表面链结标靶多肽的类病毒颗粒及其用途的制作方法

1.本发明涉及一种表面链结标靶多肽的类病毒颗粒。


背景技术：

2.人类jc多瘤性病毒(human jc polyomavirus,jcpyv)的类病毒颗粒(virus-like particles, vlps)作为基因治疗的载体，可依据所携带的不同基因进入人体细胞而进行不同的治疗策 略。先前的研究指出，若jcpyv vlps携带表达rna干扰(rna interference,rnai)机制 的质粒dna，除了可抑制细胞内的病毒基因的表达，更可进一步抑制病毒的复制。除此之 外，jcpyv vlps若携带自杀基因，则能够于实验动物模式中成功地抑制大肠直肠肿瘤、弥 漫性大型b细胞淋巴瘤、膀胱肿瘤、肺腺癌、胶质母细胞瘤以及摄护腺肿瘤的生长，而这 也意味着jcpyv vlps在肿瘤基因治疗领域中是具有潜在的实用性的。
3.然而，为了降低患者因肿瘤基因治疗而产生副作用的可能性，用于癌症基因治疗领域 的jcpyv vlps其精准度仍须有所提升。


技术实现要素：

4.因此，本发明的目的即在提供一种表面链结标靶多肽的类病毒颗粒，可以精准且确实 地将所携带的异源核酸递送至特定肿瘤细胞表达，从而抑制该特定肿瘤细胞的生长。
5.本发明为解决现有技术的问题所采用的技术手段提供一种人类jc病毒的类病毒颗粒， 用于将异源核酸递送至人体，包含：主要衣壳蛋白vp1，其氨基酸序列如seq id no：1 所示；标靶多肽，链结于该人类jc病毒的类病毒颗粒的表面，用以特异性辨识特定肿瘤细 胞；以及表达质粒，带有该异源核酸，其中，该标靶多肽为特异性辨识该特定肿瘤细胞， 从而引导该人类jc病毒的类病毒颗粒将该异源核酸递送至该特定肿瘤细胞表达。
6.在本发明的一实施例中提供一种人类jc病毒的类病毒颗粒，该表达质粒系用以表达自 杀基因。
7.在本发明的一实施例中提供一种人类jc病毒的类病毒颗粒，该表达质粒系用以表达小 发夹rna。
8.在本发明的一实施例中提供一种人类jc病毒的类病毒颗粒，该标靶多肽特异性辨识的 该特定肿瘤细胞选自：大肠直肠肿瘤、弥漫性大型b细胞淋巴瘤、膀胱肿瘤、肺腺癌、胶 质母细胞瘤以及摄护腺肿瘤。
9.在本发明的一实施例中提供一种人类jc病毒的类病毒颗粒用于制备抑制大肠直肠肿瘤、 弥漫性大型b细胞淋巴瘤、膀胱肿瘤、肺腺癌、胶质母细胞瘤以及摄护腺肿瘤的生长的医 药组成物的用途。
10.经由本发明所采用的技术手段，本发明的该表面链结标靶多肽的类病毒颗粒得以精准 且确实地将所携带的异源核酸递送至该特定肿瘤细胞表达，进而有效地抑制该特定肿瘤细 胞的生长。
附图说明
11.图1a为显示根据本发明的第一实施例的不同浓度的该标靶多肽以及空白对照组结合至 ht1376细胞(膀胱肿瘤细胞)后的荧光染色图。
12.图1b为显示根据本发明的实施例的该标靶多肽以及空白对照组的竞争结合试验的荧光 染色图。
13.图2a为显示根据本发明的实施例的不同浓度的该表面链结标靶多肽的类病毒颗粒以及 空白对照组结合至ht1197细胞(膀胱肿瘤细胞)后的荧光染色图。
14.图2b为显示根据本发明的实施例的不同浓度的该表面链结标靶多肽的类病毒颗粒以及 空白对照组结合至ht1376细胞(膀胱肿瘤细胞)后的荧光染色图。
15.图2c为显示根据本发明的实施例的不同浓度的该表面链结标靶多肽的类病毒颗粒以及 空白对照组结合至a549细胞(人类肺癌细胞株)后的荧光染色图。
16.图2d为显示根据本发明的实施例的不同浓度的该表面链结标靶多肽的类病毒颗粒以及 空白对照组结合至imr32细胞(胶质母细胞瘤)后的荧光染色图。
17.图3为显示根据本发明的实施例的不同浓度的该表面链结标靶多肽的类病毒颗粒搭配 gcv、不同浓度的表面尚未链结有该标靶多肽的类病毒颗粒搭配gcv、空白对照组以及其他 不同条件的对照组，于a549细胞、imr32细胞、ht1197细胞以及ht1376细胞造成的细胞 毒杀试验结果的直方图。
