一种从甘蔗渣中提取木质素和甘油糖苷的方法与流程

1.本发明属于甘蔗渣预处理技术领域，具体涉及从甘蔗渣的酸化甘油预处理液分离提取木质素和甘油糖苷的方法。


背景技术：

2.在制糖工业中每生产1吨蔗糖就会对应的产生2-3吨的废弃甘蔗渣。目前，全球的甘蔗渣年产量约为2亿吨，我国作为仅次于巴西和印度的第三大甘蔗种植国，每年大约会生2000万吨的甘蔗渣作为甘蔗制糖工业的下脚料，甘蔗渣主要成分为木质纤维素，通常在清洗和提取甘蔗汁后产生。甘蔗渣由近32-45％的纤维素、20-32％的半纤维素、17-32％的木质素、1.0-9.0％的灰分和一些其他成分组成。约70％-80％的甘蔗渣被当作燃料进行燃烧或直接废弃，不仅造成了资源的浪费，而且对生态环境也造成了严重的破坏。若能对甘蔗渣中丰富的纤维素、半纤维素和木质素等物质进行高效利用，将会大大的缓解环境污染，促进经济的发展。
3.酸化甘油预处理是一种能够有效提高蔗渣纤维素利用率的方法，此方法能够打破甘蔗渣原料分子间及分子内β-酯键、氢键等化学键和功能性基团，增加了基质中无定型纤维素含量，能显著提高葡聚糖酶对纤维素的消化率，同时也能产生如木质素等潜在的活性物质。木质素是仅次于纤维素的第二大天然高分子，也是自然界中唯一能提供可再生芳香族化合物的非石油资源。在甘蔗渣进行酸化甘油预处理后这种天然有机物不仅没有得到有效利用，还造成了严重的污染；与此同时，在预处理过程中有半纤维素的分解物质与甘油反应而形成的甘油糖苷产生。因此，对蔗渣酸化甘油预处理液中木质素和甘油糖苷的分离提取和结构研究显得尤为重要。但是目前对于甘蔗渣的酸化甘油预处理过程所产生的木质素和甘油糖苷的研究是不够充分，少有对它们分离提取的具体方法。


技术实现要素：

4.为了解决上述技术问题，本发明目的是提出一种从甘蔗渣的酸化甘油预处理液中高效提取木质素和甘油糖苷的方法，通过优化后的方法，利用四氢呋喃萃取预处理液原料中木质素，从而得到水不溶木质素和水可溶性的木质素，再对水相进行柱层析分离得到甘油糖苷，有效提高木质素的利用度和应用范围。
5.为了实现上述技术目的，本发明采用以下技术方案：
6.一种从甘蔗渣中提取木质素和甘油糖苷的方法，将甘蔗渣的酸化甘油预处理液以四氢呋喃萃取，得到含有混合木质素的四氢呋喃相和含有甘油糖苷的水相，将四氢呋喃相旋蒸、水洗离心分离，得到水不溶木质素的沉淀和含有水溶性木质素及甘油的上清液，再将上清液进行四氢呋喃萃取，去除甘油，最终得到水溶性木质素；将水相进行活性炭柱层析得到甘油糖苷。
7.优选的，上述提取方法具体包括如下步骤：
8.(1)向甘蔗渣的酸化甘油预处理液中加入四氢呋喃，混匀后向溶液中加入硫酸钠，
使四氢呋喃相和水相分离，得到上相含有木质素的四氢呋喃相和下相含有甘油糖苷的水相；
9.(2)将步骤(1)中的四氢呋喃相进行旋蒸，去除四氢呋喃，得到含有木质素和甘油的混合物，向混合物中加水洗涤，离心得到水不溶性木质素沉淀和含有水溶性木质素和甘油的上清液；
10.(3)将步骤(2)中的上清液中加四氢呋喃，进行萃取去除甘油，将得到的四氢呋喃相旋蒸除去四氢呋喃后浓缩，将得到的浓缩液与步骤(2)中离心得到的水不溶性木质素沉淀冷冻干燥得到水溶性木质素和水不溶性木质素；
11.(4)将步骤(1)中的水相，进行旋蒸浓缩，使用活性炭-硅藻土(1:1，w/w)层析柱对浓缩液进行分离纯化，通过水和乙醇的两步洗脱，收集乙醇相的洗脱液，浓缩冻干得到甘油糖苷。
