一种实时监控的人免疫球蛋白的生产方法与流程

1.本发明涉及人免疫球蛋白生产技术领域，更具体地说，它涉及一种实时监控的人免疫球蛋白的生产方法。


背景技术：

2.人免疫球蛋白来源于人的血浆，一般采用健康献血员的新鲜血浆或保存期不超过两年的冰冻血浆，经低温乙醇蛋白分离法分段沉淀后提取免疫球蛋白的组分，经超滤或冷冻干燥脱醇、浓缩和灭活病毒处理等工序制得。人血浆的加工采用低温乙醇蛋白分离法，一般依次制得组分ⅰ、组分ⅱ、组分ⅲ、组分ⅳ和组分
ⅴ
，主要是分为两种情况，第一种情况是，产品蛋白需要保留在上清液中，如果低温乙醇添加量过多，则会使产品蛋白析出，造成浪费，如果低温乙醇添加量过少，则杂质蛋白在上清液中残留较多；第二中情况是，通过低温乙醇将杂蛋白析出，而产品蛋白保留在上清液中，当低温乙醇的添加量过少时，产品蛋白未完全析出，造成原料的浪费及成本的提高，当低温乙醇添加过多时，产品蛋白质的析出不变，但是杂蛋白析出更多，影响产品质量，因此需要监控低温乙醇的添加量。
3.在组分ⅰ、ⅱ和ⅲ中均含有人免疫球蛋白，因此一般是将组分ⅱ ⅲ的沉淀来生产人免疫球蛋白(即属于上述的第一种情况)，生产方法也是采用低温乙醇蛋白分离法，即将组分ⅱ ⅲ沉淀再次溶解后进行分离，得到上清液(即人免疫球蛋白的溶液)，为了确保组分ⅱ ⅲ沉淀中人免疫球蛋白的收得率尽可能高，一般需要对人免疫球蛋白产品的蛋白含量进行检测，但只能针对生产成品进行检测，因此检测是滞后于生产的，如果检测到产品的蛋白质含量过少时，只能对同一批次的产品进行返工，生产成本提高，生产效率受到影响，另外，当产品的蛋白质含量过少时，可能也是组分ⅰ中作为杂质蛋白的人免疫球蛋白未完成析出导致。


技术实现要素：

4.针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种实时监控的人免疫球蛋白的生产方法，通过在生产过程中取样与标准的关系曲线比较，判断生产是否出现异常。
5.本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
6.一种实时监控的人免疫球蛋白的生产方法，包括组分分离和实时监控；
7.组分分离：将原料血浆破袋后输送到融浆罐，待血浆融化后把血浆温度控制在0～4℃之间，离心分离沉淀，去除沉淀后的血浆输送至第一反应罐进行提取分离；
8.血浆进入第一反应罐后，启动搅拌，滴加缓冲液调节ph值，添加低温乙醇，完全添加乙醇后进行离心，离心得组分i沉淀和组分i上清液，组分i沉淀用于制备人纤维蛋白原，组分i上清液进入第二反应罐，滴加缓冲液调节组分i上清液的ph值，添加低温乙醇，然后搅拌和静置，进行压滤，压滤后得组分ⅱ ⅲ沉淀和组分ⅱ ⅲ上清液，记录组分ⅱ ⅲ沉淀的重量，组分ⅱ ⅲ沉淀用于制备人免疫球蛋白；
9.将组分ⅱ ⅲ沉淀用水低温溶解，然后加入低温的乙酸钠溶液，滴加缓冲液调整ph
值，再次加入低温乙醇，在加入低温乙醇的过程中搅拌，完全加入低温乙醇后继续搅拌然后静置，然后加入硅藻土进行超滤，得到人免疫球蛋白上清液；
10.实时监控：在组分ⅱ ⅲ沉淀用水溶解后，在添加低温乙醇的过程中取样，记录取样时低温乙醇的添加量，对样品进行过滤，对样品的上清液进行低温烘干及称重，根据低温乙醇添加量与上清液蛋白质重量的关系曲线得到在该低温乙醇添加量的情况下样品上清液蛋白质的理论重量，实时判断取样时蛋白质的重量与理论重量的大小；
