修饰化外泌体及其制法和外泌体联合PD-1抗体的原位喷雾水凝胶和应用

技术特征：
1.一种修饰化外泌体，其特征在于，该修饰化外泌体为同时载有cpg寡聚脱氧核苷酸和肿瘤特异性蛋白ova的外泌体。2.根据权利要求1所述的修饰化外泌体，其特征在于，所述的外泌体为树突状细胞衍生的外泌体。3.根据权利要求1所述的修饰化外泌体，其特征在于，按比例，产生树突状细胞衍生的外泌体的树突状细胞的个数：肿瘤特异性蛋白ova为：1
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106个：200-400μg；按质量百分比，cpg寡聚脱氧核苷酸为3％-5％，余量为肿瘤特异性蛋白ova和外泌体。4.权利要求1-3任意一项所述的修饰化外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1：收集培养小鼠骨髓来源的并给予ova刺激的树突状细胞的无血清培养液，通过外泌体提取分离试剂盒除去细胞及细胞碎片，使用pbs重悬后，得到空白的外泌体；s2：将cpg odn与硫醇还原剂混合并充分搅拌，得到混合溶液；s3：将胺-巯基交联剂添加到混合溶液中继续搅拌，去除过量的硫醇还原剂和胺-巯基交联剂后，在室温下与空白的外泌体在pbs溶液中孵育，得到修饰化外泌体。5.根据权利要求4所述的修饰化外泌体的制备方法，其特征在于，所述的树突状细胞为鼠源性，从c57bl/6小鼠的股骨和胫骨提取而来；所述的给予ova刺激的树突状细胞的无血清培养液的制备过程为：在含有1
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106个树突状细胞培养基中，以培养基的体积为基准，添加20ng/ml鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，添加5ng/ml白细胞介素-4以及50μm/l β-巯基乙醇；在37℃加湿培养箱中培养3天后，用补充有相同体积的gm-csf和il-4的新鲜培养基替换；在第6天收集树突状细胞，在含有300μg/ml的ova的新鲜培养基中孵育过夜；然后加入30ng/ml lps刺激树突状细胞成熟；随后，使用无血清的培养基培养表达ova的树突状细胞，收集其培养液。6.根据权利要求4所述的修饰化外泌体的制备方法，其特征在于，所述的硫醇还原剂为三(2-羧乙基)膦和/或二硫苏糖醇；按摩尔比，cpg odn：硫醇还原剂＝1：5000；所述的胺-巯基交联剂为4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐；按摩尔比，cpg odn：胺-巯基交联剂为1：1.5。7.一种外泌体联合pd-1抗体的原位喷雾水凝胶，其特征在于，包括原位喷雾水凝胶基质、pd-1抗体和权利要求1-3任意一项所述的修饰化外泌体，外泌体联合pd-1抗体的原位喷雾水凝胶通过联合pd-1抗体和修饰化外泌体装载于原位喷雾水凝胶基质中制得。8.根据权利要求7所述的外泌体联合pd-1抗体的原位喷雾水凝胶，其特征在于，所述的原位喷雾水凝胶基质由纤维蛋白原和凝血酶组成，当等体积的纤维蛋白原溶液(10mg/ml)与凝血酶溶液(100u/ml)接触时，该基质发生凝胶化，得到原位喷雾水凝胶基质；通过喷雾混合等体积的含有修饰化外泌体的凝血酶溶液和含有pd-1抗体的纤维蛋白原溶液，形成外泌体联合pd-1抗体的原位喷雾水凝胶。9.根据权利要求7所述的外泌体联合pd-1抗体的原位喷雾水凝胶，其特征在于，按固液比，pd-1抗体：修饰化外泌体中所含cpg odn：原位喷雾水凝胶基质＝6-8μg：30-50μg：100-300μl；其中，apd-1均匀分散在原位喷雾水凝胶基质的纤维蛋白原溶液中，修饰化外泌体均匀分散在原位喷雾水凝胶基质的凝血酶溶液中。10.权利要求7-9任意一项所述的外泌体联合pd-1抗体的原位喷雾水凝胶的应用，用于
作为抑制和/或治疗黑色素瘤术后复发药剂的应用。

技术总结
一种修饰化外泌体及其制法和外泌体联合PD-1抗体的原位喷雾水凝胶和应用，属于医药技术领域，将CpG寡聚脱氧核苷酸和肿瘤特异性蛋白OVA共载于外泌体上，得到修饰化外泌体。并通过联合PD-1抗体(aPD-1)和上述修饰化外泌体装载于原位喷雾水凝胶基质中制得外泌体联合PD-1抗体的原位喷雾水凝胶。该外泌体联合PD-1抗体的原位喷雾水凝胶能释放CpG可刺激肿瘤浸润处的树突状细胞成熟，从而激活肿瘤浸润的T细胞，同时该外泌体联合PD-1抗体的原位喷雾水凝胶能够归巢至肿瘤引流淋巴结中，刺激淋巴结中的树突状细胞成熟，增加了T细胞的浸润。并且能够延长了小鼠的存活期，降低了黑色素瘤术后的复发率。复发率。复发率。


技术研发人员：孙进 卢雨彤 王开元 赵健 何仲贵
受保护的技术使用者：沈阳药科大学
技术研发日：2022.09.22
技术公布日：2022/12/30