一种检测蜜蜂亮热厉螨的引物组合和探针及其应用的制作方法

1.本发明涉及动物卫生技术领域，具体涉及一种检测蜜蜂亮热厉螨的引物探针组合物及其检测方法。


背景技术：

2.亮热厉螨(tropilaelaps clareae)属于节肢动物门(arthropoda)蛛形纲(arachnida)蜱螨亚纲(acari)寄螨总目(parasitiformes)中气门目(mesostigmata)皮刺螨总科(laelapidae)热厉螨属(tropilaelaps spp)，是亚洲地区蜜蜂科(apidae)昆虫的重要害螨，该螨以吸食蜜蜂封盖子的血淋巴为生，引起大量封盖幼虫和蛹变形或死亡，出房工蜂体型畸形和其他生理缺陷，整个蜂群的生产力严重下降，如果控制不力就会导致整个蜂群的死亡。亮热厉螨发育周期短且适应蜜蜂生长发育的条件，种群增长很快，而且可以作为病毒载体，传播蜜蜂病毒病，已成为一种比大蜂螨危害性更大的蜜蜂体外寄生虫。
3.由于亮热厉螨主要危害亚洲地区饲养的西方蜜蜂蜂群，并未对其它地区蜜蜂蜂群造成影响，所以未受到西方国家的重视，关注度相对较低，基础研究滞后。目前对于亮热厉螨的检测主要采用形态学方法，结合临床症状，通过开盖检查和箱底检查。由于对亮热厉螨各个级型的形态和生活史并不完全清楚，而且成年亮热厉螨出现在寄生蜂群的子脾表面且行动灵活，蜂螨体色与蜡脾颜色接近，易形成体色伪装，增加了亮热厉螨的发现及收集的难度，所以仅靠形态学检查无法准确鉴定。而基于基因组诊断方面的技术目前尚无相关报道，有必要开展相关分子水平诊断计算的探讨，鉴于此，研究和开发检测蜜蜂亮热厉螨的引物探针组合物及其检测方法，用于蜜蜂亮热厉螨的检测及其与其他蜂螨的鉴别，以及进出口蜜蜂及蜂产品的检疫，对于保障我国养蜂业的发展、生物安全和维护自然生态平衡具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是如何简单、快速、灵敏和/或特异地检测蜜蜂亮热厉螨(tropilaelaps clareae)。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
5.为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于检测蜜蜂亮热厉螨的引物对，所述引物对可为特异性扩增蜜蜂亮热厉螨线粒体细胞色素c氧化酶亚基i(cytochrome c oxidase subunit i,coi)基因或含有所述coi基因片段的一对引物，所述coi基因的核苷酸序列可为seq id no.1。
6.进一步地，所述引物对由引物tcl_f和引物tcl_r组成，所述引物tcl_f可为seq id no.2所示的单链dna分子；所述引物tcl_r可为seq id no.3所示的单链dna分子。
7.所述引物tcl_f为正向引物，所述引物tcl_r为反向引物。
8.所述正向引物tcl_f和反向引物tcl_r为特异性扩增蜜蜂亮热厉螨(tropilaelaps clareae)的coi基因的引物对，即用于检测蜜蜂亮热厉螨的特异引物对。
9.本发明还提供了用于检测蜜蜂亮热厉螨的组合物(引物探针组合物)，所述组合物可由所述引物对和蜜蜂亮热厉螨特异性探针组成，所述蜜蜂亮热厉螨特异性探针可为与所述coi基因特异结合的单链dna分子cagattaccygtcctagctgcagct。
10.所述探针可为taqman探针，名称为tcl_p。
11.上述组合物中，所述探针tcl_p的核苷酸序列可为seq id no.4。
12.上述组合物中，所述探针tcl_p的5’端标可记荧光基团，3’端可标记淬灭基团。
13.所述荧光基团选自fam、6-fam、vic、hex、trt、cy3、cy5、rox、joe、fitc、tet、ned、tamra、lc red640、lc red705、quasar705或texas red中的至少一种。
14.所述淬灭基团选自tamra、bhq1、bhq2、bhq3、mgb、dabcy1中的至少一种。
15.上述组合物中，所述探针的5’端可标记fam，3’端可标记bhq-1(bhq1)。
16.本发明还提供了用于检测蜜蜂亮热厉螨的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包含所述引物对或本文中任一所述的组合物。
