℃，按照80000-120000g的转速离心60-80min，优选按照90000-110000g的转速离心65-73min，收集沉淀f即为细胞外囊泡粗产物；将所述细胞外囊泡粗产物重悬，获得的细胞外囊泡重悬样本加到蔗糖垫上，于4℃，按照80000-120000g的转速离心60-80min，优选按照90000-110000g的转速离心65-73min；取出所述蔗糖垫，稀释后，于4℃，按照80000-120000g的转速离心60-80min，优选按照90000-110000g的转速离心65-73min，去除上清，所得沉淀即为山羊乳细胞外囊泡。
36.本发明中使用的凝乳酶是一种最早在未断奶的犊牛胃中发现的天门冬氨酸蛋白酶，可专一地切割乳中κ-酪蛋白之间的肽键，破坏酪蛋白胶束使牛奶凝结，目前研究认为山羊乳中酪蛋白含量过高，凝乳酶沉降酪蛋白的作用不大，然而本发明研究发现在提取山羊乳细胞外囊泡的过程中加入凝乳酶能够减少提取出的细胞外囊泡中混入的乳蛋白。
37.本发明中，所述凝乳酶的使用浓度为0.03-0.05mg/ml，添加量为1.75mg/50ml乳液上清；优选的，所述凝乳酶的使用浓度为0.035-0.042mg/ml，本发明中添加凝乳酶后，经离心能够沉降山羊乳中的酪蛋白，进而使得提取的山羊乳细胞外囊泡纯度提高。
38.本发明去除酪蛋白后，使用超速离心机进行多次超高速离心，并全程于4℃低温条件下离心，能够准确的获取细胞外囊泡，并且低温条件保护了细胞外囊泡中各种生物大分子的活性。
39.本发明中，所述步骤还包括，将所述滤液d于4℃，按照80000-120000g的转速离心60-80min，优选的，按照90000-110000g的转速离心65-73min，收集沉淀e；将所述沉淀e重悬后，于4℃，按照80000-120000g的转速离心60-80min，优选的，按照90000-110000g的转速离心65-73min，收集沉淀f为细胞外囊泡粗产物；本发明中，通过多次超速离心能够减少蛋白质的聚集体和其他膜粒子的共纯化，提高了山羊乳细胞外囊泡的纯度。作为一种可实施的方式，本发明中使用于-20℃预冷的1
×
pbs重悬沉淀e，可选的，使用10ml预冷的1
×
pbs重悬沉淀e后进行离心。
40.本发明中，所述蔗糖垫浓度为30％，使用重水配制，本发明利用30％的蔗糖垫纯化获得的山羊乳细胞外囊泡粗产物，能够去除高密度蛋白质污染物，同时保证细胞外囊泡的完整性；可选的，所述细胞外囊泡重悬样本与蔗糖垫的体积比为2:1-5:1，优选的，所述体积比为3:1-4:1。作为一种可实施的方式，本发明中使用1ml于-20℃预冷的1
×
pbs重悬山羊乳
细胞外囊泡粗产物，缓慢加入到250μl浓度为30％的蔗糖垫上。
41.本发明中，提取的所述山羊乳细胞外囊泡直接置于-80℃保存，或稀释后于-80℃保存。作为一种可实施的方式，本发明使用1
×
pbs稀释山羊乳细胞外囊泡后于-80℃保存。
42.本发明中，所述乳样上清a的获得方法包括如下步骤：取乳样，于4℃，按照3000-5000g的转速离心10min，优选的，按照3800-4500的转速离心，收集上清即为乳样上清a；所述乳样为山羊乳，所述山羊乳为新鲜乳液，或冻存于-80℃，使用时于37℃下解冻后的乳液。本发明中，乳样经离心后，乳脂蛋白和细胞碎片沉淀于底层，取上清进行后续处理有助于获得高纯度的山羊乳细胞外囊泡。
43.本发明中，所述使用微滤膜过滤为使用0.45μm滤膜过滤。
44.本发明还提供一种山羊乳细胞外囊泡，所述山羊乳细胞外囊泡为采用上述方法获得的。本发明提供的山羊乳细胞外囊泡完整，纯度高，混入的乳蛋白少。
45.如无特殊说明，本发明涉及的试剂、耗材等均可从商业途径获得，如未注明实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件进行。
