一种基于级联反应的抗癌前药的制备方法及其应用

1.本发明涉及有机合成及分子医药领域，具体而言，涉及一种基于级联反应的抗癌前药的制备方法及其应用。


背景技术：

2.诊断和治疗策略的发展，可以同时用于诊断早期癌症，提供治疗药物的肿瘤和可视化的癌症阶段，为癌症患者提供更有效和个性化的治疗。肿瘤微环境(tme)是肿瘤发生发展的细胞环境。
3.与正常细胞不同的是，在各种肿瘤和癌细胞中，由于过度产生活性氧(ros)，如过氧化氢(h2o2)、羟基自由基(
·
oh)和超氧阴离子(o2·-)，已观察到较高水平的氧化应激。基于此我们设计合成了一个h2o2激活后释放荧光团和活性药物分子的前药，以达到靶向癌细胞送药并能同时诊断的目的。


技术实现要素：

4.本发明的第一目的在于基于一种新的策略提供一种抗癌前药分子，该前药分子结构简单，简单易得，合成方便，具有较好的肿瘤治疗效果，具备较高的应用价值。
5.本发明的第二目的在于提供一种抗癌前药分子的制备方法，本方法通过简单的反应将抗癌活性分子与香豆素前体连接，反应产率高，纯度好。
6.本发明的第三目的在于提供一种抗癌前药分子。
7.本发明的实施例是这样实现的：
8.一种抗癌前药分子，其结构式为：
[0009][0010]
一种抗癌前药分子的制备方法，包括：
[0011]
将带有羧基的香豆素前体和带有羟基的抗癌活性分子通过简单的缩合反应，得到抗癌前药分子。
[0012]
一种抗癌前药分子，抗癌前药分子由上述的制备方法制得。
[0013]
本发明实施例的有益效果是：
[0014]
本发明实施提供了一种抗癌前药分子，通过紫外可见光谱仪和荧光光谱仪对该前药分子的荧光释放进行监测，同时以该前药分子为研究对象，以人肝癌细胞hepg2为受试细胞株，展开了其体外抗癌活性研究，为前药分子应用于诊疗奠定了基础。
附图说明
[0015]
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0016]
图1为本发明实验例1所提供的前药分子cm-ppt与过氧化氢(h2o2)的紫外吸收光谱作用结果图；
[0017]
图2为本发明实验例1所提供的前药分子cm-ppt与h2o2的荧光光谱时间依赖作用结果图；
[0018]
图3为本发明实验例1所提供的前药分子cm-ppt与h2o2的荧光光谱浓度依赖作用结果图；
[0019]
图4为本发明实验例1所提供的前药分子cm-ppt的选择性测试作用结果图；
[0020]
图5为本发明实验例1所提供的前药分子cm-ppt与h2o2在不同ph条件下的作用结果图；
[0021]
图6为本发明实验例1前药分子cm-ppt与h2o2响应的hplc作用结果图、标准曲线及抗癌活性分子鬼臼毒素(ppt)的释放曲线；
[0022]
图7为本发明实验例1所提供的前药分子cm-ppt对hepg22细胞的毒性结果图；
[0023]
图8为本发明实验例1所提供的前药分子cm-ppt在hepg2细胞中的细胞成像图；
[0024]
图9为本发明实验例1所提供的前药分子cm-ppt和抗癌活性分子ppt在hepg2细胞中的细胞凋亡图。
具体实施方式
[0025]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0026]
下面对本发明实施例的一种抗癌前药分子及其制备方法与靶向化合物进行具体说明。
[0027]
活性氧(ros)是一类由o2连续单电子还原产生的高活性含氧中间体，它在调节细胞生长、增殖、分化、凋亡以及参与生物合成途径等方面发挥重要的作用。氧化还原动态平衡是通过调节ros的产生和分解代谢实现的。当ros过量产生或抗氧化系统能力不足时，会使细胞处于氧化应激状态，从而导致细胞受损。研究表明，氧化应激与许多疾病的发展有关，包括癌症、自身免疫性疾病、炎症、心血管疾病以及包括阿尔兹海默症和帕金森病在内的神经退行性疾病等。过氧化氢(h2o2)的化学性质在内源性ros中是独一无二的。低浓度的h2o2在体内发挥着重要的作用，包括免疫反应和细胞信号传递过程。当细胞中存在过量的h2o2时，它就会对细胞造成氧化损伤。研究表明，相关疾病患者的病理组织中h2o2浓度会明显高于正常组织中的h2o2浓度。这种生理水平的浓度差异为基于设计能够特异性地通过癌细胞中过量的h2o2激活的前药分子。研究发现，芳基硼酸酯可以特异性地被h2o2激活。将带有芳基硼酸酯的香豆素前体与抗癌活性分子连接得到前药化合物；前药化合物可以特异性
