一种梯度结构抗菌水凝胶敷料及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及医用水凝胶敷料领域，特别是涉及一种梯度结构抗菌水凝胶敷料及其制备方法和应用。


背景技术：

2.由致病菌引起的皮肤伤口感染已成为一个全球性的医疗保健挑战，这可能导致严重的皮肤组织损伤，甚至危及生命。迄今为止，抗生素、抗菌肽、季铵盐化合物、金属离子和金纳米颗粒等许多策略已被用于对抗细菌感染。然而，这些方法仍存在使用寿命短、耐药性强、细胞毒性强、成本高等缺点。考虑到伤口的愈合是一个高度协调的过程，涉及多个阶段(止血、炎症、增殖和重塑)。传统的纱布类敷料无法维持创面愈合所需的湿润环境，而且易粘连伤口组织，换药时造成二次机械损伤。并且其不具有抗菌性，创面易受到细菌感染，产生难闻的气味并引发伤口并发症，不利于伤口愈合。因此迫切需要开发新型功能性敷料。
3.水凝胶敷料既能在伤口表面形成一个物理屏障，阻止外界水分、灰尘、细菌等进入伤口，避免伤口二次感染，能够为伤口提供理想的温湿度和ph环境，利于伤口加快愈合，这与目前权威公认的伤口“湿法疗法”理论相吻合。因此，在各种可用于制造水凝胶敷料的天然和合成聚合物中，海藻酸钠和羟甲基纤维素因为具备来源丰富、良好生物相容性及资源可再生特点，备受关注。磷酸钙是一个生物相容性可降解材料，其可控释放钙离子通过螯合作用促使海藻酸钠溶液成胶。银离子是抗菌性能较佳的金属离子，但是其毒副作用限制了其在敷料中应用。因此构筑具有抗菌生物相容性藻酸盐基凝胶仍有一定技术挑战。
4.综上，开发一种既要维持伤口湿性愈合环境，又具有安全抗菌效果，同时促进伤口愈合的医用敷料是十分有必要的。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种梯度结构抗菌水凝胶敷料及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，该水凝胶敷料能够调节皮肤伤口的炎症因子，抑制炎症发生，还能促进创面处的胶原纤维和血管再生，进而促进伤口愈合。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.本发明提供一种梯度结构抗菌水凝胶敷料的制备方法，包括以下步骤：
8.(1)制备掺银磷酸钙粒子：将钙源和银源溶于酒精溶液，分散后得溶液a；将磷源加入酒精溶液得溶液b；溶液a和溶液b混合反应，经离心、干燥和粉碎，得到掺银磷酸钙粒子；
9.(2)取海藻酸钠溶液、羟甲基纤维素钠溶液、掺银磷酸钙粒子和甘油混合后，获得梯度结构抗菌水凝胶敷料。
10.进一步地，在步骤(1)中，所述钙源包括氯化钙或硝酸钙；所述银源包括硝酸银、硫代硫酸银或硫酸银；所述磷源包括磷酸。
11.进一步地，在步骤(1)中，所述钙源、银源和磷源的质量比为(5-15)：(2.8-3)：(2.4-2.8)；所述酒精溶液的体积浓度为50-75％。
12.进一步地，在步骤(1)中，所述混合反应的时间为20-35min；所述离心条件为10000-15000rpm离心2-5min。
13.进一步地，在步骤(2)中，所述海藻酸钠溶液的质量百分比浓度为1-8％；所述羟甲基纤维素钠溶液的质量百分比浓度为2-5％。
14.进一步地，在步骤(2)中，所述海藻酸钠溶液、羟甲基纤维素钠溶液、掺银磷酸钙粒子和甘油的质量比为(10-15)：(6-9)：(0.5-0.8)：3。
15.进一步地，在步骤(2)中，取海藻酸钠溶液、羟甲基纤维素钠溶液、掺银磷酸钙粒子和甘油混合后，充分搅拌30-60min，之后静置除去气泡，获得梯度结构抗菌水凝胶敷料。
16.本发明还提供一种根据上述的制备方法获得的梯度结构抗菌水凝胶敷料。
17.本发明还提供一种根据上述的梯度结构抗菌水凝胶敷料在制备感染性创面修复药物中的应用。
18.进一步地，所述梯度结构抗菌水凝胶敷料通过抑制感染性细菌、降低促炎性细胞因子的表达以及促进创面胶原纤维增多和血管再生，发挥修复感染性创面的作用。
19.本发明公开了以下技术效果：