46.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
47.实施例1
48.本实施例提供了利用凝乳酶辅助提取山羊乳细胞外囊泡的方法
49.取50ml预先冻存在-80℃中的山羊乳，在37℃中解冻后的乳液，于4℃，按照5000g的转速，离心10min，收集上清a至新的离心管中，沉淀层为乳脂蛋白和细胞碎片；
50.在上清a中加入1.75mg凝乳酶(0.035mg/ml)，于4℃，按照2000g的转速离心10min，收集上清b；
51.将收集到的上清b于4℃，按照10000g的转速，离心30min，以去除较大的囊泡，收集上清c，使用0.45μm滤膜过滤，收集滤液d；
52.将收集到的滤液d于4℃，按照100000g的转速，离心70min，收集沉淀e；
53.将沉淀e用10ml于-20℃预冷的1
×
pbs重悬后，再次于4℃，按照100000g的转速，离心70min，收集沉淀f即为细胞外囊泡粗产物；
54.得到的细胞外囊泡粗产物用1ml的pbs重悬，将细胞外囊泡重悬样本缓慢加到250μl浓度为30％的蔗糖垫上，于4℃，按照100000g的转速，离心70min；
55.取出250μl蔗糖垫，用pbs稀释至1ml，于4℃，按照100000g的转速，离心70min，去除上清得到的沉淀即为山羊乳细胞外囊泡。
56.实施例2
57.本实施例提供了利用凝乳酶辅助提取山羊乳细胞外囊泡的方法
58.取50ml新鲜的山羊乳液，于4℃，按照4000g的转速，离心10min，收集上清a至新的离心管中，沉淀层为乳脂蛋白和细胞碎片；
59.在上清a中加入1.75mg凝乳酶(0.04mg/ml)，于4℃，按照2500g的转速离心15min，收集上清b；
60.将收集到的上清b于4℃，按照9000g的转速，离心40min，以去除较大的囊泡，收集上清c，经0.45μm滤膜过滤，收集滤液d；
61.将收集到的滤液d于4℃，按照90000g的转速，离心75min，收集沉淀e；
62.将沉淀e用10ml于-20℃预冷的1
×
pbs重悬后，再次于4℃，按照90000g的转速，离心75min，收集沉淀f即为细胞外囊泡粗产物；
63.得到的细胞外囊泡粗产物用1ml的pbs重悬，将细胞外囊泡重悬样本缓慢加到300μl浓度为30％的蔗糖垫上，于4℃，按照90000g的转速，离心75min；
64.取出300μl蔗糖垫，用pbs稀释至1ml，于4℃，按照90000g的转速，离心75min，去除上清得到的沉淀即为山羊乳细胞外囊泡。
65.实施例3
66.本实施例提供了利用凝乳酶辅助提取山羊乳细胞外囊泡的方法
67.取50ml新鲜的山羊乳液，于4℃，按照3000g的转速，离心10min，收集上清a至新的离心管中，沉淀层为乳脂蛋白和细胞碎片；
68.在上清a中加入1.75mg凝乳酶(0.035mg/ml)，于4℃，按照3000g的转速离心12min，收集上清b；
69.将收集到的上清b于4℃，按照11000g的转速，离心35min，以去除较大的囊泡，收集上清c，经0.45μm滤膜过滤，收集滤液d；
70.将收集到的滤液d于4℃，按照110000g的转速，离心62min，收集沉淀e；
71.将沉淀e用10ml于-20℃预冷的1
×
pbs重悬后，再次于4℃，按照110000g的转速，离心62min，收集沉淀f即为细胞外囊泡粗产物；
72.得到的细胞外囊泡粗产物用1ml的pbs重悬，将细胞外囊泡重悬样本缓慢加到250μl浓度为30％的蔗糖垫上，于4℃，按照110000g的转速，离心62min；
73.取出250μl蔗糖垫，用pbs稀释至1ml，于4℃，按照110000g的转速，离心62min，去除上清得到的沉淀即为山羊乳细胞外囊泡。
74.对比例1
75.本对比例提供了采用超速离心提取山羊乳细胞外囊泡的方法