12.优选地，步骤(1)四氢呋喃与预处理液的体积比为1:5-1:1；所述硫酸钠的用量为10-40g/100ml溶液。其中，硫酸钠能够破坏四氢呋喃与预处理液形成的体系，使体系分层。
13.优选地，步骤(2)中加水洗涤次数为2-5次；所述加水量10-40ml；所述离心转速为5000-10000rpm，离心时间为5-15min。
14.优选地，步骤(3)中所述的四氢呋喃与步骤(2)中得到的上清液的体积比为1:2-1:8；所述的萃取时长为5-30min；所述萃取次数为2-5次。
15.优选地，步骤(2)中四氢呋喃相的旋蒸温度为35
±
5℃；步骤(3)中四氢呋喃相的旋蒸温度为35
±
5℃，所述浓缩采用旋蒸浓缩，旋蒸温度为60
±
10℃。
16.优选地，步骤(3)中冷冻干燥时间为48
±
12h，冷冻温度为-40
±
10℃，真空度为1
±
0.5mbar。
17.优选地，步骤(4)中活性炭和硅藻土的质量比为1：1，洗脱速率为0.5-3ml/min，所述两步洗脱，第一步洗脱使用水，用量为2-5倍床层体积，第二步洗脱使用2
±
1％乙醇溶液，用量为2-5倍床层体积。
18.优选的，步骤(4)中甘油糖苷的上样量和床层体积比为1：20-1：5。
19.优选地，所述甘蔗渣的酸化甘油预处理液是甘蔗渣与酸化甘油反应后加入水，混匀后抽滤后得到。
20.优选地，所述甘蔗渣与酸化甘油的质量比为1：1-10，反应条件为150-200℃条件下反应20-40min；所述酸化甘油包括甘油60-99％、浓硫酸0.1％-1％、水1-40％。
21.由上述方法分离提取得到了水不溶木质素和水溶性木质素以及甘油糖苷。所得水不溶木质素有较好的抗氧化活性和更为集中的分子量分布；水溶木质素有较好的抗氧化活性和水溶性，较低的生物毒性；甘油糖苷有着良好的保湿性。
22.本发明将有机溶剂四氢呋喃应用于甘蔗渣的酸化甘油预处理液中木质素和甘油糖苷的分离提取中，根据木质素的极性以及溶解性，萃取预处理液体系中的木质素，在水相中留下甘油糖苷，使用方法条件较为温和，能从甘蔗渣预处理过程产生的副产物中提取木质素和甘油糖苷，具体实施结果表明，经过四氢呋喃萃取，水溶性木质素和水不溶性木质素的提取率分别为38.00％和49.63％，甘油糖苷的产率为68.17％。通过木质素结构的hsqc与31p核磁共振谱及红外光谱分析结果表明，预处理后所得木质素具有h、g、s特征峰，属于典型的木质素结构，其中水溶性木质素的脂肪族羟基含量高于传统的碱提取木质素，说明在
甘油的修饰下，使得甘蔗渣中的部分木质素获得良好的水溶性；通过gpc凝胶渗透色谱分析，结果显示通过本发明分离提取得到的水不溶木质素的分子量更大且较为集中，而水溶性木质素的分子量较小单分布更广。通过对甘油糖苷进行液相色谱分析，结果如图8，经过柱层析，甘油含量下降至2.38％，有两个未知物的峰。通过液质联用分析，如图9所示，253m/z的离子碎片为[m-h]-，而179m/z的离子碎片为[m-h-c3h6o2]-，是未知物
②
脱去甘油残基碎片得到葡萄糖残基，根据与甘油葡萄糖苷标品对比，判断未知物
②
为甘油葡萄糖苷；未知物
①
的质谱图如图10所示，223m/z的离子碎片为[m-h]-，而149m/z的离子碎片为[m-h-c3h6o2]-是未知物
①
脱去甘油残基碎片得到残基，判断其为甘油木糖苷。甘油糖苷中主要含有甘油木糖苷和甘油葡萄糖苷，含量分别为56.44％和36.49％。
[0023]