20.本发明制备的梯度结构抗菌水凝胶敷料，具有生物相容性好和高效的抗菌性能，有效的促进皮肤组织修复。本发明在制备过程中将银离子掺杂于磷酸钙中，既增加抑菌的广谱性，又增加生物相容性，而且还提高了水凝胶敷料的力学性质，制得的水凝胶敷料能够调节皮肤伤口的炎症因子，抑制炎症发生，并且还能促进创面处的胶原纤维和血管再生，进而促进伤口愈合。本发明利用掺银磷酸钙与凝胶基材的密度差异性，可控制备梯度结构的抗菌水凝胶敷料，为新型敷料提供新的设计策略。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
22.图1为本发明制备梯度结构抗菌水凝胶敷料的示意图；
23.图2为本发明中掺银磷酸钙的扫描电镜图(形貌和edx mapping图，标尺：1μm)；
24.图3为本发明中梯度结构抗菌水凝胶敷料的细胞毒性及抗菌效果图；
25.图4为本发明中梯度结构抗菌水凝胶敷料用于大鼠细菌感染性伤口的修复图及h&e染色图；
26.图5为本发明大鼠模型的伤口组织区的细菌涂板图及细菌存活率统计结果；
27.图6为本发明中梯度结构抗菌水凝胶敷料用于大鼠细菌感染性伤口的masson三色染色修复图；
28.图7为本发明中梯度结构抗菌水凝胶敷料用于大鼠细菌感染性伤口修复组织的il-6和tnf-α的免疫荧光图像；
29.图8为本发明中梯度结构抗菌水凝胶敷料用于大鼠细菌感染性伤口修复组织的α-sma、collagen 1和collagen 3的免疫荧光染色图像；
30.图9为本发明中梯度结构抗菌水凝胶敷料用于大鼠感染性伤口修复后，各组的鼠
肝脏和肾脏的h&e图。
具体实施方式
31.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
32.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
33.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
34.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
35.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
36.实施例1一种梯度结构抗菌水凝胶敷料的制备方法
37.包括以下步骤：
38.(1)将4.92g的硝酸钙，2g的硝酸银，加入到200ml 50％酒精溶液中，超声分散后，得到溶液a；称取2.3g 85％磷酸加入到150ml 50％酒精溶液中，超声分散后，得到溶液b；溶液a和溶液b混合后，反应20min，之后10000rpm离心5min，离心三次后真空干燥，研磨，得到掺银磷酸钙粒子。
39.(2)海藻酸钠5g加入到95g的蒸馏水中，通过机械搅拌得到均匀溶液c，羟甲基纤维素钠4g加入至95g的蒸馏水同样通过机械搅拌得到均匀溶液d，取c溶液10g，d溶液7g，0.5g掺银磷酸钙粒子，甘油(纯度ar 99％)3g混合均匀后，充分搅拌30min后，静置除去气泡，将混合溶液加入至聚四氟乙烯模具中，静置20分钟后，得到梯度结构抗菌水凝胶敷料(hec-sa-ag@cap)。
40.实施例2
41.一种梯度结构抗菌水凝胶敷料的制备方法
42.包括以下步骤：
43.(1)将5.36g的硝酸钙，2.8g的硫代硫酸银，加入到250ml 65％酒精溶液中，超声分散后，得到溶液a；称取2.5g 85％磷酸加入到180ml 65％酒精溶液中，超声分散后，得到溶液b；溶液a和溶液b混合后，反应30min，之后15000rpm离心3min，离心三次后真空干燥，研磨，得到掺银磷酸钙粒子。
44.(2)海藻酸钠7g加入到93g的蒸馏水中，通过机械搅拌得到均匀溶液c，羟甲基纤维
素钠5g加入至93g的蒸馏水同样通过机械搅拌得到均匀溶液d，取c溶液12g，d溶液9g，0.8g掺银磷酸钙粒子，甘油3g混合均匀后，充分搅拌60min后，静置除去气泡，将混合溶液加入至聚四氟乙烯模具中，静置30分钟后，得到梯度结构抗菌水凝胶敷料(hec-sa-ag-1@cap)。
45.实施例3
46.一种梯度结构抗菌水凝胶敷料的制备方法
47.包括以下步骤：
48.(1)将5.82g的氯化钙，3.0g的硫酸银，加入到300ml75％酒精溶液中，超声分散后，得到溶液a；称取3.6g 85％磷酸加入到200ml75％酒精溶液中，超声分散后，得到溶液b；溶液a和溶液b混合后，反应35min，之后12000rpm离心2min，离心三次后真空干燥，研磨，得到掺银磷酸钙粒子。