17.进一步地，所述试剂盒还包括pcr扩增所需要的taq dna聚合酶、dntp、pcr缓冲液、mg2 中的一种或多种。
18.所述试剂盒的各种试剂组分可以存在于分开的容器中，或者可以全部或部分预组合成试剂混合物。
19.进一步地，所述试剂盒还可包括记载有本文中所述检测蜜蜂亮热厉螨的方法的可读性载体。所述可读性载体可为关于实践本发明方法的试剂盒说明书(例如印刷形式的说明书)或在其上已记录了信息的计算机可读的介质(例如软盘、cd等)。
20.本发明还提供了所述引物对，和/或，本文中任一所述组合物的下述任一种应用：
21.a1)在检测蜜蜂亮热厉螨或制备用于检测蜜蜂亮热厉螨的产品中的应用；
22.a2)在检测coi基因或制备用于检测coi基因的产品中的应用；
23.a3)在鉴定或辅助鉴定蜜蜂亮热厉螨中的应用；
24.a4)在制备用于鉴定或辅助鉴定蜜蜂亮热厉螨的产品中的应用；
25.a5)在鉴别区分蜜蜂亮热厉螨和其他蜂螨或制备用于鉴别区分蜜蜂亮热厉螨和其他蜂螨的产品中的应用；
26.a6)在蜜蜂亮热厉螨防控中的应用。
27.本文所述产品可为试剂、试剂盒、芯片或试纸。
28.本发明还提供了非疾病诊断目的的检测蜜蜂亮热厉螨的方法，所述方法可包括使用所述引物对或本文中任一所述组合物对待测样品进行pcr扩增反应，根据pcr扩增产物确定待测样品是否含有蜜蜂亮热厉螨或待测样品是否为蜜蜂亮热厉螨。
29.进一步地，上述方法中，所述pcr扩增反应可为实时荧光定量pcr反应。
30.进一步地，上述方法中，所述实时荧光定量pcr反应体系包括：pcr buffer、mgcl2、dntps、引物tcl_f、引物tcl_r、探针tcl_p、dna聚合酶、待测样品dna、ddh2o。
31.进一步地，上述反应体系中，引物tcl_f和引物tcl_r的摩尔比为1:1。
32.进一步地，上述反应体系中，引物tcl_f、引物tcl_r和探针tcl_p的摩尔比为：1:1:1.6。
33.进一步地，上述反应体系中，引物tcl_f和引物tcl_r的终浓度为0.25μmol/l。
34.进一步地，上述反应体系中，探针tcl_p的终浓度为0.4μmol/l。
35.进一步地，所述实时荧光定量pcr反应体系可为：2
×
pcr buffer 10μl，25mmol/l mgcl
2 2.0μl，2.5mmol/l dntps 1.5μl，10μmol/l引物tcl_f 0.5μl，10μmol/l引物tcl_r 0.5μl，10μmol/l探针tcl_p 0.8μl，5u/μl dna聚合酶0.5μl，待测样品dna 2.0μl，ddh2o 2.2μl。
36.所述实时荧光pcr反应程序可为：95℃预变性5min；95℃变性15s，58℃退火30s，共40个循环，在58℃进行单点荧光检测。
37.进一步地，所述待测样品可为蜂螨、蜜蜂或蜂蜜、花粉等蜂产品。
38.上述方法中，所述根据pcr扩增产物确定待测样品是否含有蜜蜂亮热厉螨或待测样品是否为蜜蜂亮热厉螨的方法可为下述任一种：
39.b1)根据pcr扩增产物中是否含有一个大小为134bp的dna片段，确定待测样品是否含有蜜蜂亮热厉螨或是否为蜜蜂亮热厉螨：如果pcr扩增产物中含有一个大小为134bp的dna片段，所述待测样品中含有蜜蜂亮热厉螨或为蜜蜂亮热厉螨；如果pcr扩增产物中不含有一个大小为134bp的dna片段，所述待测样品中不含有蜜蜂亮热厉螨或不为蜜蜂亮热厉螨；
40.b2)根据pcr扩增产物的扩增曲线和/或溶解曲线确定待测样品是否含有蜜蜂亮热厉螨或是否为蜜蜂亮热厉螨：如果扩增曲线为s型曲线确定待测样品中含有蜜蜂亮热厉螨或为蜜蜂亮热厉螨；如果扩增曲线不为s型曲线，确定待测样品中不含有蜜蜂亮热厉螨或不为蜜蜂亮热厉螨；如果溶解曲线为单峰型曲线确定待测样品中含有蜜蜂亮热厉螨或为蜜蜂亮热厉螨；如果溶解曲线不为单峰型曲线或无峰，确定待测样品中不含有蜜蜂亮热厉螨或不为蜜蜂亮热厉螨；
41.b3)根据pcr扩增产物的ct值确定待测样品是否含有蜜蜂亮热厉螨或是否为蜜蜂亮热厉螨：如果ct值≤35确定待测样品中含有蜜蜂亮热厉螨或为蜜蜂亮热厉螨；如果ct值》35，确定待测样品中不含有蜜蜂亮热厉螨或不为蜜蜂亮热厉螨。
