抗体的纯化方法与流程

1.本发明涉及抗体纯化技术领域，尤其是涉及一种抗体的纯化方法。


背景技术：

2.单克隆抗体药物通常是利用经基因工程改造的能产生目的蛋白的哺乳动物细胞表达，如cho、bhk细胞等。哺乳动物细胞培养过程中添加包含多种成分的培养基以及宿主细胞自身产生的宿主蛋白和核酸等，导致细胞培养产物成分复杂。
3.抗体药物的下游制备工艺主要包括抗体捕获和精制纯化，抗体经捕获后，仍旧含有dna、聚集体和宿主蛋白等多种杂质，一般需再经阴离子交换层析和阳离子交换层析处理。也就是目前的抗体纯化中，至少包括三步层析进行蛋白纯化：(1)使用亲和层析进行单抗捕获，去除大部分的宿主蛋白和dna等杂质；(2)深层过滤后进行阴离子交换层析进一步去除宿主蛋白、dna以及病毒等杂质；(3)阳离子交换层析用于去除多聚体、电荷异构体等杂质。
4.但现有的纯化过程中，步骤较多，成本较高，工艺时间较长，且由于步骤多导致的产品收率较低。
5.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供抗体的纯化方法，以解决现有技术中存在的纯化工艺步骤多、成本高、收率低等技术问题。
7.为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
8.抗体的纯化方法，包括如下步骤：
9.待处理抗体样品进行亲和层析提纯、灭活和深层过滤；
10.所述亲和层析提纯包括：使用平衡缓冲液平衡亲和层析柱后上样，分别采用所述平衡缓冲液、中间冲洗液和第二平衡缓冲液冲洗，然后采用洗脱缓冲液洗脱目标抗体并收集；其中，所述平衡缓冲液为50～55mm tris-hac，150～160mm nacl，ph 7.4
±
0.2；所述第二平衡缓冲液为50～55mm naac-hac，ph 5.5
±
0.2；所述中间冲洗液为下述缓冲液中的至少一种：
11.缓冲液a：50～55mm naac-hac，1～3m尿素，ph 5.0～5.5；
12.缓冲液b：50～55mm naac-hac，0.5％～0.6％triton，ph 5.5～8.0；
13.所述洗脱缓冲液为50～55mm naac-hac，ph 3.5～5.5。
14.本发明的抗体的纯化方法，通过采用一定的亲和层析清洗、洗脱和收集方式，配合一定的深层过滤工艺条件，可显著去除宿主蛋白、dna以及多聚体等杂质，将阴离子交换层析和阳离子交换层析的去除作用在亲和层析和深层过滤步骤实现，通过亲和层析和深层过滤配合，达到与现有技术中亲和层析 深层过滤 阴离子交换 阳离子交换相当的纯化效果，同时简化工艺步骤，降低成本，提高了产品收率。
15.在本发明的具体实施方式中，所述洗脱的方式为梯度洗脱或等度洗脱。进一步的，所述梯度洗脱的程序为：使用梯度洗脱。其中，流动相a可以为50mm naac-hac ph 5.5，流动相b可以为50mm naac-hac ph 3.6，以0％至100％的流动相b进行线性梯度洗脱。
16.在本发明的具体实施方式中，所述收集包括：当采用等度洗脱时，由紫外值为50～100mau/2mm@280nm的洗脱液开始收集至紫外值为50～100mau/2mm@280nm结束收集；当采用梯度洗脱时，由紫外值为50～100mau/2mm@280nm的洗脱液开始收集至紫外值为500～1000mau/2mm@280nm结束收集。
17.在本发明的具体实施方式中，所述亲和层析的填料为mabselect prisma。
18.在本发明的具体实施方式中，在对所述亲和层析柱进行平衡前，还包括对所述亲和层析柱进行消毒。进一步的，所述消毒采用的消毒溶液为0.5～0.6m的naoh水溶液。
19.在本发明的具体实施方式中，所述深层过滤的上样条件为：样品ph为5.0～8.5，电导率为5～15ms/cm。
20.在本发明的具体实施方式中，所述深层过滤的载量为≤2000g/m2。
21.采用上述深层过滤工艺配合前述特定的亲和层析提纯处理，能够极大的降低蛋白残留宿主细胞，可从降低至1～2ppm左右，sec纯度可提高至99％以上，符合最终的质量要求。
22.在本发明的具体实施方式中，所述深层过滤包括：采用平衡缓冲液平衡深层过滤器，然后上样。进一步的，所述平衡缓冲液为50～55mm tris-hac或naac-hac或his-hcl，0～120mm nacl，ph 5～8，电导率为5～15ms/cm，如可以为50～55mm tris-hac，95～100mm nacl，ph 8.1
