罗伊氏乳杆菌LRB5及菌剂和应用

罗伊氏乳杆菌lrb5及菌剂和应用
技术领域
1.本发明涉及微生物领域，具体涉及罗伊氏乳杆菌lrb5及菌剂和应用。


背景技术：

2.目前，雄性动物的雄性不孕不育率大幅度提高，主要是因为雄性生殖系统更容易受环境因素的影响。然而现在还没有良好的方法改善精液品质从而治疗雄性不孕不育。近年来研究发现肠道菌群与人及其他动物的健康息息相关，然而肠道菌群与雄性生殖轴的关系还没有确认，虽然已经有研究发现肠道菌群混合物可以改变雄性动物的精液品质，有益的肠道有益菌群可以改善动物的精液品质，但是还没有报道具体是哪种有益菌可以起到改善动物精液品质，提高雄性动物繁殖力，也没有任何文献公开哪种具体的肠道菌可以提高雄性繁殖力。现有罗伊氏乳杆菌 atcc pta 6475主要是可以增加动物睾丸中间质细胞的数目，增加睾酮的含量，也提高了精子浓度和活力。但是未表明可以提高精子的顶体完整性、降低精子畸形率，也没有表明可以提高受精能力、动物的怀孕率和产活仔数。而提高动物的精子活力、精子浓度不代表一定能够提高动物的繁殖力。影响动物繁殖力的因素很多，包括精子浓度、精子活力、精子顶体完整性、精子畸形率、精子受精能力以及动物身体的一些生理机能（比如体能等）。申请人之前的研究发现板栗多糖可以提高动物的精子活力和精子浓度但是不能提高动物的繁殖力。许多研究发现类似的结果。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)b5。
4.本发明的另一目的是提供包含上述罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)b5的菌剂。
5.本发明的另一目的是提供上述罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)b5的应用。
6.本发明的罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)b5，该菌株于2022年 7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为罗伊氏乳杆菌lactobacillus reuteri，保藏编号为cgmcc no.25324。
7.本发明提供含有罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)b5的菌剂，所述菌剂可以是液体菌剂或固体菌剂，采用常规技术手段、加入微生物制剂领域允许的辅料制备得到。
8.本发明提供了罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)b5用于制备以下用途的制剂的用途，（1）改善肠道健康；（2）改善血液及睾丸代谢组；（3）增加雄性动物精子浓度；（4）增加雄性动物精子活力；
（5）提高雄性动物交配成功率及交配的雌性动物怀孕率；和/或（6）提高雄性动物交配的雌性动物产活仔数。
9.本发明的罗伊氏乳杆菌lrb5能在动物体内定植，并对人工胆盐、人工胃酸、人工肠液有很强的耐受力。本发明的罗伊氏乳杆菌lrb5可以改善肠道健康，提高肠道免疫力，增加雄性动物精子活力、浓度、怀孕率、产活仔数；该菌株能改善动物机体代谢，增加有益的代谢产物，从而增加睾丸有益代谢产物如视磺酸（调控精子发生的起始），从而提高雄性动物的精子质量和繁殖力。同一种菌的不同株系之间的差异很大，通过重测序，发现本发明中lrb5的基因序列和已知的罗氏乳杆菌ll7有很多突变位点，87%以上的位点突变。本发明分离培养的15株罗氏乳杆菌中只有1株lrb5具有提高精液品质和繁殖力的功效，其他的菌株没有这种功效。
附图说明
10.图1为本发明的罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)b5的生长曲线(mrs培养基)；图2显示本发明实施例2中试验小鼠在试验周期35天体重变化情况；图3显示本发明实施例2中试验小鼠的精子浓度；图4显示本发明实施例2中试验小鼠的精子活力；图5显示本发明实施例2中试验小鼠的精子顶体完整性；图6显示本发明实施例2中试验小鼠的精子顶体畸形率；图7显示本发明实施例2中试验小鼠的怀孕率；图8显示本发明实施例2中试验小鼠的产活仔数；图9显示本发明实施例3中试验公猪的采精量；图10显示本发明实施例3中试验公猪精子的浓度；图11显示本发明实施例3中试验公猪精子的活力；图12显示本发明实施例3中试验公猪精子的顶体完整性；图13显示本发明实施例3中试验公猪精子的畸形率；图14显示本发明实施例4中试验公山羊精子的浓度；图15显示本发明实施例4中试验公山羊精子的活力；图16显示本发明实施例4中试验公山羊精子的顶体完整性；图17显示本发明实施例4中试验公山羊精子的畸形率。