地通过癌细胞中过表达的h2o2激活，释放出抗癌活性分子和荧光团。
[0028]
本发明实施例提供了一种抗癌前药分子的制备方法，包括：
[0029]
将带有芳基硼酸酯的香豆素前体连接到抗癌活性分子的羟基，得到抗癌前药分子。
[0030]
进一步地，活性基团为羟基，所述制备方法包括：
[0031]
将抗癌活性分子的-oh基团通过酯缩合反应与香豆素前体缩合得到前药分子。
[0032]
上述抗癌活性分子的结构式为：
[0033][0034]
本发明实施例提供了一种抗癌前药分子，抗癌前药分子由上述的制备方法制得。
[0035]
进一步地，上述抗癌前药分子，其结构式为：
[0036][0037]
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
[0038]
实施例1
[0039]
本实施例提供了一种抗癌前药分子(命名为cm-ppt)，其结构式为：
[0040]
制备该抗癌前药分子(cm-ppt)的反应式为：
[0041][0042]
reagentsandconditions:a.4-(bromomethyl)benzeneboronicacidpinacolester,k2co3,ch3cn,65℃；b.
[0043]
cyanoaceticacid,piperidine,acoh,etoh,50℃；c.podophyllotoxin,edci,dmap,dcm,rt；d.ethylcyanoacetate,
[0044]
piperidine,acoh,etoh,90℃.
[0045]
其制备方法如下：
[0046]
s1.称取4-二乙氨基水杨醛(0.966g，5mmol)、4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯(1.485g，3mmol)、k2co3(2.073g，15mmol)溶于30ml ch3cn，将其在ar气保护下65℃搅拌反应10h。反应结束后，旋干溶剂，柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝5:1)得到产物(1.534g，75％)。
[0047]
s2.称取化合物1(309mg，0.75mmol)、氰基乙酸(128mg，1.50mmol)溶于30ml乙醇，再向其中加入0.3ml哌啶和0.3ml冰醋酸。将其在ar气保护条件下50℃反应12h。反应结束后，旋干乙醇，柱层析(二氯甲烷:甲醇＝60:1)得到产物为黄色固体(286mg,80％)。
[0048]
s3.称取化合物2(48mg，0.1mmol)溶于5ml无水dcm，向其中加入edci(21mg，0.11mmol)和dmap(1.2mg，0.01mmol)，将反应体系在室温下搅拌5min后，将化合物b(41mg，0.1
[0049]
mmol)加入其中，并将其在室温下搅拌过夜。反应结束后旋干溶剂，柱层析(石油醚:二氯甲烷:乙酸乙酯＝2:1:1)后得到产物为黄色固体(20mg，45％)。
[0050]
s4.将4-(二乙基氨基)-水杨醛(387mg，2mmol)溶于20ml乙醇中，再加入氰基乙酸乙酯(319μl，3mmol)、哌啶(792μl，8mmol)和乙酸(10μl)。将反应液在90℃回流1h后倒入冰水中，析出黄色固体。残渣柱层析(石油醚:丙酮＝2:1)纯化得到产品(242mg，收率50％)为黄色固体。
[0051]
需要说明的是，本实施例中优选了抗癌药物鬼臼毒素ppt作为抗癌活性分子，抗癌
