一种检测Fe(CN)

一种检测fe(cn)
63-离子的荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及一种荧光探针及其制备方法和应用，特别是一种检测 fe(cn)
63-离子的荧光探针及其制备方法和应用。


背景技术：

2.铁氰化钾(k3[fe{cn}6])在固体状态下是一种红色晶体，在水溶液中容易被碱性或光照分解成剧毒的氰化物(kcn，hcn)。氰化物对生物体具有极大的毒性，可以通过口腔、呼吸道或皮肤吸入。吸入后会诱导线粒体产生活性氧(羟基自由基)；导致线粒体功能紊乱；并导致抽搐、呕吐、意识丧失，甚至死亡。
[0003]
根据世界卫生组织的规定，饮用水中的氰化物浓度最低为1.9μm是允许的，但对于生物体来说，血液中的氰化物浓度超过20μm就确定为有毒。在工业中，氰化物经常被意外地释放到水溶液中，对人类的生命和健康以及环境污染造成了显著的风险。
[0004]
因此，开发一种快速有效的检测铁氰化钾的方法对环境监测和生命健康，非常重要。在众多不同的分析方法中，荧光探针法因其技术简单、灵敏度高、无创性、反应时间快、可用于生物环境而受到极大关注。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于，提供一种检测fe(cn)
63-离子的荧光探针及其制备方法和应用。本发明的荧光探针能够对水溶液和人肾皮质近曲小管上皮细胞中的fe(cn)
63-离子进行检测，且具有检测限低、灵敏度高、生物相容性好、样品处理简单、操作方便以及测定快速的特点。
[0006]
本发明的技术方案：一种检测fe(cn)
63-离子的荧光探针，分子式为 3c
84h84n56o28
@c
45h51
n4br3，结构式如下：
[0007][0008]
其中，
[0009]
一种制备前述的检测fe(cn)
63-离子的荧光探针的方法，由铰接十四元瓜环和4,4’,4
”‑
(次氮基三(苯-4,1-二基))三(1-丁基吡啶-1-鎓)制备而成。
[0010]
前述的制备检测fe(cn)
63-离子的荧光探针的方法，所述方法具体如下：
[0011]
(1)取铰接十四元瓜环，然后加入混合溶剂混合均匀，得溶液a；
[0012]
(2)取4,4’,4
”‑
(次氮基三(苯-4,1-二基))三(1-丁基吡啶-1-鎓)，然后加入混合溶剂混合均匀，得溶液b；
[0013]
(3)将溶液a和溶液b混合，然后常温下反应即得荧光探针。
[0014]
前述的制备检测fe(cn)
63-离子的荧光探针的方法，所述混合溶剂为二次水。
[0015]
前述的制备检测fe(cn)
63-离子的荧光探针的方法，所述溶液a中的铰接十四元瓜环的浓度为0.1
×
10-3-10
×
10-3
mol/l；所述溶液b中的4,4’,4
”‑
(次氮基三(苯-4,1-二基))三(1-丁基吡啶-1-鎓)的浓度为 0.1
×
10-3-10
×
10-3
mol/l。
[0016]
前述的制备检测fe(cn)
63-离子的荧光探针的方法，所述溶液a和溶液b 混合时，铰接十四元瓜环与4,4’,4
”‑
(次氮基三(苯-4,1-二基))三(1-丁基吡啶
ꢀ‑
1-鎓)的摩尔比大于3:1。
[0017]
一种前述的荧光探针作为检测水溶液中的fe(cn)
63-离子的探针的应用。
[0018]
前述的荧光探针作为检测fe(cn)
63-离子的探针的应用，应用方法如下：
[0019]
(1)取所述荧光探针，用二次水稀释，得浓度为2
×
10-5
mol/l的探针标准溶液；
[0020]
(2)向步骤(1)制得的探针标准溶液中加入待检测样品的水溶液，放置3-10min，然后以固定激发波长455nm进行荧光发射光谱测定，并绘制激发出的该激光波长处的荧光强度的变化曲线；
[0021]
(3)根据步骤(2)的曲线计算探针标准溶液中加入含有fe(cn)
63-的待检测样品的水溶液前后对应575nm下的荧光发射光谱强度变化值δi，即可对待检测样品的水溶液中的fe(cn)
63-离子进行检测。
[0022]
一种前述的荧光探针作为检测人肾皮质近曲小管上皮细胞中的 fe(cn)
63-离子的探针的应用。
[0023]
前述的荧光探针作为检测fe(cn)
63-离子的探针的应用，其特征在于，应用方法如下：
[0024]
在无血清dmem培养条件下，先用荧光探针处理细胞20-40min,分别加 5μm和20μm k3fe(cn)6处理细胞1h,固定细胞后观察胞内探针荧光有无明显变化,若有荧光出现减低或者发生猝灭，则说明含有fe(cn)