42.上述应用和方法的目的可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的，它们的目的也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的；它们的直接目的可以是获取疾病诊断结果、疾病预后结果和/或疾病治疗结果的中间结果的信息，它们的直接目的可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和/或非疾病治疗目的。
43.上述方法的待测样品可为来自非有生命的人体或动物体的样品，如蜂箱内环境样品、昆虫样品或蜂产品样品。
44.上述方法可用于亮热厉螨的分类鉴定。
45.本发明根据亮热厉螨coi基因片段序列，并通过筛选、比对选取保守序列作为靶目标，再设计和筛选最优引物和探针、优化反应体系和反应条件，通过一系列创造性的劳动获得了一种检测蜜蜂亮热厉螨的引物探针组合物及其检测方法，用于非诊断为目的的蜜蜂亮热厉螨的检测及其与其他蜂螨的鉴别，以及蜜蜂及蜂产品的海关进出口检疫，对于保障我国养蜂业的发展、生物安全和维护自然生态平衡具有重要意义。
46.本发明的技术方案具有以下有益效果：
47.(1)良好的特异性和稳定性：本发明通过大量dna测序和序列比对分析，筛选了蜜蜂亮热厉螨保守序列片段为靶目标；通过对多组引物进行比较后选定的最佳引物，而且还设计并筛选了一条特异性荧光探针，在实时荧光pcr反应过程中可以对靶目标进行双重控
制，对蜜蜂亮热厉螨的检测特异性非常强，与其它蜂螨无交叉反应；相对于重组酶聚合酶等温核酸扩增技术，实时荧光pcr引物长度要求短，不易产生引物二聚体，扩增效果更好，具有较好的重复性；
48.(2)灵敏度高：本发明采用taqman-bhq-1探针，因为bhq-1本身不产生荧光，荧光背景低，所以灵敏性更高，再通过对反应体系和反应条件的多次优化，进一步提升其灵敏度，可达到约2.8拷贝/μl；
49.(3)操作简便、快速：实时荧光收集数据，不需要进行电泳检测核酸的扩增情况，整个反应可在1小时内完成。
附图说明
50.图1为实时荧光pcr退火温度的优化结果图(其中仅58℃退火温度的ct值为最小，荧光强度为高)。
51.图2为实时荧光pcr反应体系的优化结果图(其中，仅当反应体系中tcl
_
f/r终浓度为0.25μmol/l，tcl_p终浓度为0.4μmol/l时，ct值、荧光强度和扩增曲线形态最为理想)。
52.图3为灵敏度检测图(其中，当阳性克隆质粒为2.8拷贝/μl时仍然能够扩增得到相应的曲线)。图3中1～9分别表示质粒dna标准品的浓度为2.8
×
108拷贝/μl～2.8
×
100拷贝/μl。
53.图4为标准曲线(其中标准曲线显示扩增有效率e为98.1％，决定系数r2为0.999，标准曲线y＝-3.392x 34.602)。
54.图5为ct值的确定图(其中除了阳性对照外，2.8拷贝/μl的3个重复均出现扩增曲线，平均扩增的ct值为34.989，1.4拷贝/μl的3个重复均出现1条扩增曲线，0.7拷贝/μl的3个重复均未出现扩增曲线)。
55.图6为特异性检测结果图，图6中的扩增曲线为蜜蜂亮热厉螨的扩增曲线(其中仅蜜蜂亮热厉螨出现扩增曲线，其他蜂螨均未出现扩增曲线)。
具体实施方式
56.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
57.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
58.实施例1、引物和探针的设计
59.本实施例利用收集的多株亮热厉螨进行dna扩增和序列分析比对，筛选核酸保守序列作为靶目标。筛选到的高度保守区为coi基因，coi基因的核苷酸序列为seq id no.1。本发明用携带coi基因的重组质粒(质粒puc57-tcl)作为检测样品(即质粒标准品)。所述重组质粒puc57-tcl是将puc57载体的nrui和apai限制性核酸内切酶识别位点间的片段(小片段)替换为序列表中seq id no.1所示的dna片段，保持puc57载体的其它核苷酸序列不变，得到的重组载体。
60.针对筛选的亮热厉螨高度保守区coi基因(seq id no.1)设计用于检测亮热厉螨的特异引物对和探针。设计的引物对(tcl_f/r)由引物tcl_f和引物tcl_r组成，所述引物tcl_f可为seq id no.2所示的单链dna分子；所述引物tcl_r可为seq id no.3所示的单链dna分子，该引物对可用于特异性扩增coi基因(seq id no.1)。设计的特异性识别coi基因的探针为taqman探针，名称为tcl_p，探针tcl_p的核苷酸序列为seq id no.4，探针tcl_p的5’端标记fam，3’端标记bhq-1(bhq1)。