18.图4a为显示根据本发明的实施例的不同浓度的该表面链结标靶多肽的类病毒颗粒搭配 gcv、控制组以及其他不同条件的对照组，分别注射于先前已异种移植a549细胞以及ht1376 细胞的小鼠模式后的平均肿瘤重量直方图。
19.图4b为显示根据本发明的实施例的不同浓度的该表面链结标靶多肽的类病毒颗粒搭配 gcv、控制组以及其他不同条件的对照组，分别注射于先前已异种移植a549细胞以及ht1376 细胞的小鼠模式后的实体肿瘤对照图。
具体实施方式
20.以下根据图1a至图4b，而说明本发明的实施方式。该说明并非为限制本发明的实施方 式，而为本发明的实施例的一种。依据本发明的一实施例的一种人类jc病毒的类病毒颗粒， 用于将异源核酸递送至人体，包含：主要衣壳蛋白vp1，其氨基酸序列如seq id no：1所 示；标靶多肽，链结于该人类jc病毒的类病毒颗粒的表面，用以特异性辨识特定肿瘤细胞； 以及表达质粒，带有该异源核酸，其中，该标靶多肽为特异性辨识该特定肿瘤细胞，从而引 导该人类jc病毒的类病毒颗粒将该异源核酸递送至该特定肿瘤细胞表达。
21.详细而言，在本说明书中所示的实施例所采用的该标靶多肽，具备能够对膀胱肿瘤细胞 有特异性辨识的能力。而本发明的该标靶多肽通过噬菌体展示技术(phage display)得之。噬 菌体展示技术利用重组基因方式改变噬菌体外壳基因，使其外壳蛋白可表达不同序列的短片 段多肽，并以此建立一数据库(library)，反复于正常细胞以及各种肿瘤细胞之间做亲和力验 证，而筛选出可特异性辨识特定肿瘤细胞的多肽。因此，本发明的该标靶多肽除了如本说明 书中的实施例所示能够特异性辨识膀胱肿瘤细胞外，亦可利用噬菌体展示技术针对其他不同 种肿瘤细胞筛选出能够特异性辨识该肿瘤细胞的标靶多肽，进而得以制备出表面链结该标靶 多肽的类病毒颗粒。
22.细胞株：
23.本说明书所示的实施例中所使用的所有细胞株(即，人类膀胱癌细胞株ht1197、人类膀 胱癌细胞株ht1376、人类肺癌细胞株a549以及胶质母细胞瘤imr32)皆购自生物资源保存 及研究中心(bioresource collection and research center，taiwan，china)。
24.依据本发明的实施例的一种人类jc病毒的类病毒颗粒，其中该标靶多肽特异性辨识的该 特定肿瘤细胞选自：大肠直肠肿瘤、弥漫性大型b细胞淋巴瘤、膀胱肿瘤、肺腺癌、胶质母 细胞瘤以及摄护腺肿瘤。
25.标靶多肽结合特定肿瘤细胞试验：
26.本说明书所示的实施例中的所有该标靶多肽，其氨基酸序列如seq id no：2所示，能 够特异性辨识膀胱肿瘤细胞。为方便随后的详细说明，该标靶多肽于本说明书中的实施例简 称为spb。该标靶多肽为委托巨生实业有限公司以完整的氨基酸序列或是在n端加上tamra 分子，进行该标靶多肽的合成。合成过程最终分别取得不含有tamra分子的spb(通称为 冷多肽，cold peptides)，以及含有tamra分子的spb(spb-tamra，通称为热多肽，hotpeptides)。
27.先将1mm spb-tamra稀释成20μm、50μm以及100μm并放在-20℃保存。在24孔盘 放入经过酒精过火杀菌的圆形盖玻片，并加入3x 104细胞数的ht1376细胞，在37℃培养箱 培养24小时。接着将24孔盘从培养箱取出，放到4℃，10分钟，吸出培养液，再用4℃的pbs 冲洗两次，再分别加入浓度为20μm、50μm以及100μm的spb-tamra，以及用4℃的pbs 处理作为空白对照组，放在4℃培养30分钟之后，用4℃的pbs冲洗三次。其中，tamra分 子能够发出红色荧光。在载玻片上加一滴含有0.1％dapi荧光染剂的覆盖溶液(moutingsolution)，其中，dapi针对细胞核染色，能够发出蓝色荧光。接着将盖玻片以细胞面朝下 进行封片，再以共轭焦显微镜(olympus，fluoview 1200)进行观察。