本发明的实施结果充分证明，所述基于四氢呋喃萃取和活性炭柱层析的木质素与甘油糖苷分离提取方法能够有效从蔗渣处理的副产品中提取木质素和甘油糖苷，有利于后期的高值转化，得到的木质素有良好的抗氧化活性，且提取的一部分木质素具有良好的水溶性和低生物毒性，能够增加其应用的前景；通过柱层析洗脱能够高效分离提取甘油糖，得到的甘油糖苷的保湿活性优于常用保湿剂透明质酸。另外，本发明中所用四氢呋喃和活性炭层析柱成本较低，可循环使用，有效降低了提取成本，据此提供了一种既有效、又廉价的从甘蔗渣的酸化甘油预处理液中分离提取木质素和甘油糖苷的方法。
附图说明
[0024]
图1为实施例2-11水溶性木质素的甘油去除率图，图1a为实施例2-5，图1b为实施例2、6、7、8，图1c为实施例2、9、10、11。
[0025]
图2为分离提取得到的两种木质素与传统碱提法得到的木质素的傅里叶红外光谱图。
[0026]
图3为木质素的hsqc核磁谱图；(a)(b)(c)分别为nwl(水不溶木质素)、wl(水溶性木质素)和碱木质素侧链连接区图；(d)(e)(f)分别为nwl、wl和碱木质素芳香环区图。
[0027]
图4为分离提取得到的两种木质素与传统碱提法得到的dpph自由基清楚能力图。
[0028]
图5分离提取得到的水溶性木质素的生物毒性图，左图为对hacat细胞的毒性，右图为对hepg2细胞的毒性。
[0029]
图6为分离提取得到的甘油糖苷与传统保湿剂透明质酸的吸湿效果图，图a为相对湿度43％环境下结果，图b为相对湿度81％环境下结果。
[0030]
图7为分离提取得到的甘油糖苷与传统保湿剂透明质酸的保湿效果图，图a为对湿度43％环境下结果，图b为干燥硅胶环境下实验结果。
[0031]
图8为实施例2中甘油糖苷的液相色谱图，其中有两个未知物
①
和
②
。
[0032]
图9为图8中未知物
②
的一级质谱图(a)和二级质谱图(b)。
[0033]
图10为图8中未知物
①
的一级质谱图(a)和二级质谱图(b)。
具体实施方式
[0034]
下面结合实施例对本发明进行具体地描述，但本发明的实施方式和保护范围不限于以下实施例。
[0035]
甘蔗渣的酸化甘油预处理液的制备：将甘蔗渣(1-0.5mm)与酸化甘油以1：6的比例
在170℃条件下反应30min后加入与酸化甘油等质量的水，混匀后抽滤得到。所述的酸化甘油是由95％甘油、0.5％浓硫酸和4.5％水混合而成。
[0036]
实施例1
[0037]
称取四氢呋喃10g加入甘蔗渣的酸化甘油预处理液40g，四氢呋喃与预处理液比例为1：4，于30℃水浴搅拌30min，使其充分混合至溶液澄清；称取10g的硫酸钠，加入上述有机相与水相的混合溶液，继续在30℃水浴搅拌30min至硫酸钠充分溶解，再将溶液转移至分液漏斗静置1h，硫酸钠的加入会破坏溶液体系，在分液漏斗中得到四氢呋喃相和水相分离状态，通过分液漏斗分离得到上相的为含有木质素和少量甘油的四氢呋喃相，下相为含有含甘油木糖苷和甘油的水相。