±
0.2。
23.在实际操作中，在深层过滤中，样品过滤结束后，采用冲洗缓冲液将深层过滤器中的料液置换出。进一步的，所述冲洗缓冲液同所述深层过滤的平衡缓冲液。
24.在本发明的具体实施方式中，所述深层过滤使用x0hc深层过滤膜(millistak hc pod depth filter,x0hc media series)或x0sp深层过滤膜(millistak hc pro pod depth filter,x0sp media series)。
25.在本发明的具体实施方式中，所述灭活为低ph灭活。进一步的，所述低ph灭活包括：采用醋酸缓冲液调节所述亲和层析提纯收集的洗脱液的ph至3.5～3.7，18～26℃条件下孵育60～90min；然后采用tris缓冲液调节ph至5.0～8.5。
26.在本发明的具体实施方式中，所述抗体包括单抗、双抗和融合蛋白中的任一种。
27.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
28.(1)本发明的抗体的纯化方法，通过采用一定的亲和层析清洗、洗脱和收集方式，配合一定的深层过滤工艺条件，可显著去除宿主蛋白、dna以及多聚体等杂质，将阴离子交换层析和阳离子交换层析的去除作用在亲和层析和深层过滤步骤实现，通过亲和层析和深层过滤配合，达到与现有技术中亲和层析 深层过滤 阴离子交换 阳离子交换相当的纯化效果，同时简化工艺步骤，降低成本，提高了产品收率；
29.(2)采用本发明的抗体纯化方法，可使sec纯度达到99％以上，蛋白残留宿主细胞降低至1～2ppm左右，符合最终的质量要求。
附图说明
30.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
31.图1为本发明实施例提供的抗体纯化的流程示意图；
32.图2为本发明实施例提供的亲和层析提纯的流程示意图。
具体实施方式
33.下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
34.抗体的纯化方法，具体参考图1所示的抗体纯化的流程示意图，包括如下步骤：
35.待处理抗体样品进行亲和层析提纯、灭活和深层过滤；
36.所述亲和层析提纯包括：使用平衡缓冲液平衡亲和层析柱后上样，分别采用所述平衡缓冲液、中间冲洗液和第二平衡缓冲液冲洗，然后采用洗脱缓冲液洗脱目标抗体并收集；其中，所述平衡缓冲液为50～55mm tris-hac，150～160mm nacl，ph 7.4
±
0.2；所述第二平衡缓冲液为50～55mm naac-hac，ph 5.5
±
0.2；所述中间冲洗液为下述缓冲液中的至少一种：
37.缓冲液a：50～55mm naac-hac，1～3m尿素，ph 5.0～5.5；
38.缓冲液b：50～55mm naac-hac，0.5％～0.6％triton，ph 5.5～8.0；
39.所述洗脱缓冲液为50～55mm naac-hac，ph 3.5～5.5。
40.本发明的抗体的纯化方法，通过采用一定的亲和层析清洗、洗脱和收集方式，配合一定的深层过滤工艺条件，可显著去除宿主蛋白、dna以及多聚体等杂质，将阴离子交换层析和阳离子交换层析的去除作用在亲和层析和深层过滤步骤实现，通过亲和层析和深层过滤配合，达到与现有技术中亲和层析 深层过滤 阴离子交换 阳离子交换相当的纯化效果，同时简化工艺步骤，降低成本，提高了产品收率。
41.本发明的抗体纯化方法，不包括深层过滤后的阴离子交换层析和阳离子交换层析。
42.在实际操作中，根据上样样品中宿主蛋白残量调节中间冲洗液；根据蛋白质量调节洗脱缓冲液的ph去除多聚体。具体的，在去除宿主蛋白残量中，当使用缓冲液a的体系时，可以将把中间冲洗液的ph调节成5.0～5.5范围内较低的ph值(如5.0～5.2)，或使用1～3m范围内较高的尿素的浓度(如2.5～3m)；当使用缓冲液b的体系时，调节中间冲洗液ph在5.5～8范围内的较高的ph值(如7～8)，可以去除更多的宿主蛋白残量。在洗脱阶段，等度洗脱使用越高的洗脱ph值(如3.8～4.1)，去除的聚体更多；或使用梯度洗脱(流动相a为50mm naac-hac ph 5.5，流动相b为50mm naac-hac ph 3.6，以0％至100％的流动相b进行线性梯