49.(2)海藻酸钠8g加入到92g的蒸馏水中，通过机械搅拌得到均匀溶液c，羟甲基纤维素钠2g加入至92g的蒸馏水同样通过机械搅拌得到均匀溶液d，取c溶液15g，d溶液6g，0.7g掺银磷酸钙粒子，甘油3g混合均匀后，充分搅拌45min后，静置除去气泡，将混合溶液加入至聚四氟乙烯模具中，静置10分钟后，得到梯度结构抗菌水凝胶敷料(hec-sa-ag-2@cap)。
50.对比例1
51.与实施例1的区别仅在于，步骤(1)缺少硝酸银组分，最终制得的凝胶为hec-sa-cap。
52.对比例2
53.制备凝胶的步骤为：将海藻酸钠5g加入到95g的蒸馏水中，通过机械搅拌得到均匀溶液c，羟甲基纤维素钠4g加入至95g的蒸馏水同样通过机械搅拌得到均匀溶液d，取c溶液10g，d溶液7g，甘油3g混合混合均匀后，充分搅拌30min后，静置除去气泡，将混合溶液加入至聚四氟乙烯模具中，静置20分钟后，得到凝胶hec-sa。
54.效果验证
55.1掺银磷酸钙粒子的形貌特征
56.图1为本发明中梯度结构抗菌水凝胶敷料hec-sa-ag@cap的构建示意图。对实施例1步骤(1)中制备的掺银磷酸钙粒子进行电镜扫描，观察其形貌，如图2所示，本发明成功构筑银掺杂的磷酸钙粒子，主要元素为钙，磷，银，尺寸在1-8微米之间。
57.2检测水凝胶敷料hec-sa-ag@cap的安全性
58.采用cck-8法检测细胞活力(cell viability)，小鼠成纤维细胞(l929)在含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的dmem中培养，在5％二氧化碳和37℃条件下进行。将小鼠成纤维细胞以每孔1
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104个细胞的密度接种在24孔板上。细胞孵育24h后，在24孔(transwell)中加入实施例1制备的凝胶和等量的pbs作为对照组。用凝胶和pbs孵育1天后，用含有10％(v/v)的cck-8溶液的500μl新鲜dmem替换细胞培养基，黑暗孵育。培养2h后，将200μl上清液放入96孔板中，用分光光度计测定450nm培养板溶液的光密度(od)。
59.细胞存活率(cell viability)＝od(实验-空白)/od(对照-空白)*100％。
60.实验结果如图3所示，本发明实施例1制备的梯度结构抗菌水凝胶敷料hec-sa-ag@cap的浸出液明显显示低毒和基本上没有毒性，表明本发明制备的水凝胶辅料安全性良好，适于推广应用。
61.3.水凝胶敷料hec-sa-ag@cap的体外抗菌效果
62.为验证水凝胶敷料的体外抗菌效果，选择金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作为模型细菌。具体验证方法如下：
63.在tsb培养基中制备金黄色葡萄球菌(s.aureus)，在lb中制备大肠杆菌(e.coli)。首先，将50μl的原液菌与9.95ml的生长培养基混合，孵育12h(37℃，250rpm)。然后离心稀释，取浓度为106cfu/ml的细菌悬液通过稀释法产生菌落。
64.将实施例1制备的梯度抗菌凝胶hec-sa-ag@cap为实验组，以磷酸盐缓冲溶液为对照组；将0.5克梯度抗菌凝胶放置在24孔板中。每组三个平行实验孔，然后，将500μl制备的细菌肉汤加入到这些离心管中，并与凝胶接触1小时后，取出50μl菌液，滴入琼脂平板上，均匀分散，37℃孵育15-24h。从图3可以看出，hec-sa-ag@cap梯度抗菌凝胶组对两种微生物(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)均具有明显的抗菌作用，基本上将细菌都杀灭。
65.4.水凝胶敷料hec-sa-ag@ca对伤口修复效果
66.实验方法：
67.he染色步骤：将组织片进行如下步骤处理，a、脱蜡，脱蜡二甲苯ⅰ、ⅱ各10分钟，事先准备好盖玻片；b、覆水，100％(ⅰ、ⅱ)、90％、80％、70％酒精各5分钟，自来水冲洗5分钟