在35℃下对四氢呋喃相进行旋蒸，去除四氢呋喃，得到含有木质素和少量甘油的混合物，向混合物中加入蒸馏水30ml进行洗涤，离心机转速为9000rpm离心10min，分别收集上清和沉淀，重复2次，得到水不溶性木质素沉淀和含有水溶性木质素和甘油的上清液；向上清液中加入30ml的四氢呋喃，有机相(四氢呋喃)与水相(上清液)体积比为1:2，磁力搅拌30min，10g硫酸钠破坏结构分层，收集上相的四氢呋喃，35℃旋蒸除去四氢呋喃后加水重溶，重复2次萃取过程以去除上清液中甘油，最后60℃旋蒸浓缩，冻干得到可溶性木质素样品；将预处理液经过萃取后剩下的水相进行60℃旋蒸浓缩，过滤除去析出的硫酸钠晶体，使用活性炭:硅藻土(1:1，w/w)的层析柱对样品进行分离纯化，床层高度为55cm，内径为2.4cm，床层体积约为250ml，上样量为25ml，洗脱速度为1ml/min。进行2步洗脱：用500ml去离子水进行第1步洗脱；用500ml的2％乙醇进行第2步洗脱，收集2％乙醇洗脱相，浓缩并冻干得到甘油糖苷。
[0038]
实施例2
[0039]
称取四氢呋喃20g加入甘蔗渣的酸化甘油预处理液40g，四氢呋喃与预处理液比例为1:2，于30℃水浴搅拌30min，使其充分混合至溶液澄清；称取20g的硫酸钠，加入上述有机相与水相的混合溶液，继续在30℃水浴搅拌30min至硫酸钠充分溶解，再将溶液转移至分液漏斗静置1h，硫酸钠的加入会破坏溶液体系，在分液漏斗中得到四氢呋喃相和水相分离状态，通过分液漏斗分离得到上相的为含有木质素和少量甘油的四氢呋喃相，下相为含有含甘油木糖苷和甘油的水相。在35℃下对四氢呋喃相进行旋蒸，去除四氢呋喃，得到含有木质素和少量甘油的混合物，向混合物中加入蒸馏水30ml进行洗涤，离心机转速为9000rpm离心10min，分别收集上清和沉淀，重复4次，得到水不溶性木质素沉淀和含有水溶性木质素和甘油的上清液；向上清液中加入30ml的四氢呋喃，有机相与水相体积比为1:4，磁力搅拌萃取5min，加入20g硫酸钠破坏结构分层，收集上相的四氢呋喃，35℃旋蒸除去四氢呋喃后加水重溶，重复4次萃取过程以去除上清液中甘油，60℃旋蒸浓缩，冻干得到可溶性木质素样品。将预处理液经过萃取后剩下的水相进行60℃旋蒸浓缩，过滤除去析出的硫酸钠晶体，使用活性炭:硅藻土(1:1，w/w)的层析柱对样品进行分离纯化，床层高度为55cm，内径为2.4cm，床层体积约为250ml，上样量为25ml，洗脱速度为1ml/min。进行2步洗脱：用800ml去离子水进行第1步洗脱；用800ml的2％乙醇进行第2步洗脱，收集2％乙醇洗脱相，浓缩并冻干得到甘油糖苷。
[0040]
测得上述实施例1和2提取的木质素产率分别为：水不溶性木质素38.76％和49.63％，水溶性木质素31.47％和38.00％，按公式(1)计算。
[0041][0042]
测得上述实施例1和2分离得到的甘油糖苷产率分别为45.21％和68.17％，按公式(2)计算。
[0043][0044]
实施例2中木质素经过红外和核磁表征显示其有着明显的木质素结构，说明上述提取方法能够从甘蔗渣酸化甘油预处理水解液中得到木质素。
[0045]
实施例3
[0046]
调整四氢呋喃与上清液的体积比为1:1，其他操作均与实施例2相同，提取得到水溶性木质素和水不溶性木质素。
[0047]
实施例4
[0048]
调整四氢呋喃与上清液的体积比为1:2，其他操作均与实施例2相同，提取得到水溶性木质素和水不溶性木质素。
[0049]
实施例5
[0050]
调整四氢呋喃与上清液的体积比为1:8，其他操作均与实施例2相同，提取得到水溶性木质素和水不溶性木质素。
[0051]
实施例6
[0052]
调整上清液加入四氢呋喃后的萃取搅拌时间为10min，其他操作均与实施例2相同，提取得到水溶性木质素和水不溶性木质素。