11.本发明的罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)b5菌株，分类命名为罗伊氏乳杆菌lactobacillus reuteri，该菌株于2022年 7月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为cgmcc no.25324。
具体实施方式
12.本发明验证了罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)b5（缩写为lrb5）对雄性动物繁殖力的有益作用，以白消安（busulfan）建立小鼠弱精、少精症模型，发现该菌株能够提高精子浓度、活力、顶体完整性，降低精子畸形率，提高雄鼠与正常雌鼠交配的成功率，交配
后母鼠的怀孕率、产活仔数。夏季高温高湿会导致公猪、公羊精液品质下降，从而导致母猪、母羊怀孕率和产活仔数减少，可以提高夏季高温高湿状态下公猪和公羊的精子浓度和活力、顶体完整性，降低精子畸形率。
13.实施例1罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)b5的分离1、菌株分离：罗伊氏乳杆菌lactobacillus reuteri分离自肠道内容物。取肠道内容物，用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，吸取合适稀释度的稀释液0.1ml在blb琼脂上均匀涂布，37
°
c培养48h后， 将生长出的菌落通过平板划线接种到新的blb固体培养基进行纯化培养48h。
14.2、菌株富集：将纯化培养后的菌株，在无菌操作台上用接种环逐一接种到无菌mrs肉汤培养基中，置于摇床中，37
°
c培养48h后进行16s rrna鉴定，并将剩余部分与含有25%甘油的生理盐水混合，保存至-80
°
c冰箱。
15.3、16s rrna鉴定：将富集后的菌液，使用细菌通用引物进行菌落pcr扩增后, 送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行16s rdna测序鉴定，在ncbi上将各个菌株的16s rdna序列与数据库中所有已测定细菌的16s rdna序列进行比对，其中发现有6株与罗伊氏乳杆菌lactobacillus reuteri hku 070513的16s rdna 序列的同源相似性最高，相似度大于或等于99.8%，确定这6株菌种类别为罗伊氏乳杆菌lactobacillus reuteri。
16.实施例2 罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)b5的特性检测1、罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)b5的微生物学特性如下：（1）菌落形态：圆形单菌落，直径大约1~2mm，乳白色，不透明，菌落表面光滑有微微的凸起，边缘是规则的；（2）染色后细菌形态呈现短杆状，无鞭毛，不能运动；（3）生长特性：在mrs液体培养基中，置于37
°
c摇床培养，5小时后开始进入对数生长期，14h进入平台期，最大活菌数为3.1
×
108cfu/ml。在lbl液体培养基中，置于37
°
c摇床培养，4小时后开始进入对数生长期，12h进入平台期，最大活菌数为3.15
×
108cfu/ml。
17.2、耐胆盐检测将已活化并且菌液浓度在1
×
108cfu/ml的菌液，分别取1ml接种到9ml含猪胆盐浓度为0.3g/100ml的无菌生理盐水中，1h后采用平板涂布法测定活菌数。
18.结果显示（表1），在0.3g/100ml的胆盐浓度下，与其它5株罗伊氏乳杆菌比较，lrb5具有最好的耐胆盐能力，存活率在21.23%左右。