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3；c、苏木精染色5分钟，根据染色情况，可以适当增加或减少染色时间，流水冲洗；d、5％乙酸分化1分钟，流水冲洗，用吸管滴加乙酸，布满玻片上的组织即可，分化后颜色变浅了一些，成为蓝色。e、返蓝：返蓝液，实验室没有，也可不用；f、伊红染色1分钟，根据染色情况，可以适当增加或减少染色时间，流水冲洗；g、脱水：70％、80％、90％、100％酒精各10秒，二甲苯1分钟，可以在通风橱自然晾干再封片，约5分钟左右；h、滴上中性树胶，封片，用吸管滴上一滴即可，尽量少滴，但压片后要将组织全部覆盖完，避免中间有气泡。
68.组织处细菌数量评估，选取各组感染组织处，取样涂板至营养琼脂板上，然后计数，每组平行实验3组。
69.masson三色染色法步骤：a切片常规脱蜡至水；b用配制好的weigert铁苏木素染色液染色5min-10min；c充分水洗，如过染可盐酸酒精分化；d masson蓝化液返蓝3-5min，水洗；e蒸馏水洗1min；f丽春红品红染色液染色5-10min；g在上述操作过程中按蒸馏水：弱酸溶液＝2:1比例配置弱酸工作液，用弱酸工作液洗1min；h 1％磷钼酸溶液洗1-2min；i用配置好的弱酸工作液洗1min；j不经水洗直接放入苯胺蓝染色液中染色1-2min；k用配置好的弱酸工作液洗1min；l 95％乙醇快速脱水；m无水乙醇脱水3次，每次5-10s；n二甲苯透明3次，每次1-2min；o中性树胶封固。
70.免疫组化实验：a对应抗体如白介素-6(il-6)和肿瘤坏死因子collagen1,collagen 3，α-平滑肌肌动蛋白(α-sma)和dapi标记组织切片；b染色反应；c显微观察。
71.利用金黄色葡萄球菌感染了大鼠受损皮肤构建大鼠皮肤创面模型，并在模型伤口处分别加入实施例1、对比例1、对比例2所制备的水凝胶敷料为水凝胶处理组，并以pbs为对照，验证hec-sa-ag@ca体内抗菌作用和愈合性能。
72.结果如图4，水凝胶处理组hec-sa、hec-sa-cap和hec-sa-ag@cap在整个试验过程中的皮肤伤口面积均小于pbs组。但是观察到hec-sa-ag@cap组的伤口修复速度最快，分析可能是源于其优异的敷料中缓释银离子的杀菌特性。
73.为了探讨其愈合过程的生物学机制，进一步按上述实验方法进行了h&e、以及修复组织处细菌数量评估、masson三色染色和免疫组化实验。图4中(标尺：200μm)，h&e染色结果
显示，第10天，hec-sa-ag@cap组的真皮组织完全再生，浸润性炎症细胞较少。并且从修复组织处细菌涂板数据看(图5)，hec-sa-ag@cap组处理的组织处细菌数量明显少于其他组。图6中(标尺：200μm)，我们使用masson三色染色来验证胶原纤维(蓝色)的形成。hec-sa-ag@cap组的胶原纤维数量远高于pbs组的胶原纤维数量，如图7所示(标尺：500μm)，我们进一步对创面进行白介素-6(il-6)和肿瘤坏死因子(tnf-α)免疫荧光染色，以更好地了解创面愈合进展。hec-sa-ag@cap组il-6和tnf-α表达量最低，证实了设计的梯度结构水凝胶的炎症调节效果最好，能够有效抑制伤口发生炎症，促进伤口快速愈合。
74.血管生成和新生血管是真皮再生的关键因素，因为它们可以在伤口愈合过程中提供营养和氧气，为了评估水凝胶敷料在伤口部位的新生血管形成能力，如图8所示，我们对α-平滑肌肌动蛋白(α-sma)进行了免疫荧光染色。与其他三组相比，经hec-sa-ag@cap水凝胶处理的伤口，显示出血管层状网络中有平滑肌细胞显著增加。此外，如图8所示(标尺：500μm)，通过免疫组化分析，hec-sa-ag@cap水凝胶处理的伤口中胶原纤维collagen 1和collagen 3的表达水平明显高于pbs对照组。证实hec-sa-ag@cap水凝胶敷料有利于细胞外成分的调节，促进伤口处的血管再生，进而促进伤口愈合。
75.进一步，对各组大鼠的肝脏和肾脏进行分析，结果如图9显示(标尺：1mm)，经过敷料处理后的大鼠的器官和正常组一样，表明本发明制备的抗菌敷料hec-sa-ag@cap没有深层次的副作用，安全性较高，可推广使用。
76.综合上述，这些实验结果证实了本发明制备的梯度结构抗菌水凝胶hec-sa-ag@cap可以作为治疗细菌感染皮肤伤口的有前途的敷料。
77.以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。