[0053]
实施例7
[0054]
调整上清液加入四氢呋喃后的萃取搅拌时间为20min，其他操作均与实施例2相同，提取得到水溶性木质素和水不溶性木质素。
[0055]
实施例8
[0056]
调整上清液加入四氢呋喃后的萃取搅拌时间为30min，其他操作均与实施例2相同，提取得到水溶性木质素和水不溶性木质素。
[0057]
实施例9
[0058]
调整上清液加入四氢呋喃的萃取次数为2次，其他操作均与实施例2相同，提取得到水溶性木质素和水不溶性木质素。
[0059]
实施例10
[0060]
调整上清液加入四氢呋喃的萃取次数为3次，其他操作均与实施例2相同，提取得到水溶性木质素和水不溶性木质素。
[0061]
实施例11
[0062]
调整上清液加入四氢呋喃的萃取次数为5次，其他操作均与实施例2相同，提取得到水溶性木质素和水不溶性木质素。
[0063]
甘油去除率测定
[0064]
通过高效液相色谱(hplc)外标法测定甘油的浓度。液相条件为柱温35℃，示差检测器温度40℃，进样量10μl，流速1ml/min，洗脱时间30min。最后按照公式(2)计算甘油的去除率。
[0065][0066]
数据结果如图1所示，甘油的去除率随着四氢呋喃比例的减小而持续增加，这可能是因为四氢呋喃对可溶性木质素萃取过程中，溶液中的少量甘油也会按照一定比例进入四氢呋喃相中，而随着四氢呋喃的比例下降，进入其中的甘油也在减少，因此甘油的去除率得以增加。当体积比达到1:4时，甘油去除率为99.23％，经过显著性差异分析，体积比1:4与1:8的甘油去除率并无显著性差异，但在体积比为1:8时，水溶性木质素的得率比1:4时有所下降。因此，体积比为1:4为优选比例。萃取次数对对甘油去除率的影响见图1。甘油去除率随着萃取次数的增加而增加，当萃取次数达到4次后，甘油去除率增加很少，无显著性差异，这可能是因为样品中甘油含量已经较少，再次萃取对甘油去除率几乎没有影响或影响较小。萃取时间对甘油去除率的影响如图1所示。在5-30min范围的实验中，甘油去除率均到达99％以上，且各时间差异不明显。
[0067]
红外光谱表征
[0068]
为了比较本方法提取得到的木质素与传统碱提法得到的木质素的化学结构和官能团信息，通过傅里叶红外光谱仪进行表征分析，如图2所示。
[0069]
木质素中各官能团的特征吸收峰主要集中在l800-900cm-1
的指纹区，本方法得到的两种木质素与传统碱木质素有较为明显的差异，1712cm-1
的谱带归因于非共轭羰基，1633cm-1
的峰可能为共轭羰基所产生，两种木质素在这个位置的峰的差别可能与其溶解性有关。1602cm-1
、1510cm-1
的峰为苯环c＝c骨架的振动，1460cm-1
峰为甲基和亚甲基的c-h弯曲振动，而在水溶性木质素中此位置的峰较为明显，可能与甘油的修饰有关。1415cm-1
的峰可能与c-h的形变有关。1329cm-1
的c-o伸缩振动，980cm-1
的ch＝ch伸缩振动都与紫丁香基单元有关，两种用此方法得到的木质素的紫丁香基相关峰的强度都小于碱木质素，这可能是在预处理过程中木质素断键导致的。1125cm-1
的c-h峰、1266cm-1
的c＝o与愈创木基有关，通过本方法得到的木质素在此区域有峰显示，1042cm-1
的峰也愈创木基相关但水溶性木质素的信号不强，可能是由于预处理过程中断键引起。836cm-1