度洗脱)，在洗脱蛋白紫外峰进行更严苛的收集条件(500～1000mau/2mm)也可以去除多聚体。
43.如在不同实施方式中，所述缓冲液a中，尿素的浓度可以为1m、1.2m、1.4m、1.5m、1.6m、1.8m、2m、2.2m、2.4m、2.5m、2.6m、2.8m、3m等等；所述缓冲液b中，triton的质量/体积分数可以为0.5％、0.52％、0.54％、0.55％、0.56％、0.58％、0.6％等等。
44.采用本发明的冲洗方式，能够进一步提高在亲和层析的冲洗阶段对宿主蛋白等的去除率；采用本发明的洗脱方式，能够进一步改善对多聚体的去除率。
45.如在不同实施方式中，所述平衡缓冲液可以为50mm tris-hac，150mm nacl，ph 7.4；所述缓冲液a可以为50mm naac-hac，0.2～1m nacl，ph 5.5；所述缓冲液b可以为50mm naac-hac，1～3m尿素，ph 5.0～5.5；所述缓冲液c可以为50mm naac-hac，0.5％triton，ph 5.5～8.0；所述洗脱液可以为50mm naac-hac，ph 3.5～5.5。
46.在本发明的具体实施方式中，所述洗脱的方式为梯度洗脱或等度洗脱。进一步的，所述梯度洗脱的程序为：使用梯度洗脱。其中，流动相a可以为50mm naac-hac ph 5.5，流动相b可以为50mm naac-hac ph 3.6，以0％至100％的流动相b进行线性梯度洗脱。
47.在本发明的具体实施方式中，所述收集包括：当采用等度洗脱时，由紫外值为50～100mau/2mm@280nm的洗脱液开始收集至紫外值为50～100mau/2mm@280nm结束收集；当采用梯度洗脱时，由紫外值为50～100mau/2mm@280nm的洗脱液开始收集至紫外值为500～1000mau/2mm@280nm结束收集。其中，@280nm是指洗脱液在280nm波长下的紫外值。在等度洗脱时，当洗脱液在280nm的紫外值达到50～100mau/2mm时开始收集，随着洗脱进行洗脱液紫外值变化，洗脱液在280nm的紫外值重新变回50～100mau/2mm时停止收集。
48.采用上述梯度洗脱和收集方式，能够进一步优化对多聚体的去除，提高产品纯度。
49.在本发明的具体实施方式中，所述亲和层析的填料为mabselect prisma。
50.在本发明的具体实施方式中，在对所述亲和层析柱进行平衡前，还包括对所述亲和层析柱进行消毒。进一步的，所述消毒采用的消毒溶液为0.5～0.6m的naoh水溶液，如0.5m的naoh水溶液。
51.所述亲和层析提纯的工艺流程可参考图2，对所述亲和层析柱进行消毒处理，然后进行平衡，再进行上样，然后采用所述平衡缓冲液进行冲洗1，再采用中间缓冲液进行冲洗2，再采用平衡缓冲液进行冲洗3，然后进行洗脱；洗脱完成后，采用消毒溶液对所述亲和层析柱进行消毒处理，然后冲洗后保存。
52.在本发明的具体实施方式中，所述深层过滤的上样条件为：样品ph为5.0～8.5，电导率为5～15ms/cm。
53.如在不同实施方式中，所述深层过滤的上样条件中，样品的ph可以为5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5等等；样品的电导率可以为5ms/cm、6ms/cm、7ms/cm、8ms/cm、9ms/cm、10ms/cm、11ms/cm、12ms/cm、13ms/cm、14ms/cm、15ms/cm等等。
54.在本发明的具体实施方式中，所述深层过滤的载量为≤2000g/m2。根据蛋白质量调节上样载量，上样载量越低，去除的聚体、宿主细胞残量以及核酸残量越高。
55.采用上述深层过滤工艺配合前述特定的亲和层析提纯处理，能够极大的降低蛋白残留宿主细胞，可从降低至1～2ppm左右，sec纯度可提高至99％以上，符合最终的质量要求。
56.在本发明的具体实施方式中，所述深层过滤包括：采用平衡缓冲液平衡深层过滤器，然后上样。进一步的，所述平衡缓冲液为50～55mm tris-hac或naac-hac或his-hcl，0～120mm nacl，ph 5～8。
57.如在不同实施方式中，所述深层过滤中，所述平衡缓冲液可以为50mm naac-hac，ph为5.0、5.5、5.8等等；或者可以为50mm his-hcl，ph为5.5、6.0、6.5等等；或者可以为50mm tris-hac，ph为7.0、7.5、8.0等等。nacl浓度可以为0至120mm。