61.实施例2、实时荧光pcr退火温度的优化
62.实时荧光pcr反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，退火温度设置为55℃～65℃(8个梯度温度，即分别以55℃、55.7℃、57℃、59℃、61.4℃、63.3℃、64.5℃、65℃的退火温度进行反应)，退火延伸30s，每个梯度温度设置3个重复，共40个循环；
63.实时荧光pcr反应体系为：2
×
pcr buffer 10μl，25mmol/l mgcl
2 2.0μl，2.5mmol/l dntps 1.5μl，10μmol/l上下游引物各0.8μl，10μmol/l探针0.8μl，5u/μl dna聚合酶0.5μl，待测样品dna 2.0μl，然后加入ddh2o 1.6μl，使反应总体积为20.0μl。
64.按以上方法对蜜蜂亮热厉螨实时荧光pcr检测的退火温度进行优化。结果如图1所述。
65.结果显示，当退火温度为58℃时，ct值为最小，荧光强度高，在保持扩增效率的基础上，选择较高的退火温度来提高特异性，所以选择最佳退火温度为58℃。
66.实施例3、实时荧光pcr反应体系的优化
67.根据最低的ct值、较高的荧光强度增加值和扩增曲线形态以及节约的原则，按照实施例2优化的反应程序对实时荧光pcr反应体系进行优化，在反应体系中其他试剂的量不变，采用方阵配比试验分别对上、下游引物终浓度(0.1μmol/l～1.0μmol/l)、探针终浓度(0.1μmol/l～0.5μmol/l)进行优化选择。
68.按以上方法对蜜蜂亮热厉螨实时荧光pcr检测的反应体系进行优化。结果如图2所述。
69.结果显示，当反应体系中tcl_f/r(10μmol/l)含量为0.5μl(终浓度为0.25μmol/l)，tcl_p(10μmol/l)含量为0.8μl(终浓度为0.4μmol/l)时，ct值、荧光强度和扩增曲线形态均能达到理想状态，所以选择实时荧光pcr反应体系为：2
×
pcr buffer 10μl，25mmol/l mgcl
2 2.0μl，2.5mmol/l dntps 1.5μl，10μmol/l上下游引物各0.5μl，10μmol/l探针0.8μl，5u/μl dna聚合酶0.5μl，待测样品dna 2.0μl，然后加入ddh2o 2.2μl。
70.实施例4、实时荧光pcr检测方法的建立
71.1、质粒标准品的制备
72.根据实施例1筛选到的高度保守区coi基因(seq id no.1)制备质粒标准品。构建方法如下：以亮热厉螨的dna为模板，根据自行设计的引物tcl_f/r进行pcr扩增，反应体系：2
×
taq pcr mix 12.5μl，上下游引物tcl_f/r各1.0μl，模板dna 2.0μl，ddh2o补足25μl；反应条件：94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃10min。反应结束后，产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定，用dna凝胶回收试剂盒回收目的片段，将其克隆至puc57载体，转化dh5α，克隆接入含氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃培养8h，用质粒提取试剂盒提取重组质粒并进行测序，测序结果正确的重组质粒作为阳性标准品。
73.构建的质粒标准品名称为puc57-tcl。所述重组质粒puc57-tcl是将puc57载体(购自福州铂尚生物技术有限公司)的nrui和apai限制性核酸内切酶识别位点间的片段(小片段)替换为序列表中seq id no.1所示的dna片段，保持puc57载体的其它核苷酸序列不变，得到的重组载体。
74.2、提取待测样品dna
75.利用基因组dna提取试剂盒(血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒，天根生化科技有限公司)提取待测样本的基因组dna，提取方法根据试剂盒说明书。
