脂肪间充质干细胞联合纳米脂肪的比例混合物制备方法与流程

35分钟；
17.s1.4：将上述水浴消化后的组织悬浮液进行机械分离，经1000转/分钟离心5分钟，弃上清液；
18.s1.5：将弃掉上清液的沉淀用无菌磷酸缓冲液冲洗3次，得到脂肪间充质干细胞。
19.本发明所提供的脂肪间充质干细胞联合纳米脂肪的比例混合物制备方法，还具有这样的特征，所述s1.2中，选用眼科剪刀剪碎剔除结缔组织和小血管的脂肪组织。
20.本发明所提供的脂肪间充质干细胞联合纳米脂肪的比例混合物制备方法，还具有这样的特征，所述s1.3中，所述组织消化液为温和消化液，所述温和消化液为0.1％的i型胶原酶与0.25％胰蛋白酶按1:1组成。
21.本发明所提供的脂肪间充质干细胞联合纳米脂肪的比例混合物制备方法，还具有这样的特征，所述组织消化液与去除红细胞的脂肪组织的体积比为3-5:1。
22.本发明所提供的脂肪间充质干细胞联合纳米脂肪的比例混合物制备方法，还具有这样的特征，所述s2中脂肪间充质干细胞在含血清的dmem培养基中进行培养，观察到贴壁细胞后，更换培养液。
23.本发明所提供的脂肪间充质干细胞联合纳米脂肪的比例混合物制备方法，还具有这样的特征，所述dmem培养基为高糖型dmem培养基。
24.本发明所提供的脂肪间充质干细胞联合纳米脂肪的比例混合物制备方法，还具有这样的特征，所述s3中，选取p3代细胞经流式细胞术鉴定脂肪间充质干细胞表面抗原。
25.本发明所提供的脂肪间充质干细胞联合纳米脂肪的比例混合物制备方法，还具有这样的特征，所述s4包括如下步骤：
26.s4.1：取脂肪组织，经组织液冲洗，置于无菌培养皿中，剔除结缔组织和小血管；
27.s4.2：用无菌注射器搭配孔径为1毫米的纳米脂肪转换器制备适量新鲜纳米脂肪。
28.本发明所提供的脂肪间充质干细胞和纳米脂肪比例混合物的制备方法所制备出的比例混合物，同时具备纳米脂肪中存在的可促进纤维细胞的胶原合成及血管内皮细胞的血管生成的干细胞以及脂肪间充质干细胞所分泌的生物活性因子，脂肪间充质干细胞能够持续不断地激活并滋养皮肤毛囊结构，促使其发生功能改变，能够更好的起到受损皮肤以及受损毛囊的修复作用。
29.本发明所提供的脂肪间充质干细胞和纳米脂肪比例混合物的制备方法所制备出的比例混合物，采用纳米脂肪联合脂肪间充质干细胞真皮层注射的方法以修复受损皮肤，同时纳米脂肪的存在可以支撑脂肪间充质干细胞长期驻留在皮肤注射部分，进而起到毛囊修复作用。
附图说明
30.为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
31.图1为本发明所提供的脂肪间充质干细胞和纳米脂肪比例混合物的制备方法的流程图；
32.图2为本发明实施例所提供的hematoxylin-eosin(he)染色表征不同组间的毛囊
数量和生理情况；
33.图3为本发明实施例中各组毛囊个数统计对比图。
具体实施方式
34.下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
35.应理解的是，文中使用的术语仅出于描述特定示例实施方式的目的，而无意于进行限制。除非上下文另外明确地指出，否则如文中使用的单数形式“一”、“一个”以及“所述”也可以表示包括复数形式。术语“包括”、“包含”、“含有”以及“具有”是包含性的，并且因此指明所陈述的特征、步骤、操作、元件和/或部件的存在，但并不排除存在或者添加一个或多个其它特征、步骤、操作、元件、部件、和/或它们的组合。文中描述的方法步骤、过程、以及操作不解释为必须要求它们以所描述或说明的特定顺序执行，除非明确指出执行顺序。还应当理解，可以使用另外或者替代的步骤。
36.如图1所示，本发明提供了脂肪间充质干细胞联合纳米脂肪的比例混合物制备方法，所述方法包括如下步骤：
37.s1：分离提取脂肪间充质干细胞；
38.s2：培养脂肪间充质干细胞；
39.s3：对s2中培养的脂肪间充质干细胞进行筛选；
40.s4：制备纳米脂肪；
41.s5：混合纳米脂肪和筛选后的脂肪间充质干细胞，得到所需的比例混合物。
42.将上述实施例所制备的比例混合物注射到紫外光老化大鼠背部皮下，对不同区域进行分组，分别分为光老化组(hadsc-uvb)，脂肪移植光老化组(nanofat-uvb)，脂肪干细胞光老化组(hadsc-uvb)，脂肪干细胞联合脂肪移植组(hadsc-nanofat-uvb)以及正常对照组(sham)，对不同分组分别进行组织切片和he染色操作，得到如图2-3所示的结果。
43.从图上可知，相比磷酸缓冲液(pbs)注射组即pbs-uvb组，注射纳米脂肪联合脂肪干细胞组的毛囊的数量和质量明显提高。即本实施例所提供的制备方法所值得的比例混合物可用于修复毛囊。
44.在部分实施例中，所述s1包括：
45.s1.1：取新鲜的脂肪组织，经组织液冲洗，置于无菌培养皿中，剔除结缔组织和小血管；
46.s1.2：打碎上述剔除了结缔组织和小血管的脂肪组织，用磷酸缓冲液冲洗2-3次，去除红细胞；
47.s1.3：在上述去除了红细胞的脂肪组织中加入组织消化液，在37℃水浴内消化20-35分钟；
48.s1.4：将上述水浴消化后的组织悬浮液进行机械分离，经1000转/分钟离心5分钟，弃上清液；
49.s1.5：将弃掉上清液的沉淀用无菌磷酸缓冲液冲洗3次，得到脂肪间充质干细胞。
50.在部分实施例中，所述s1.2中，选用眼科剪刀剪碎剔除结缔组织和小血管的脂肪组织。
51.在部分实施例中，所述s1.3中，所述组织消化液为温和消化液，所述温和消化液为0.1％的i型胶原酶与0.25％胰蛋白酶按1:1组成。该实施例所选择的消化液，避免了过于猛烈的消化组织，以及过于温和以致不能很好的消化组织。
52.在部分实施例中，所述组织消化液与去除红细胞的脂肪组织的体积比为3-5:1。
53.在部分实施例中，所述s2中脂肪间充质干细胞在含血清的dmem培养基中进行培养，观察到贴壁细胞后，更换培养液。用光学显微镜对培养基中所培养的细胞进行观察，所替换的培养基即为未进行细胞培养的含血清的dmem培养基。
54.在部分实施例中，所述dmem培养基为高糖型dmem培养基。
55.在部分实施例中，所述s3中，选取p3代细胞经流式细胞术鉴定脂肪间充质干细胞表面抗原。该实施例选择了流式细胞术来检测细胞表面的表达蛋白，通过荧光照射单个通过通道的细胞来确定在一个细胞群体中表达某个表面蛋白的细胞百分比。
56.在部分实施例中，所述s4包括如下步骤：
57.s4.1：取脂肪组织，经组织液冲洗，置于无菌培养皿中，剔除结缔组织和小血管；
58.s4.2：用无菌注射器搭配孔径为1毫米的纳米脂肪转换器制备适量新鲜纳米脂肪。
59.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。