63-，若没有则说明不含有fe(cn)
63-。
[0025]
本发明的有益效果
[0026]
本发明利用铰接十四元瓜环(简称tq[14])和4,4’,4
”‑
(次氮基三(苯-4,1-二基))三(1-丁基吡啶-1-鎓)(简称tpapy)作为原料，通过主客体相互作用，构建了一种aie效应超分子荧光探针(tpapy@tq[14])。 tpapy@tq[14]可以灵敏地检测水溶液中的潜在氰化物(k3[fe{cn}6])，检测限低至3.28
×
10-7
m。tpapy@tq[14]的正电荷的独特性质可以迅速穿过肾小球过滤屏障进入人肾皮质近曲小管上皮细胞(hk-2细胞)。此外，该探针被成功应用于区分hk-2细胞中过量的fe(cn)
63-进行细胞成像。
[0027]
本发明荧光探针具有较高灵敏度和良好的生物相容性，样品处理简单、操作方便以及测定快速的优点。
附图说明
[0028]
附图1为铰接十四元瓜环(简称tq[14])和4,4',4
”‑
(次氮基三(苯
ꢀ‑
4,1-二基))三(1-丁基吡啶-1-鎓)(简称tpapy)的结构式；
[0029]
附图2为铰接十四元瓜环(简称tq[14])和4,4',4
”‑
(次氮基三(苯
ꢀ‑
4,1-二基))三(1-丁基吡啶-1-鎓)(简称tpapy)利用origin软件进行数据处理得到的荧光光谱图；其中：(a)是tpapy在水和四氢呋喃溶剂中的aie 效应；(b)是tpapy在不同极性溶剂中的溶剂效应；(c)0.0.1...到6当量的tq[14]逐渐加入tpapy的荧光光谱；(d)tpapy@tq[14]的job's图；
[0030]
附图3为tq[14]和tpapy核磁滴定及包结模式图；其中 (i)tpapy；(ii)tpapy:tq[14]＝1：1；(iii)tpapy:tq[14]＝1：2；(iv)tpapy:tq[14]＝1：3.
[0031]
附图4探针含15种钾盐阴离子对fe(cn)
63-的抗干扰柱状图；
[0032]
附图5为探针和阴离子进行检测并利用origin软件进行数据处理得到的荧光光谱图；其中：(a)对16种阴离子的特异性选择荧光光谱图；(b)对 fe(cn)
63-的特异性识别的机理；(c)为探针标准溶液加入不同浓度含有 fe(cn)
63-离子的溶液时的荧光滴定光谱曲线；(d)为探针标准溶液加入含有 fe(cn)
63-离子的溶液时的荧光滴定检出限；
[0033]
附图6探针对16种钾盐阴离子特异性选择比色皿荧光对比图；
[0034]
附图7为探针在hk-2细胞中的生物相容性柱状图；
[0035]
附图8为探针对hk-2细胞的细胞成像图；其中(a)为探针对hk-2细胞的染色图；(b)探针对hk-2细胞中含5μmol/lfe(cn)
63-的细胞染色图；(c) 探针对hk-2细胞中含20μmol/lfe(cn)
63-的细胞染色图附图。
具体实施方式
[0036]
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
[0037]
本发明的实施例
[0038]
实施例1
[0039]
荧光探针的制备：
[0040]
(1)准确称取适量的铰接十四元瓜环，用二次水溶解并定容至100ml 的容量瓶中，得到浓度为1.00
×
10-3
mol/l铰接十四元瓜环溶液；
[0041]
(2)准确称取适量的4,4',4
”‑
(次氮基三(苯-4,1-二基))三(1-丁基吡啶-1-鎓)，用二次水溶解并定容至100ml的容量瓶中得到浓度为 1.00
×
10-3
mol/l的4,4',4
”‑
(次氮基三(苯-4,1-二基))三(1-丁基吡啶-1
‑ꢀ
鎓)溶液。
[0042]
(3)将两溶液按照体积比v
tq[14]
:v
tpapy
＝3：1混合，并常温下静置片刻，即可获得浓度为2.00
×
10-5
mol/l的荧光探针标准溶液。
[0043]
实施例2
[0044]
实施例1所述荧光探针检测水中铁氰化钾的方法步骤如下：
[0045]
(1)取所述探针，二次水稀释，制取浓度为2.00
×
10-5
mol/l的荧光探针标准溶液；
[0046]
(2)向步骤1)制得的探针标准溶液中加入待检测溶液，放置5min，然后以固定激发波长455nm进行荧光发射光谱测定，并绘制发射波长为 574nm处的荧光强度的变化曲线；
[0047]
(3)根据步骤2)的曲线计算荧光探针溶液中加入待测水前后对应 574nm下的荧光