76.取50ml预先冻存在-80℃中的山羊乳，在37℃中解冻后的乳液，于4℃，按照5000g的转速，离心10min，收集上清a至新的离心管中；
77.将上清液a移至新的离心管中，于4℃，按照10000g的转速，离心30min以去除较大的囊泡，使用0.45μm滤膜过滤，收集过滤液b；
78.将过滤液b移至新的离心管中，于4℃，按照10000g的转速，离心70min，收集沉淀c；
79.将沉淀c用10ml于-20℃预冷的1
×
pbs重悬后，再次于4℃，按照100000g的转速，离心70min，收集沉淀d即为山羊乳细胞外囊泡。
80.实施例4
81.本实施例用透射电子显微镜(tem)、纳米粒子跟踪分析(nta)和蛋白质印迹法(westernblot)验证了实施例1和对比例1提取的山羊乳细胞外囊泡的效果。
82.1.细胞外囊泡样品透射电镜观察
83.(1)用300μlpbs重悬所得细胞外囊泡干粉，取出20μl，剩余样品于-80℃保存；
84.(2)吸取样品10μl滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液；
85.(3)醋酸双氧铀10μl滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液；
86.(4)常温放置数分钟至干燥，用100kv进行电镜检测成像。
87.2.细胞外囊泡样品粒径分析
88.取冻存于-80℃样本10μl，25℃水浴解冻，冰上放置，样本用1
×
pbs按照450倍数稀释后直接用于nta检测。
89.3.细胞外囊泡中蛋白的提取及浓度测定
90.(1)在37℃条件下速融取冻存于-80℃的细胞外囊泡样本10μl，并迅速加入5
×
ripa裂解液；
91.(2)混匀后在冰上裂解30min，期间进行震荡混匀；
92.(3)配制bca法测蛋白浓度的标准样品，并取5μl样品加入到bca混合液中，混匀；
93.(4)将样品置于37℃孵育30min，用酶标仪检测od
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nm处吸光值并记录；
94.(5)根据标准曲线算出待测样品蛋白浓度。
95.4.外泌体样品wb蛋白指标检测
96.(1)配制浓度为12％的sds page电泳胶；将电泳装置装好后加入适量running buffer；
97.(2)取出待测蛋白样品，恒温金属浴煮3-5min，将蛋白样品以及蛋白maker按所需顺序用移液器或上样针加入到电泳胶上的孔内；
98.(3)盖上槽盖，打开电源，80v跑胶至样品跑出浓缩胶，转100v跑胶至溴酚蓝至胶底部；
99.(4)电泳完毕后取出电泳胶，根据胶的尺寸裁剪相应大小的pvdf膜，在左下角剪角做标记，在适量甲醇中活化20s，然后浸泡于预冷的转膜缓冲液中；
100.(5)取8张滤纸切成8cm
×
10cm的尺寸，同样浸泡在预冷的转膜缓冲液中，按照海绵-滤纸-电泳胶-膜-滤纸-海绵的顺序依次放置；
101.(6)将转膜缓冲液加入槽中，组装好转膜装置，加入浮冰，将装置埋于冰浴或置于冰箱，打开电源，300ma转膜，转膜时间依据需检测蛋白的大小确定，一般规则为1kd＝1min；
102.(7)转膜完毕后取出pvdf膜，将膜按蛋白面朝上浸泡于5％脱脂牛奶tbst中，封闭1h；
103.(8)一抗封闭：牛奶封闭后的膜按需裁剪，将膜浸泡于配制好的一抗溶液(抗体稀释比例均为1:1000)中，4℃孵育过夜。
104.(9)回收一抗，用20mltbst在室温下洗膜10min，重复三次；
105.(10)根据一抗选择二抗，将二抗按1:5000配在5％脱脂牛奶tbst溶液中，将膜浸泡在二抗溶液中，室温孵育1h左右；
106.(11)回收二抗，用20mltbst在室温下洗膜10min，重复三次；