11.当样品上清液的蛋白质重量大于理论重量时，说明在组分ⅱ ⅲ上清液的杂蛋白含量过少；当样品上清液的蛋白质重量等于理论重量时，说明生产正常；当样品上清液的蛋白质重量小于理论重量，说明组分ⅱ ⅲ上清液的人免疫球蛋白剩余较多。
12.在其中一个实施例中，低温乙醇添加量与上清液蛋白质重量的关系曲线通过下述方式制作：
13.将一定质量的人免疫球蛋白用水低温溶解，然后加入低温的乙酸钠溶液，滴加缓冲液调整ph值，再次加入低温乙醇，在加入低温乙醇的过程中搅拌，每添加一升低温乙醇，取一次标准样品，对标准样品进行过滤，对标准样品的上清液进行低温烘干及称重，记录标准样品蛋白质的重量，完全加入低温乙醇后继续搅拌然后静置，然后加入硅藻土进行超滤，得到标准上清液，将标准上清液过滤后，对标准上清液进行低温烘干及称重得到最终的蛋白质重量，根据低温乙醇的添加量与对应的标准样品蛋白质的重量绘制关系曲线。
14.在其中一个实施例中，人免疫球蛋白的质量范围是50g～500g，在50g～500g的范围内每增加特定重量的人免疫球蛋白绘制一条关系曲线，得到一组低温乙醇添加量与上清液蛋白质重量的关系曲线图；
15.在正常生产流程中，根据组分ⅱ ⅲ沉淀的重量确定相邻的两条关系曲线，当样品上清液蛋白质重量处于两条关系曲线之间时，说明生产正常；当样品上清液蛋白质重量处于两条关系曲线上方时，说明在组分ⅱ ⅲ上清液的杂蛋白含量过少；当样品上清液蛋白质重量处于两条关系曲线下方时，说明组分ⅱ ⅲ上清液的人免疫球蛋白剩余较多。
16.在其中一个实施例中，在组分分离步骤中，组分ⅱ ⅲ沉淀用水低温溶解过程中，维持温度为0～4℃，搅拌时间为2
‑
4小时，加入乙酸钠溶液温度控制在0～4℃；自开始加入乙酸钠溶液开始计时，时间控制在4～5小时内，加入后搅拌时间控制在1～2小时，滴加缓冲液时维持温度为0～4℃，滴加时间控制在2
‑
3小时内，缓冲液完全滴加后液体的ph值控制在5.15～5.25。
17.在其中一个实施例中，组分ⅱ ⅲ沉淀用水低温溶解后，加入
‑
15℃且体积分数为95％的低温乙醇，自加入低温乙醇开始计时，加液时间控制在3～5小时，完全加入低温乙醇后，低温乙醇的终浓度为17％，温度降至
‑
5～
‑
6℃；完全加入低温乙醇后溶液ph值应为5.10～5.30。
18.在其中一个实施例中，在组分分离的步骤中，将原料血浆破袋后输送到融浆罐，用30～35℃的水进行夹层循环融浆，血浆融化后，停止水循环，把血浆温度控制在0～4℃之间，离心分离沉淀，去除沉淀后的血浆输送至第一反应罐进行提取分离。
19.在其中一个实施例中，血浆进入第一反应罐后，启动搅拌并控制血浆的温度在0～1℃之间，滴加ph为4.0的缓冲液调节ph值为6.80～7.00，添加
‑
15℃且体积分数为50％的低温乙醇至乙醇体积比浓度为8％，添加乙醇的流速为1.0～1.2升/分钟，添加乙醇后温度控
制在
‑
1～
‑
3℃，加完乙醇后进行离心，离心得组分i沉淀和组分i上清液。
20.在其中一个实施例中，取组分i上清液于第二反应罐中，滴加ph为4.0的缓冲液调节组分i上清液的ph值为6.80～6.85，添加
‑
15℃且体积分数为95％的低温乙醇至乙醇体积比浓度为20％，添加乙醇的流速为1.0～1.2升/分钟，添加乙醇后温度控制在
‑
4～
‑
6℃，加完乙醇后，ph为6.80～7.00，搅拌后静置，再开启搅拌，然后进行压滤，压滤后得组分ⅱ ⅲ沉淀和组分ⅱ ⅲ上清液。
21.在其中一个实施例中，对人免疫球蛋白上清液进行稀配和巴氏灭活，将灭活后的蛋白液用0.2μm的除菌滤芯进行除菌过滤，按要求灌装，将灌装后制品移至30～32℃孵放间孵育14天，孵育完后，进行成品检定。