58.在实际操作中，在深层过滤中，样品过滤结束后，采用冲洗缓冲液将深层过滤器中的料液置换出。进一步的，所述冲洗缓冲液同所述深层过滤的平衡缓冲液。
59.在本发明的具体实施方式中，所述深层过滤使用x0hc深层过滤膜或x0sp深层过滤膜。
60.在本发明的具体实施方式中，所述灭活为低ph灭活。进一步的，所述低ph灭活包括：采用醋酸缓冲液调节所述亲和层析提纯收集的洗脱液的ph至3.5～3.7，18～26℃条件下孵育60～90min；然后采用tris缓冲液调节ph至5.0～8.5。
61.在本发明的具体实施方式中，所述抗体包括单抗、双抗和融合蛋白中的任一种。
62.实施例1
63.(1)采用3～4cv的0.5m的naoh水溶液对亲和层析柱(填料为mabselect prisma，层析柱规格为0.66
×
20cm、体积6.8ml)进行消毒，然后采用5～6cv的50mm tris-hac，150mm nacl，ph 7.4的平衡缓冲液对亲和层析柱进行平衡；将样品上样至亲和层析柱，上样载量≤57g/l；其中样品为细胞收获液上清，来源于灌流培养的中国仓鼠卵巢(cho)细胞。
64.(2)用3～4cv的50mm tris-hac，150mm nacl，ph 7.4的平衡缓冲液冲洗亲和层析柱，再用3～4cv的50mm naac-hac，3m尿素，ph 5.3的中间冲洗液冲洗亲和层析柱，再用3～4cv的50mm naac-hac，ph 5.5的平衡缓冲液冲洗亲和层析柱；然后以流动相a为50mm naac-hac，ph 5.5、流动相b为50mm naac-hac，ph 3.6，采用10cv从0％至100％流动相b进行线性梯度洗脱。当洗脱液在280nm波长下的紫外值达到100mau/2mm开始收集，达到500mau/2mm停止收集。
65.(3)将步骤(2)得到的洗脱液进行低ph灭活；具体的，采用醋酸缓冲液调节所述亲和层析提纯收集的洗脱液的ph至3.5～3.7，18～26℃条件下孵育60～90min；然后采用tris缓冲液调节ph至8.1。
66.(4)将步骤(3)低ph灭活处理后的样品进行深层过滤，具体的步骤为：深层过滤器x0hc用水以≥100l/m2润洗后，再用50～55mm tris-hac，95～100mm nacl，ph 8.1
±
0.1的缓冲液平衡20～30l/m2。过滤样品时，控制压力≤2bar，最大载量定为2000g/m2。上样结束后，用20～25l/m2的50～55mm tris-hac，95mm nacl，ph 8.1
±
0.1的缓冲液冲洗并收获滤出液。
67.实施例2
68.(1)采用3～4cv的0.5m的naoh水溶液对亲和层析柱(填料为mabselect prisma，层析柱规格为0.66
×
20cm、体积6.8ml)进行消毒，然后采用5～6cv的50mm tris-hac，150mm nacl，ph 7.4的平衡缓冲液对亲和层析柱进行平衡；将样品上样至亲和层析柱，上样载量≤57g/l；其中样品为细胞收获液上清，来源于灌流培养的中国仓鼠卵巢(cho)细胞。
69.(2)用3～4cv的50mm tris-hac，150mm nacl，ph 7.4的平衡缓冲液冲洗亲和层析
柱，再用3～4cv的50mm naac-hac，0.5％triton，ph 8.0的中间冲洗液冲洗亲和层析柱，再用3～4cv的50mm naac-hac，ph 5.5的平衡缓冲液冲洗亲和层析柱；然后采用5cv的50mm naac-hac，ph 4.1的洗脱缓冲液进行等度洗脱，当洗脱液在280nm波长下紫外值为100mau/2mm时开始收集，直至洗脱液在280nm波长下紫外值重新变回100mau/2mm停止收集。
70.(3)将步骤(2)得到的洗脱液进行低ph灭活；具体的，采用醋酸缓冲液调节所述亲和层析提纯收集的洗脱液的ph至3.5～3.7，18～26℃条件下孵育60～90min；然后采用tris缓冲液调节ph至5.5
±
0.2。
71.(4)将步骤(3)低ph灭活处理后的样品进行深层过滤，具体的步骤为：深层过滤器x0sp用水以≥100l/m2润洗后，再用50～55mm naac-hac，ph 5.5
±