28.参照图1a，在空白对照组中，由于并未加入spb-tamra，因此并未看到红色荧光。此 外，可以观察到的红色荧光随着所加入的spb-tamra的浓度成正比的递增。此结果显示 spb具有辨识并结合至膀胱肿瘤细胞的能力。
29.竞争结合试验：
30.在24孔盘放入经过酒精过火杀菌的圆形盖玻片，并加入3x 104细胞数的ht1376细胞， 在37℃培养箱培养24小时。取出培养盘，放到4℃，10分钟，吸出培养液，再用4℃的pbs 冲洗两次，接着使用浓度分别为0.002μm、0.02μm、0.2μm、2μm、20μm以及200μm的 spb(于图1b中简称为c)与20μm的spb-tamra(于图1b中简称为h)同时处理ht1376 细胞，正向控制组(positive control)则是使用4℃的pbs与20μm的spb-tamra同时处 理ht1376细胞，空白对照组则是只有用4℃的pbs处理ht1376细胞，然后将每种处理组 别，放在冰上的铁盘上培养30分钟之后，用4℃的pbs冲洗三次，随后再以共轭焦显微镜 观察。
31.参照图1b，可以观察到随着spb浓度的增加，所检测到的红色荧光信号遂随之减弱，而 此结果亦证实了spb具有针对膀胱肿瘤细胞进行特异性结合的能力。
32.依据本发明的实施例的一种人类jc病毒的类病毒颗粒，其中该表达质粒系用以表达自杀 基因。
33.依据本发明的实施例的一种人类jc病毒的类病毒颗粒，其中该表达质粒系用以表达小发 夹rna。
34.制备表面链结标靶多肽的类病毒颗粒spb-vlp：
35.详细而言，jcpyv主要病毒蛋白表达质粒δpflag-vp1(其核苷酸序列为seq id no:3 所示的核苷酸序列)可于大肠杆菌中表达主要衣壳蛋白vp1，其氨基酸序列为seq id no： 1所示的氨基酸序列，所表达的主要衣壳蛋白vp1能够自行组装成vlps。经由主要衣壳蛋白 vp1自行组装而成的vlps用于包装带有异源核酸的表达质粒。在本说明书的实施例中，该 表达质粒为hsv-tk基因的表达质粒pumvc1-tk(aldevron,fargo,nd,usa)，其核苷酸序列 为seq id no:4所示的核苷酸序列，其所带有的该异源核酸为人类第一型单纯疱疹病毒胸腺 嘧啶激酶基因(human herpes simplex virus type 1thymidine kinase,hsv-tk)，也就是自杀基 因。当然，本案的该表达质粒所表达的基因并不以此为限，该表达质粒亦可用于表达小发夹 rna或是其他用于作为肿瘤基因治疗的相关异源核酸。
36.δpflag-vp1带有ampicillin抗药性，而pumvc1-tk带有kanamycin抗药性。将δpflag-vp1 及pumvc1-tk转形至胜任细胞(jm109)中。值得注意的是，δpflag-vp1所表达的主要衣 壳蛋白vp1于自行组装成vlps的同时，会将同时存在于胜任细胞中的pumvc1-tk包装入 vlps当中。将δpflag-vp1及pumvc1-tk转形至胜任细胞(jm109)后，添加抗生素ampicillin 及kanamycin以进行筛选。而后进行pcr以确认两种质粒同时存在于胜任细胞中。之后，vlp 的纯化以及表达如参考文献(lin,m.c.,wang,m.,fang,c.y.,chen,p.l.,shen,c.h.andchang,d.(2014)antiviral res.103,25
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31)所述。