发射光谱强度变化值δi，当加入待测水前后对应574nm下的荧光发射光谱若强度明显减弱，则表明待检测水中含有fe(cn)
63-，且浓度是tpapy@tq[14]的0-2倍(不包括0和2)，当加入待测水前后对应572nm 下的荧光发射光谱若强度未发生明显变化，则表明水中未含有fe(cn)
63-。
[0048]
实施例3
[0049]
实施例1所述荧光探针检测hk-2细胞的方法如下：
[0050]
(1)准确称取适量的铰接十四元瓜环，用二次水溶解并定容至100ml 的容量瓶中，得到浓度为1
×
10-3
mol/l铰接十四元瓜环溶液；
[0051]
(2)准确称取适量的4,4',4
”‑
(次氮基三(苯-4,1-二基))三(1-丁基吡啶-1-鎓)，用二次水溶解并定容至100ml的容量瓶中得到浓度为 1
×
10-3
mol/l的4,4',4
”‑
(次氮基三(苯-4,1-二基))三(1-丁基吡啶-1-鎓) 溶液；
[0052]
(3)将两溶液按照体积比v
tq[14]
:v
tpapy
＝3：1混合，并常温下静置片刻，即可获得浓度为1
×
10-4
mol/l的荧光探针标准溶液；
[0053]
(4)在无血清dmem培养条件下，先用100μm探针处理细胞30min,分别加5μmol/l和20μmol/lk3fe(cn)6处理hk-2细胞共同培养1h,固定细胞后观察胞内探针荧光无明显变化,若有荧光出现减低或者发生猝灭，则说明里面含有fe(cn)
63-；若没有则说明不含有fe(cn)
63-。
[0054]
实验例：
[0055]
1、铁氰根离子标准溶液的配制：
[0056]
准确称取适量铁氰化钾，用ph＝6.75的二次水溶解并定容至10ml，得到浓度为1.00
×
10-1
mol/l的铁氰根离子标准溶液。
[0057]
2、标准曲线的绘制：
[0058]
取一个石英荧光比色皿，加入2.00
×
10-5
mol/l荧光探针溶液3000μl 后，准确加入2.00
×
10-1
mol/l的fe(cn)
63-标准溶液1.0μl在比色皿中，搅匀，固定激发波长455nm进行荧光发射光谱测定。
[0059]
按照上述操作，不断的向上述3000μl探针溶液加入定量0.5μlfe(cn)
63-标准溶液，并在455nm激发波长下，测得一系列的荧光曲线，直至荧光曲线纵坐标数值变化缓慢，即可停止该滴定操作。
[0060]
然后以fe(cn)
63-浓度为横坐标，574nm发射波长处探针荧光发射强度与加入不同浓度fe(cn)
63-的荧光发射强度的差值为纵坐标，得到标准曲线。
[0061]
3、探针的生物相容性测试：
[0062]
将hk-2细胞接种在96孔u型底板中，在5％co2和37℃条件下培养 24h，然后用不同浓度的tpapy和tpapy@tq[14]处理12h和24h。随后，去除上清液后，将mtt(5mg/ml培养基，20μl/孔)加入孔中，然后在37℃下孵育4小时。去除上清液，每孔加入150μl dmso以溶解，将板摇动4分钟后测试吸光度值。
[0063]
4、探针的细胞成像：
[0064]
hk-2细胞在含有10％fbs(胎牛血清)和2％抗生素溶液的dmem 中，并铺展在直径为35mm的圆形玻璃培养皿上，以5％co2和37℃条件于孵箱中孵育24小时。将细胞与dmso(ph＝6.75)在37℃下孵育5分钟。然后将细胞用预热的pbs(ph＝6.75)洗涤5分钟。随后，将细胞
与溶解在水中的探针(100μm)在37℃下孵育5分钟，然后用预热的pbs(ph＝6.75)洗涤3次。为了检测活细胞中的fe(cn)
63-，在其培养皿中用fe(cn)
63-(5μm 和20μm)刺激细胞，然后在30秒内获得荧光显微镜图像。
[0065]
5、hk-2细胞的fe(cn)
63-检测：
[0066]
在无血清dmem培养条件下，先用100μm探针处理细胞30mins,分别加5μm和20μm k3fe(cn)6处理hk-2细胞1h,固定细胞后观察胞内探针荧光无明显变化,若有荧光出现减低或者发生猝灭，则说明里面含有 fe(cn)
63-；若没有则说明不含有fe(cn)
63-。
[0067]
以上所述，仅为本发明创造较佳的具体实施方式，但本发明创造的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明创造揭露的技术范围内，根据本发明创造的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明创造的保护范围之内。