活性分子还可以是其他的含有氨基和/或羟基等活性基团的抗癌药物。
[0052]
实验例2
[0053]
本实验例提供对实施例1提供的前药分子与h2o2反应的情况进行探究。
[0054]
本实验例提供对实施例1提供的抗癌前药分子(命名为cm-ppt)与h2o2的相互作用。
[0055]
利用紫外可见光谱仪和荧光光谱仪监测前药分子cm-ppt与h2o2相互作用的进程。
[0056]
前药分子(10μm)与h2o2(10eq)作用
[0057]
紫外吸收光谱及荧光光谱的测定：采用紫外及荧光分光光度计，在dmso/pbs缓冲溶液(ph＝7.4,v/v＝5/5)中测定cm-ppt(10μm)和h2o2(100μm)反应前后的紫外吸收和荧光光谱。
[0058]
前药分子cm-ppt与h2o2的反应：在37℃下，将终浓度为10μm的cm-ppt和h2o2(100μm)混合于2ml的pbs(10mm，ph＝7.4)缓冲溶液中孵育8h后，通过紫外分光光度计测试其紫外吸收，得到如图1所示的谱图。dmso含量为50％。
[0059]
如图1所示，未加入h2o2之前紫外最大吸收位于455nm，然而加入h2o2孵育之后紫外最大吸收蓝移至431nm。该实验结果表明，前药cm-ppt对h2o2有一定的响应。
[0060]
实验例3
[0061]
本实验例验证h2o2与前药分子cm-ppt随着时间变化的相互作用以及不同浓度的h2o2与前药分子cm-ppt的相互作用。
[0062]
荧光光谱测试的激发波长为431nm，激发的狭缝宽度为5nm、发射的狭缝宽度为10nm，测试电压为590v。前药分子cm-ppt(10μm)与h2o2(100μm)以及前药分子cm-ppt(10μm)和不同浓度的h2o2在37℃条件下进行测试。
[0063]
如图2所示，前药cm-ppt与h2o2反应后体系在473nm处的荧光强度随着时间而逐步增强，在4h时达到平衡。如图3所示，当h2o2的浓度为200μm时，荧光变化速率变缓，浓度为300μm时，荧光信号趋于稳定。该实验结果显示cm-ppt与h2o2反应有浓度依赖性，且荧光强度与h2o2浓度在0-10eq范围内具有良好的线性关系，r2为0.9968。上述实验结果表明，cm-ppt具有以时间和剂量依赖性方式释放ppt和荧光团的潜力。
[0064]
实验例4
[0065]
本实验例提供对实施例1合成的抗癌前药分子(命名为cm-ppt)与其它干扰物的相互作用以及在不同ph条件下与h2o2的反应情况。
[0066]
将前药分子cm-ppt(10μm)与其它干扰物孵育一定时间后测试其荧光信号，得到如图4所示的结果。除h2o2外，其它ros和氨基酸干扰物对cm-ppt均没有良好的响应。因此，前药cm-ppt对h2o2有良好的选择性，为其可以在应用于生物体内奠定了良好的基础。如图5所示，没有加入h2o2之前，前药分子cm-ppt在ph4-10范围内都有良好的稳定性。与h2o2孵育4h后，在ph 7-8范围内，前药分子cm-ppt与h2o2的反应体系均展现出较强的荧光强度，在强酸和强碱性条件下，前药均有良好的稳定性。该实验结果表明前药分子cm-ppt在生理条件下可以与h2o2有好的响应，可以应用于细胞成像和肿瘤治疗。
[0067]
实验例5
[0068]
与h2o2相互作用后，释放出抗癌活性分子ppt的情况。
[0069]
采用hplc检测方法；将终浓度为10μm的cm-ppt和100μm的h2o2混合于20ml pbs缓冲充液中，dmso含量为1％。然后置于37℃下分别孵育1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h和8h。孵育完后
通过hplc分析溶液中ppt的含量。流动相为甲醇/水＝75/25，流速0.6ml/min。
[0070]
用hplc建立ppt浓度的标准曲线。
[0071]
浓度(μm)125101520保留时间(min)4.2784.2844.2724.2814.2744.269峰面积3826699017344354685324368974