37.使用sulfo-smcc交联剂(thermo fisher scientific)，将spb与vlp结合，以形成spb-vlp。 将1ml vlp(1mg/ml)加入40ul sulfo-smcc交联剂(4.8mg/ml)，置于室温反应30分钟。再 以脱盐管柱(desalting column)(zeba spin desalting column,7k mwco)移除过量的交联 剂。将结合上交联剂的vlp加入100ul spb-tamra(1mm)，置于室温反应30分钟。其中， 为方便之后的实验进行及观察，因此所加入的spb是含有tamra分子的spb(即， spb-tamra)。随后再以脱盐管柱移除过量的spb-tamra，即得到spb-vlp。
38.本发明的实施例的spb-vlp对于膀胱肿瘤细胞的特异性辨识及结合试验：
39.a549、imr32、ht1197及ht1376细胞个别培养于内置盖玻片的24孔培养盘，分别加 入1、3或10ug/ml spb-vlp或pbs，置于37℃，作用20分钟，之后以pbs清洗三次。在 载玻片上加一滴含有0.1％dapi荧光染剂的覆盖溶液，接着将盖玻片以细胞面朝下进行封片， 再以荧光显微镜(carl zeiss,thomwood,ny)观察。
40.首先请参照图2a至图2b，ht1197细胞以及ht1376细胞皆为人类膀胱癌细胞株，而如前 所述，本说明书所示的实施例中的所有该标靶多肽为能够特异性辨识膀胱肿瘤细胞，因此 能够成功观察到spb-vlp因为spb的引导而特异性结合上ht1197以及ht1376细胞所发出 的红色荧光信号。而此结果证实了本发明的实施例的spb-vlp对于膀胱肿瘤细胞具有特异 性辨识及结合的能力。
41.再者，参照图2c至图2d，由于a549细胞以及imr32细胞皆非膀胱肿瘤细胞(a549细胞 为人类肺癌细胞株，而imr32细胞为胶质母细胞瘤)，因此无法被本实施例的该标靶多肽spb 所辨识并结合，遂而无法检测到由tamra分子所发出的红色荧光信号，而仅能观察到针对 细胞核染色的dapi荧光染剂所发出的蓝色荧光信号。而此结果亦更加证实了本发明的实施 例的spb-vlp对于膀胱肿瘤细胞具有特异性辨识及结合的能力。
42.恶性肿瘤的自杀基因治疗是一种被认为有潜力的癌症治疗方法。它是先将治疗基
因 (therapeutic genes)递送到肿瘤细胞中，此基因随后表达出对应序列的蛋白酵素，其可将外 加的无毒性前驱化合物转变成有毒的化合物，进而杀死或是抑制肿瘤细胞的生长。本说明书 中所示的实施例采用hsv-tk自杀基因，hsv-tk的表达让肿瘤细胞对抗病毒药物敏感，而 ganciclovir(gcv)是其中一例，其为上述的其中一种前驱化合物，为核苷酸类似物。
43.详细而言，hsv-tk自杀基因所表达出的人类第一型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(hsv-tk) 可以磷酸化前驱药物gcv，被加上磷酸根的gcv，会在细胞复制时阻碍dna合成的路径， 使细胞走向凋亡(apoptosis)。肿瘤细胞为复制生长快速的细胞，故此项策略可有效抑制肿瘤 细胞生长，而较不影响处于休眠时期或正常生长的细胞。
44.细胞毒杀试验：
45.细胞培养于96孔盘中，加入不同浓度(10、1、0.1、0.01、0.001ug/ml)的vlp(为表 面尚未链结有spb的vlp，因包装有带自杀基因的pumvc1-tk，为方便理解，因此于图3 中以tk vlp代称)或spb-vlp(于图3中以spb-tk vlp代称)，再加入20ug/ml gcv (invivogen)，置于37℃，培养72小时。以细胞计数试剂盒cell counting kit-8(cck-8； sigmma-aldrich,st.louis,mo,usa)测定自杀基因所启动的细胞毒杀效果。移除原来培养液， 加入100ul新培养液(内含10％cck-8试剂)，置于37℃，作用约30分钟，以分光亮度计在 波长450nm测定其吸光值。