107.(12)取出pvdf膜，沥干水分，蛋白面朝上平铺于保鲜膜上，将等体积混合的ecla/b液混合液滴加到膜上避光反应5min；将膜夹起移入塑封膜中，蛋白面始终朝上；
108.(13)将膜放在成像仪中，设置好参数，开始曝光，调整好亮度和对比度，保存图片。
109.5.实验结果
110.5.1透射电镜观察山羊乳细胞外囊泡
111.实施例1的凝乳酶辅助法和对比例1的超速离心法提取山羊乳细胞外囊泡观察结果如图1和图2所示，在500nm的倍数下，很明显的能看出实施例1提取的细胞外囊泡视野内可以明显观察到多个囊泡状个体，较对比例1中更清晰，且视野内可以看出杂质也明显较对比例1中更少；100nm倍数下两种方法均能观察到细胞外囊泡，其中可以明显观察到实施例1
提取的细胞外囊泡具有典型的茶托型和一侧凹陷的半球形。
112.5.2细胞外囊泡粒径分析结果
113.细胞外囊泡粒径分析结果显示，实施例1和对比例1两种方法提取的细胞外囊泡平均粒径均在100-200nm之间，其中对比例1提取的细胞外囊泡平均粒径为157.5nm，浓度为4.6
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particles/ml，实施例1提取细胞外囊泡平均粒径为171.1nm，浓度为1.3
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particles/ml。由于nta只能检测粒子的大小，并不能分辨粒子的类别，所以有些细胞碎片等杂质也会一并算入，检测浓度也只能作为参考，并不能说明超速离心法提取的细胞外囊泡浓度更高。两种方法提取的细胞外囊泡具体浓度和粒径分布见图3和图4，明显可以看出本发明实施例1提取的细胞外囊泡在粒径分布上更为集中。
114.5.3细胞外囊泡的蛋白检测结果
115.通过bca试剂盒可以提取出细胞外囊泡中的总蛋白含量，首先制定两种方法提取的细胞外囊泡蛋白的标准曲线，如图5和图6所示。将细胞外囊泡中蛋白在光密度od
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nm时测出的分光光度值分别带入到各自的公式中进行计算，得到本发明实施例1提取的细胞外囊泡中蛋白浓度为0.598414μg/μl，而对比例1提取的细胞外囊泡蛋白浓度则高达1.436422μg/μl。
116.为了确定提取产物确实为细胞外囊泡，用wb来鉴定细胞外囊泡的标志蛋白是否存在于样品中，根据国际细胞外囊泡学会制定的“两阳一阴”的金标准，我们选取了标志蛋白tsg101和cd81作为阳性指标，选取内质网膜上的钙离子结合蛋白calnexin为阴性对照，wb结果如图7所示，明显看出对比例1提取的细胞外囊泡tsg101和cd81条带均不明显，而本发明实施例提取的细胞外囊泡tsg101条带明显，cd81条带较浅，两种细胞外囊泡中均不含calnexin蛋白，符合预期结果。
117.以上结果表明，虽然对比例1提取的细胞外囊泡蛋白浓度是本发明实施例1的近三倍，但是根据wb检测结果，对比例1提取的细胞外囊泡中的标志蛋白条带并不明显，说明对比例1提取的细胞外囊泡中可能存在更多酪蛋白等杂蛋白，而本发明实施例1由于更大程度的沉降了酪蛋白，其提取的细胞外囊泡中蛋白浓度相对更为接近其本身所含蛋白浓度，wb检测结果也印证了这一点。
118.综上所述可知，超速离心法和凝乳酶辅助法均可成功提取出细胞外囊泡，在电镜下观察到本发明利用凝乳酶辅助法提取出的细胞外囊泡更多，背景杂质更少。nta结果显示本发明利用凝乳酶辅助法提取出的细胞外囊泡粒径分布比超离法提取的更加集中，效果更好。wb结果显示本发明利用凝乳酶辅助法提取的细胞外囊泡中标志蛋白含量更高，杂蛋白含量更少。
119.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。