22.在其中一个实施例中，在人免疫球蛋白上清液制作的过程中，按每升反应液加入18g硅藻土进行压滤。
23.在其中一个实施例中，对组分ⅱ ⅲ沉淀取样，记录样品重量，低温蒸干后再次记录样品重量，计算样品的液体含量，从而计算组分ⅱ ⅲ沉淀除液体外的重量。
24.综上所述，本发明具有以下有益效果：
25.本发明在生产过程中取样来推测产品的人免疫球蛋白的大致含量和判断在制得组分ⅱ ⅲ沉淀过程中是否出现异常，由于在加入特定体积的低温乙醇后组分ⅱ ⅲ沉淀溶解后的溶液中析出蛋白质的量是确定的，因此只要将组分ⅱ ⅲ沉淀溶解后的溶液中剩余未析出蛋白质重量与标准的关系曲线比较，即可得知制得组分ⅱ ⅲ沉淀过程中是否出现异常及此时人免疫球蛋白的生产是否正常。本发明无需等待完全加入低温乙醇后才能取样判断，在添加低温乙醇的过程中即可多次取样并作出判断，使检测与生产同步进行，及时根据检测结果调整生产参数，有利于降低生产成本和提高生产效率。
具体实施方式
26.下面结合实施例，对本发明进行详细描述。
27.本发明提供了一种实时监控的人免疫球蛋白的生产方法，包括组分分离和实时监控；
28.组分分离：将原料血浆破袋后输送到融浆罐，用30～35℃的水进行夹层循环融浆，血浆融化后，停止水循环，把血浆温度控制在0～4℃之间，离心分离沉淀，去除沉淀后的血浆输送至第一反应罐进行提取分离；
29.血浆进入第一反应罐后，启动搅拌并控制血浆的温度在0～1℃之间，滴加ph为4.0的缓冲液调节ph值为6.80～7.00，添加
‑
15℃且体积分数为50％的低温乙醇至乙醇体积比浓度为8％，添加乙醇的流速为1.0～1.2升/分钟，添加乙醇后温度控制在
‑
1～
‑
3℃，加完乙醇后进行离心，离心得组分i沉淀和组分i上清液；
30.取组分i上清液于第二反应罐中，滴加ph为4.0的缓冲液调节组分i上清液的ph值为6.80～6.85，添加
‑
15℃且体积分数为95％的低温乙醇至乙醇体积比浓度为20％，添加乙醇的流速为1.0～1.2升/分钟，添加乙醇后温度控制在
‑
4～
‑
6℃，加完乙醇后，ph为6.80～7.00，搅拌后静置，再开启搅拌，然后进行压滤，压滤后得组分ⅱ ⅲ沉淀和组分ⅱ ⅲ上清液，记录组分ⅱ ⅲ沉淀的重量，组分ⅱ ⅲ沉淀用于制备人免疫球蛋白；
31.将组分ⅱ ⅲ沉淀用水低温溶解，然后加入低温的乙酸钠溶液，滴加缓冲液调整ph
值，再次加入低温乙醇，在加入低温乙醇的过程中搅拌，完全加入低温乙醇后继续搅拌然后静置，然后加入硅藻土进行超滤，得到人免疫球蛋白上清液；
32.其中，组分ⅱ ⅲ沉淀用水低温溶解过程中，维持温度为0～4℃，搅拌时间为2
‑
4小时，加入乙酸钠溶液温度控制在0～4℃；自开始加入乙酸钠溶液开始计时，时间控制在4～5小时内，加入后搅拌时间控制在1～2小时，滴加缓冲液时维持温度为0～4℃，滴加时间控制在2
‑
3小时内，缓冲液完全滴加后液体的ph值控制在5.15～5.25；加入
‑
15℃且体积分数为95％的低温乙醇，自加入低温乙醇开始计时，加液时间控制在3～5小时，完全加入低温乙醇后，低温乙醇的终浓度为17％，温度降至
‑
5～
‑
6℃；完全加入低温乙醇后溶液ph值应为5.10～5.30。