[0072]
如图6所示，得到ppt的标准曲线为：y＝3748.00x 215.84，r2＝0.9995。hplc测定cm-ppt与h2o2相互作用后释放出ppt的浓度见图6c，随着孵育时间的增加，释放的ppt也随之增加，说明cm-ppt能够通过h2o2达到缓释的效果。
[0073]
实验例6
[0074]
本实验例测定实施例1合成的cm-ppt对细胞的毒性。
[0075]
本实验中分别选取了人肝癌细胞系hepg2细胞来评估前药分子的生物活性。hepg2细胞培育在配制好的细胞培养基(dmem)中，保持5％的co2浓度，将其放置于37℃的细胞培养箱中。将1
×
104的hepg2细胞和不同浓度的前药分子cm-ppt混合种植于96孔板中(最终体积为100μl)，同时用dmso处理细胞作为对照。前药cm-ppt和原型药物ppt与细胞作用44h后，向每个孔中再加入100μl mtt(5mg/ml)孵育4h。然后向96孔板中加入100μl三联试剂(10％sds，5％异丁醇，0.1％hcl)，放置于细胞培养箱中过夜，之后利用酶标仪测定其在570nm处的吸收。
[0076]
结果如图7所示，实验结果显示cm-ppt对癌细胞的细胞毒性较小。在癌细胞中，cm-ppt发挥药效的时间明显要比ppt滞后，说明cm-ppt具有缓释的功效。
[0077]
实验例7
[0078]
本实验例测定实施例1中合成的cm-ppt的细胞成像。
[0079]
将hepg2细胞以每孔1
×
104个细胞在0.5ml培养基中接种于12孔板中，并在37℃下培养24h，然后将细胞分为3组。第一组细胞只加入前药cm-ppt(2μm)在37℃孵育1h和4h。第二组细胞加入h2o2(200μm)预处理30min，用pbs清洗细胞3次后加入前药cm-ppt(2μm)，将细胞在37℃继续孵育1h和4h。有研究表明，利用脂多糖(lps)刺激细胞可以进一步使内源性的ros水平升高。因此第三组细胞用lps(1μg/ml)预处理24h，用pbs清洗细胞3次后加入前药cm-ppt(2μm)，将细胞在37℃继续孵育1h和4h。用pbs清洗3次细胞后，用floid细胞成像工作站拍照。
[0080]
结果如图8a所示，对照组几乎没有荧光。只加入前药cm-ppt孵育的细胞作用4h后只有微弱的绿色荧光，加入h2o2预处理的第二组细胞与cm-ppt作用4h后荧光强度更强，用lps预处理的第三组细胞与cm-ppt作用4h后荧光强度与第一组相比更强，与第二组的差别不大。由8b和8c的荧光定量图也可以得出该结果，细胞成像的实验结果表明前药cm-ppt可以被内源性的h2o2激活释放出荧光团以监测药物释放，加入外源性h2o2或者lps刺激内源性ros增多可以促进前药被激活。
[0081]
实验例8
[0082]
本实验例测定实施例1中合成的cm-ppt的细胞凋亡。
[0083]
在1.0ml的培养基中将hepg2细胞以每孔1
×
104个细胞接种于6孔板中，并在37℃下培养24h，将细胞分成两组，这两组细胞中分别加入ppt(5μm，10μm)和前药cm-ppt(5μm，10μm)作用48h，dmso引入量为0.5％。实验结果如图9所示，cm-ppt相对于ppt可以诱导更多的
细胞凋亡，且随着浓度的增加，凋亡的细胞数量也随之增加。该实验结果表明，前药分子cm-ppt可以更好地诱导细胞凋亡，为其能应用于小鼠中肿瘤治疗奠定了基础。
[0084]
综上所述，本发明实施例提供了一种基于级联-分子内环化反应设计合成的抗癌前药分子，该前药分子能够被肿瘤细胞内过度表达的h2o2选择性识别；一种抗癌前药分子的制备方法，将前述的香豆素前体连接到抗癌活性分子的羟基上，制得抗癌前药分子；在前药分子被肿瘤细胞内高表达的h2o2选择性识别后，释放出抗癌活性分子，直接作用于癌症细胞，达到靶向治疗的目的。
[0085]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。