0.1的缓冲液平衡20～30l/m2。过滤样品时，控制压力≤2bar，最大载量定为1000～2000g/m2。上样结束后，用20～25l/m2的50～55mm naac-hac，ph 5.5
±
0.1的缓冲液冲洗并收获滤出液。
72.比较例1
73.比较例1提供了常规抗体的纯化方法，包括如下步骤：
74.(1)采用3～4cv的0.5m的naoh水溶液对亲和层析柱(填料为mabselect prisma，层析柱规格为0.66
×
20cm、体积6.8ml)进行消毒，然后采用5～6cv的50mm tris-hac，150mm nacl，ph 7.4的平衡缓冲液对亲和层析柱进行平衡；将样品上样至亲和层析柱，上样载量≤57g/l；其中样品为细胞收获液上清，来源于灌流培养的中国仓鼠卵巢(cho)细胞。
75.(2)用3～4cv的50mm tris-hac，150mm nacl，ph 7.4的平衡缓冲液冲洗亲和层析柱，再用3～4cv的50mm naac-hac，1m nacl，ph 5.5的中间冲洗液冲洗亲和层析柱，再用3～4cv的50mm naac-hac，ph 5.5的平衡缓冲液冲洗亲和层析柱；然后采用5cv的50mm naac-hac，ph 3.6的洗脱缓冲液进行等度洗脱，当洗脱液在280nm波长下紫外值为100mau/2mm时开始收集，直至洗脱液在280nm波长下紫外值重新变回100mau/2mm停止收集。
76.(3)将步骤(2)得到的洗脱液进行低ph灭活；具体的，采用醋酸缓冲液调节所述亲和层析提纯收集的洗脱液的ph至3.5～3.7，18～26℃条件下孵育60～90min；然后采用tris缓冲液调节ph至8.1
±
0.2。
77.(4)将步骤(3)低ph灭活处理后的样品进行深层过滤，具体的步骤为：深层过滤器a1hc用水以≥100l/m2润洗后，再用50～55mm tris-hac，95～100mm nacl，ph 8.1
±
0.1的缓冲液平衡20～30l/m2。过滤样品时，控制压力≤2bar，最大载量定为≤2000g/m2。上样结束后，用20～25l/m2的50mm tris-hac，95mm nacl，ph 8.1
±
0.1的缓冲液冲洗并收获滤出液。
78.比较例2
79.比较例2参考比较例1，区别在于：步骤(2)中，中间清洗液为50mm naac-hac，3m尿素，ph 5.3。
80.比较例3
81.比较例3参考比较例1，区别在于：步骤(4)将深层过滤器a1hc替换为x0hc。
82.比较例4
83.比较例4参考比较例1的常规亲和层析、病毒灭活和深层过滤步骤。
84.过滤后的样品以常规的流穿模式阴离子交换层析纯化，步骤为：以50mm tris-hac，ph 7.5
±
0.1缓冲液平衡3cv，上样载量200～400g/l，以50mm tris-hac，ph 7.5
±
0.1缓冲液冲洗3cv，在上样和冲洗阶段，当流穿液在280nm波长下紫外值为100时开始收集，直
至流穿液在280nm波长下紫外值重新变回100mau/2mm停止收集。
85.阴离子层析后的流穿液常规的结合模式阳离子交换层析纯化，步骤为：以50mm naac-hac，ph 5.5
±
0.1缓冲液平衡3cv，上样载量30～50g/l，以50mm naac-hac，ph 5.5
±
0.1缓冲液冲洗3cv，洗脱缓冲液为50mm naac-hac ph 5.5
±
0.1，0.3m nacl，当洗脱液在280nm波长下紫外值为100mau/2mm时开始收集，直至洗脱液在280nm波长下紫外值重新变回100mau/2mm停止收集。
86.实验例1
87.为了对比说明不同实施例和比较例的抗体纯化方法的差别，对不同实施例和比较例处理得到的产品进行测试，测试结果见表1。
88.表1不同实施例和比较例产品的测试结果
[0089][0090][0091]
从上述测试结果可知，本发明的抗体的纯化方法，通过采用一定的亲和层析清洗、
洗脱和收集方式，配合一定的深层过滤工艺条件，可显著去除宿主蛋白、dna以及多聚体等杂质，将阴离子交换层析和阳离子交换层析的去除作用在亲和层析和深层过滤步骤实现，通过亲和层析和深层过滤配合，达到与现有技术中亲和层析 深层过滤 阴离子交换 阳离子交换相当的纯化效果，同时简化工艺步骤，降低成本，提高了产品收率。
[0092]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。