46.参照图3，在a549细胞及imr32细胞中，tk vlp(10ug/ml)/gcv约可达到50％左右的 细胞毒杀率；但spb-tk vlp/gcv则无有意义的细胞毒杀效果。在膀胱癌细胞ht1197及 ht1376中，则是处理以tk vlp(10ug/ml)/gcv或spb-tk vlp(10ug/ml)/gcv皆可达50％ 左右的细胞毒杀率，甚至将spb-tk vlp的量降至1ug/ml，仍可达到约50％的细胞毒杀效果。 此结果显示，spb可有效引导tk vlp感染膀胱肿瘤细胞，以执行细胞毒杀。
47.以异种移植小鼠模式观察spb-tk vlp对膀胱癌生长的特定抑制效果：
48.此动物实验通过中山医学大学the institutional animal care and use committee审核 (permit number:2046)。饲育及实验程序完全依循通过审核的实验计划进行。四周龄雄性裸 鼠购自于中国台湾的乐斯科生物科技股份有限公司(biolasco taiwan(中国台湾)co.,ltd)， 饲育于中山医学大学动物实验中心。于鼠背的左右边皮下各植入细胞数106的a549及ht1376 细胞。一周后，随机将实验鼠分成五群:控制组，注射pbs/pbs；第二组注射pbs/gcv；第三 组注射spb-tk vlp(100ug)/pbs；第四组注射spb-tk vlp(100ug)/gcv；第五组注射spb
‑ꢀ
tk vlp(1ug)/gcv。第一天尾静脉注射100ul的pbs或是spb-tk vlp，第二天腹腔注射 gcv(300mg/kg)，第三天休息。三天一个循环，共执行12个循环。实验完成后，将实验鼠 以异氟醚(isoflurane)麻醉致死，取下肿瘤，秤重纪录。
49.参照图4a至图4b以及如下所示的表1，可以观察到spb-tk vlp/gcv对膀胱肿瘤细胞 ht1376有极佳的抑制效果，即使在spb-tk vlp减量至每次注射量仅1ug仍为有意义的抑制 效果。但此组合对于a549细胞(人类肺癌细胞株)则无抑制效果。结果显示，spb-tk vlp 表面上的spb可有效引导tk vlp感染膀胱肿瘤细胞，而在减少tk vlp的使用下，仍可发挥极 佳的治疗效果。
50.表1肿瘤重量(mg)
[0051][0052]
依据本发明的实施例的一种人类jc病毒的类病毒颗粒用于制备抑制大肠直肠肿瘤、弥漫 性大型b细胞淋巴瘤、膀胱肿瘤、肺腺癌、胶质母细胞瘤以及摄护腺肿瘤的生长的医药组成 物的用途。
[0053]
详细而言，本发明的人类jc病毒的类病毒颗粒可依据不同种类的肿瘤细胞，而将链结于 该类病毒颗粒表面的标靶多肽替换成具备特异性辨识及结合该特定肿瘤细胞的能力的标靶多 肽，从而利用该类病毒颗粒制备用于抑制大肠直肠肿瘤、弥漫性大型b细胞淋巴瘤、膀胱肿 瘤、肺腺癌、胶质母细胞瘤以及摄护腺肿瘤的生长的医药组成物。
[0054]
本案的该表面链结标靶多肽的类病毒颗粒得以精准且确实地将所携带的异源核酸递送至 该特定肿瘤细胞表达，进而有效地抑制该特定肿瘤细胞的生长。进一步而言，该标靶多肽能 够引导本发明的该类病毒颗粒精准地在该特定肿瘤细胞表达该异源核酸，而不会无差别地将 该异源核酸递送至其他非该标靶多肽所能辨识的细胞表达。因此，本发明的该表面链结标靶 多肽的类病毒颗粒，除了能够成功地抑制该特定肿瘤细胞的生长外，亦能够降低体内其他正 常、健康的细胞受到该类病毒颗粒的影响而引起的副作用发生的机率。
[0055]
以上的叙述以及说明仅为本发明的较佳实施例的说明，对于本领域技术人员当可依据 以上权利要求书以及上述的说明而作其他的修改，只是这些修改仍应是为本发明的发明精 神而在本发明的保护范围中。