76.3、实时荧光pcr检测方法
77.以步骤2中提取的dna为模板，采用实施例1中设计的引物tcl_f、引物tcl_r和探针tcl_p对待测样品进行实时荧光pcr扩增反应，其中：
78.实时荧光pcr反应体系为：2
×
pcr buffer 10μl，25mmol/l mgcl
2 2.0μl，2.5mmol/l dntps 1.5μl，10μmol/l上下游引物各0.5μl，10μmol/l探针0.8μl，5u/μl dna聚合酶0.5μl，待测样品dna 2.0μl，然后加入ddh2o 2.2μl。
79.实时荧光pcr反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，58℃退火30s，共40个循环。在58℃进行单点荧光检测。
80.阴性对照为无菌水。
81.阳性对照为质粒puc57-tcl。
82.4、结果判定
83.根据步骤3中的pcr扩增产物确定待测样品是否含有或是否为蜜蜂亮热厉螨。具体检测结果的判定标准为：
84.在实验有效的情况下，待测样品无ct值且无扩增曲线，表示样品中不含蜜蜂亮热厉螨；待测样品ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，表示样品中含有蜜蜂亮热厉螨；待测样品ct值＞35，则对该样品重复检测，重复检测结果无ct值或ct值＞35则该样品不含蜜蜂亮热厉螨；重复检测结果有ct值且ct值≤35则该样品中含有蜜蜂亮热厉螨；
85.所述实验有效的情况为：阴性对照无ct值且无扩增曲线，同时阳性对照ct值≤35，并且出现典型的扩增曲线，说明实验为有效实验。
86.实施例5、灵敏度实验
87.将含有蜜蜂亮热厉螨coi基因的阳性克隆质粒(即实施例4中步骤1制备的质粒标准品)用无菌水10倍递增稀释成2.8
×
108拷贝/μl～2.8
×
100拷贝/μl浓度的质粒dna标准品。
88.以稀释后的质粒dna标准品为模板，每个标准样品处理重复3次，并以健康蜜蜂组织dna为对照，以无菌水为空白对照。按照实施例4步骤3的检测方法进行实时荧光pcr检测。获得如图3所示的扩增曲线来检验灵敏度和如图4所述的蜜蜂亮热厉螨的标准曲线。
89.从图3可以看出，本方法最低可以检测到约2.8拷贝/μl的蜜蜂亮热厉螨dna模板。图4构建的标准曲线的回归方程为y＝-3.392x 34.602；r代表相关系数，决定系数r2为0.999，扩增效率为98.1％。结果表明本发明的实时荧光pcr检测方法具有高度的灵敏性。
90.实施例6、ct值的确定
91.以2.8拷贝/μl标准质粒(即实施例4中步骤1制备的质粒标准品)为起始浓度，进行连续2倍稀释，获得浓度为2.8拷贝/μl、1.4拷贝/μl、0.7拷贝/μl共3个稀释度。以此3个稀释
度的质粒标准品为模板，按照实施例4步骤3的检测方法进行实时荧光pcr检测。检测结果如图5所示。
92.图5结果显示，当模板浓度为2.8拷贝/μl时，3个重复管中均出现扩增，平均ct值为34.989；当模板浓度为1.4拷贝/μl时有1条扩增曲线，当模板浓度为0.5拷贝/μl时未出现扩增曲线，所以确定本方法的阳性判定ct值为35。
93.实施例7、特异性实验
94.分别以蜜蜂亮热厉螨、蜜蜂梅氏热厉螨、蜜蜂泰氏热厉螨、蜜蜂柯氏热厉螨、狄斯瓦螨、武氏蜂盾螨、布赫纳蝗螨7种常见蜂螨为样品(这7种样品为本实验收集并保存，公众可从申请人处获得上述蜂螨生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用)，按照实施例4步骤2的方法提取dna后以实施例4步骤3的检测方法进行实时荧光pcr检测，以及应用实施例4步骤4的结果判定方法进行判定。检测结果如图6所示。
95.由图6可知，仅蜜蜂亮热厉螨有产生典型的扩增曲线(ct值为18.61)，其他样品均无扩增曲线，提示本发明的实时荧光pcr检测方法具备良好的特异性。
96.由以上实施例可知，本发明提供了一种检测蜜蜂亮热厉螨的引物探针组合物及其检测方法。经验证，本发明的引物探针组合物及其检测方法灵敏度高，最低检测限为2.8拷贝/μl，并且特异性好，与其他蜂螨均无交叉反应。
97.以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。