的峰与对-羟基苯基有关，水溶性木质素与碱木质素都有较强的信号，而水不溶木质素信号略弱。
[0070]
核磁共振谱表征
[0071]
利用二维hsqc-nmr谱图可以分析了木质素样品的结构。如图3所示。在脂肪区，β-o-4、β-5和β-β单元间连接信号占主导地位，78.8/4.32ppm的信号表示甘油被接枝到β-o-4键的α位置上；62.6/3.35、65.3/4.05和69.3/3.70ppm处的新信号可能与酸性条件下羟基肉桂酸与甘油的γ-酯化反应有关。甘油预处理后，β-5和β-β键的信号减弱，这可能是由于甘油与γ-酰化基团的反应以及β-5和β-β键的化学位移发生了变化；在芳香区，紫丁香基和愈创木脂基单元的芳香环以及不饱和羟基肉桂酸侧链所对应的信号占主导地位，甘油预处理的紫丁香基结构信号强度小于碱木质素，羟苯基含量增加，可能是由于预处理断键所导致，这与红外结果相一致。
[0072]
羟基的类型和丰度是木质素的重要特征，它影响木质素的溶解度、亲疏水性，使用31p nmr对木质素的羟基进行分析。如表1所示，水溶性木质素和水不溶木质素中脂肪族羟基含量高于碱木质素。31p-nmr的分析结果与hsqc-nmr的分析结果相似，因为甘油整合到木质素结构中会导致脂肪族羟基的增加。这一增加将促进木质素在极性溶剂中的溶解。
[0073]
表1木质素的31p-nmr测得木质素羟基的含量
[0074][0075][0076]
木质素分子量的测定
[0077]
本方法得到的两种木质素的分子量如表2所示，水不溶木质素的重均分子量(mw)和数均分子量(mn)均大于水溶性木质素，而其多分散系数较小，说明其分子量的分布较为集中，均一性更高，但水溶性木质素更小的分子量可能是由于其在预处理过程中的降解，也是其能溶于水的原因之一。
[0078]
表2木质素的分子量对比
[0079][0080]
抗氧化活性
[0081]
通过dpph自由基清除率来评价木质素的抗氧化活性，结果如图4所示。当水溶木质素和水不溶木质素对dpph的清除率的ec
50
分别为1.57mg/ml和0.82mg/ml，碱木质素对dpph自由基清楚效果的ec
50
为2.22mg/ml，结果表明水不溶性木质素的抗氧化能力要强于水溶性木质素和碱木质素，水溶性木质素的抗氧化能力比碱木质素略强。所以通过本方法得到的两种木质素与传统方法提取的木质素相比抗氧化性更优。
[0082]
生物毒性
[0083]
由于水溶性木质素有良好的水溶解度，为了探究其更为广阔的应用范围，通过人肝癌细胞和人皮肤细胞分析水溶性木质素的生物毒性。其细胞存活率如图5所示，对于研究所用的两种细胞，在给药浓度达到800μg/ml时细胞的存活率才降到90％以下，说明水溶性木质素有着较低的生物毒性，同时其拥有良好的水溶性和抗氧化活性，在化妆品等行业有着一定的应用潜力。
[0084]
保湿活性
[0085]
不同的样品对水分子有着不同的作用力，吸收水分和保持水分的能力也不同，因
此用样品的吸湿、保湿性能的差异来评估体外保湿性能。采用重量法测定甘油糖苷的体外吸湿性能，并与常用的保湿剂透明质酸进行比较。甘油糖苷样品在体外具有良好的吸湿性能，能够从环境中吸收一定的水分，从而有良好的吸湿性能，其吸湿性能好于透明质酸。此外由于有甘油基团的修饰，结构中的羟基能与水分以氢键作用相结合，以达到保湿的作用。与常见的保湿剂透明质酸相比，甘油糖苷的吸湿性和保湿性都更为优秀，详见图6和7，因此其可作为保湿剂应用于化妆品或者医疗行业。