33.在制备人免疫球蛋白上清液时，在添加低温乙醇的过程中取样，记录取样时低温乙醇的添加量，对样品进行过滤，将析出的蛋白质沉淀去除，对样品的上清液进行低温烘干及称重，得到样品上清液中蛋白质的重量，根据低温乙醇添加量与上清液蛋白质重量的关系曲线得到在该低温乙醇添加量的情况下样品上清液蛋白质的理论重量，实时判断取样时蛋白质的重量与理论重量的大小
34.当样品上清液的蛋白质重量大于理论重量时，说明在组分ⅱ ⅲ上清液的杂蛋白含量过少；当样品上清液的蛋白质重量等于理论重量时，说明生产正常；当样品上清液的蛋白质重量小于理论重量，说明组分ⅱ ⅲ上清液的人免疫球蛋白剩余较多。
35.可以理解的是，在添加低温乙醇的过程中，可以多次取样。
36.进一步地，低温乙醇添加量与上清液蛋白质重量的关系曲线通过下述方式制作：
37.将一定质量的人免疫球蛋白用水低温溶解，然后加入低温的乙酸钠溶液，滴加缓冲液调整ph值，再次加入低温乙醇，在加入低温乙醇的过程中搅拌，每添加一升低温乙醇，取一次标准样品，对标准样品进行过滤，对标准样品的上清液进行低温烘干及称重，记录标准样品蛋白质的重量，完全加入低温乙醇后继续搅拌然后静置，然后加入硅藻土进行超滤，得到标准上清液，将标准上清液过滤后，对标准上清液进行低温烘干及称重得到最终的蛋白质重量，根据低温乙醇的添加量与对应的标准样品蛋白质的重量绘制关系曲线。
38.在此过程中，人免疫球蛋白用水低温溶解后的乙酸钠添加参数、缓冲液添加参数和低温乙醇添加参数与正常生产时制备人免疫球蛋白上清液的参数及操作相同
39.其中，人免疫球蛋白的质量范围是50g～500g，在50g～500g的范围内每增加特定重量的人免疫球蛋白绘制一条关系曲线，即，在50～500g的范围内，每增加10g人免疫球蛋白重量，就绘制一条关系曲线，由此得到一组低温乙醇添加量与上清液蛋白质重量的关系曲线图；
40.在正常生产流程中，根据组分ⅱ ⅲ沉淀的重量确定相邻的两条关系曲线，比如当组分ⅱ ⅲ沉淀的重量是156g时，相邻的两条关系曲线分别是人免疫球蛋白重量为150g和160g的关系曲线，根据取样时低温乙醇的添加量在两条关系曲线上确定上清液中蛋白质的理论重量，当样品上清液蛋白质重量处于两条关系曲线之间时，说明生产正常；当样品上清液蛋白质重量处于两条关系曲线上方时，说明样品上清液蛋白质含量过高，在组分ⅱ ⅲ上清液的杂蛋白含量过少，组分ⅱ ⅲ上沉淀中蛋白质析出过多，应该调整制备组分ⅱ ⅲ上清液的工艺参数，减少组分i的蛋白质过多析出；当样品上清液蛋白质重量处于两条关系曲线下方时，说明组分ⅱ ⅲ上清液的人免疫球蛋白剩余较多，组分ⅱ ⅲ上沉淀中蛋白质析
出过少，应该调整制备组分ⅱ ⅲ上清液的工艺参数，增加组分i的蛋白质析出。
41.可以理解的是，在制备人免疫球蛋白上清液及绘制标准的关系曲线的过程中，添加的低温乙醇均不过量，即溶液中的蛋白质尽可能析出。
42.可以理解的是，在绘制标准的关系曲线时，人免疫球蛋白的质量范围是可以是更大，比如100g～1000g或500g～1000g，人免疫球蛋白的质量范围根据正常生产时每次得到的组分ⅱ ⅲ沉淀的质量来确定，具体地，人免疫球蛋白的质量范围应该在每次得到的组分ⅱ ⅲ沉淀的质量
±
10％的范围内。
43.进一步地，对人免疫球蛋白上清液进行稀配和巴氏灭活，将灭活后的蛋白液用0.2μm的除菌滤芯进行除菌过滤，按要求灌装，将灌装后制品移至30～32℃孵放间孵育14天，孵育完后，进行成品检定。
44.进一步地，在人免疫球蛋白上清液制作的过程中，按每升反应液加入18g硅藻土进行压滤。
45.以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。