19.表1罗伊氏乳杆菌在强胆盐0.3%浓度下的存活率%
20.3、耐人工胃液检测将已活化并且菌液浓度在1
×
108cfu/ml的菌液，分别取1ml接种到9ml ph=1.5的
人工胃液中，1h后采用平板涂布法测定活菌数。
21.结果显示（表2），在ph=1.5的人工胃液1h后，与其它5株罗伊氏乳杆菌比较， lrb5具有最好的耐人工胃液能力，存活率在 20.42%左右。
22.表2罗伊氏乳杆菌在ph=1.5的人工胃液中的存活率%
23.4、耐人工肠液检测将已活化并且菌液浓度在1
×
108cfu/ml的菌液，分别取1ml接种到9ml ph=6.8的人工胃液中，4h后采用平板涂布法测定活菌数。
24.结果显示（表3），在人工肠液4h后，与其它5株罗伊氏乳杆菌比较，lrb5具有最好的耐人工肠液能力，存活率在21.56%左右。
25.表3罗伊氏乳杆菌在人工肠液的存活率%
26.实施例3罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)b5对白消安模型雄性小鼠繁殖力的影响确定罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)b5菌株具有最好的益生特性，保留罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)b5菌株用于后续实验。
27.一、实验方法1、选取100只21日龄的icr雄性小鼠，饲养于中国农业科学院动物科学研究所动物中心。试验过程中，将鼠房的温度控制在22
±
2℃，光照/黑暗时间为12小时，并自由取食和饮水。
28.2、将所有小鼠随机分为5组（每组20只小鼠）：对照组（con组），白消安组（b组），b lrb5(10^6)组，b lrb5(10^8)组，b lrb5(10^10)组。con组：在试验过程中，每天灌胃一次0.1ml的生理盐水，为期14天；b组：在试验过程中，每天灌胃一次0.1ml的生理盐水，为期14天；b lrb5(10^6)组：在试验过程中，每天灌胃一次0.1ml浓度为1
×
106cfu/ml的菌液，为期14天；b lrb5(10^8)组：在试验过程中，每天灌胃一次0.1ml浓度为1
×
108cfu/ml的菌液，为期14天；b lrb5(10^10)组：在试验过程中，每天灌胃一次0.1ml浓度为1
×
10
10
cfu/ml的菌液，为期14天。然后所有小鼠正常饲养21天（3周），不做任何处理，试验过程中，每天测量小鼠体重，观察并记录小鼠的状态，存活情况，有无临床异常症状等。总计35天后（14天 21天），第36天，每组随机选取10只小鼠，收集样品进行分析。每组剩余的10只小鼠与正常母鼠交配，每只公鼠与2只母鼠交配，交配4天。交配4天后母鼠单笼饲养，公鼠收样检测分析。交配21天后统计母鼠怀孕率，产活仔数。
29.二、检测指标1、试验期间，每2天统计小鼠体重一次；2、测量公鼠精子浓度、活力、顶体完整性、畸形率；3、交配21天后统计母鼠的怀孕率、产活仔数；4、并检测公鼠的血液指标和睾丸代谢物。
30.三、实验结果1、生长情况：整个试验中小鼠生长变化情况如图2所示，白消安导致小鼠体重增长变慢，从处理的第5天白消安组（b）的体重要低于对照组，而且一直到实验结束，白消安组体重显著低于对照组，而白消安处理后饲喂lrb5的3个组的体重要高于白消安组；2、精子浓度：如图3所示，白消安模型组小鼠的精子浓度远远低于对照组，白消安处理后饲喂lrb5的3个组的精子浓度远远高于白消安组，几乎达到对照组的水平。
31.3、精子活力：如图4所示，白消安模型组小鼠的精子活力远远低于对照组，白消安处理后饲喂lrb5的3个组的精子活力远远高于白消安组，几乎达到对照组的水平；4、精子顶体完整性：如图5所示，白消安模型组小鼠的精子顶体完整性变差，远远低于对照组，白消安处理后饲喂lrb5的3个组的精子顶体完整性远远高于白消安组，几乎达到对照组的水平；5、精子畸形率：如图6所示，白消安模型组小鼠的精子畸形率远远高于对照组，白消安处理后饲喂lrb5的3个组的精子畸形率远远低于白消安组，与对照组的水平相当。
32.6、怀孕率：如图7所示，白消安模型组小鼠与正常母鼠交配后的怀孕率远远低于对照组，白消安处理后饲喂lrb5的3个组的小鼠与正常母鼠交配后的怀孕率远远高于白消安组，几乎达到对照组的水平；7、产活仔数：如图8所示，白消安模型组小鼠与正常母鼠交配后，母鼠产活仔数远远少于对照组，白消安处理后饲喂lrb5的3个组的小鼠与正常母鼠交配后，母鼠产活仔数远远多于白消安组，几乎达到对照组的水平。
33.8、另外，对处理后的公鼠的血液和睾丸代谢物分析发现，白消安增加了血液及睾丸中有害代谢物，减少有益代谢物。而白消安处理后饲喂lrb5增加血液及睾丸有益代谢物如谷胱甘肽、视磺酸及总还原能力等。
34.实施例4罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)b5对公猪精液品质的影响一、实验方法选用公猪站里健康公猪40头（2 ~ 3岁）,体重大约300公斤（kg）。所有公猪分别被圈养在封闭的猪舍内，并提供商品饲料和自由饮水。猪圈环境保持清洁、通风，并定期消毒。实验在夏季的7，8月份。
35.所有公猪被随机分为4个组：对照组（con）；lrb5(10^9)组；lrb5(10^12)组；lrb5(10^15)组；每组10头公猪。con组：饲喂商用饲料；lrb5(10^9)组：饲喂商用饲料 109cfu/头/天lrb5；lrb5(10^12)组：饲喂商用饲料 10
12
cfu/头/天lrb5；lrb5(10^15)组：饲喂商用饲料 10
15
cfu/头/天lrb5；lrb5饲喂两周（14天），然后所有组饲喂商用饲料56天（总实验周期70天），每天饲喂2次，定量饲喂。试验过程中，观察并记录公猪的状态。70天后收取公猪精液，并测试分析。
36.二、检测指标
1、试验期间，每天统计公猪的体征；2、第71天开始检测公猪的精液品质。
37.三、实验结果1、采精量：如图9所示，饲喂lrb5的3个组的采精量多于对照组；2、精子浓度：如图10所示，饲喂lrb5的3个组的精子浓度高于对照组；3、精子活力：如图11所示，饲喂lrb5的3个组的精子活力高于对照组；4、精子顶体完整性：如图12所示，饲喂lrb5的3个组的精子顶体完整性高于对照组；5、精子畸形率：如图13所示，饲喂lrb5的3个组的精子畸形率低于对照组。
38.实施例5罗伊氏乳杆菌lrb5对公山羊精液品质的影响一、实验方法选用健康公山羊40只（2 ~ 3岁），体重大约100公斤（kg）。所有山羊分别被圈养在封闭的羊舍内，并提供商品饲料（精料和草料）和自由饮水。羊圈环境保持清洁、通风，并定期消毒。实验在夏季的7，8月份。
39.所有公山羊被随机分为4个组：对照组（con）；lrb5(3
◊
10^8)组；lrb5(3
◊
10^11)组；lrb5(3
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10^14)组；每组10只公山羊。con组：饲喂商品饲料；lrb5(3
◊
10^8)组：饲喂商用饲料 3
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108cfu/头/天lrb5；lrb5(3
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10^11)组：饲喂商用饲料 3
◊
10
11
cfu/头/天lrb5；lrb5(3
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10^14)组：饲喂商用饲料 3
◊
10
14
cfu/头/天lrb5；lrb5饲喂两周（14天），然后所有组饲喂商用饲料56天（总实验周期70天），定量饲喂。试验过程中，观察并记录公山羊的状态。70天后收取公羊精液，并测试分析。
40.二、检测指标1、试验期间，每天统计公羊的体征；2、第71天开始检测公羊的精液品质。
41.三、实验结果1、精子浓度：如图14所示，饲喂lrb5的3个组的精子浓度高于对照组；2、精子活力：如图15所示，饲喂lrb5的3个组的精子活力高于对照组；3、精子顶体完整性：如图16所示，饲喂lrb5的3个组的精子顶体完整性高于对照组；4、精子畸形率：如图17所示，饲喂lrb5的3个组的精子畸形率低于对照组。
42.与同属种的罗伊氏乳杆菌相比，lrb5最大的优势是具有提高动物繁殖性能的特性。而且在人工胆盐、人工胃酸、人工肠液耐受能力强。
43.以上实施例仅用于解释本技术的技术方案，不限定本技术的保护范围。