小粒径纳米细胞膜囊泡、制备方法、组合物及试剂盒

1.本技术涉及细胞膜囊泡技术领域，尤其涉及一种小粒径纳米细胞膜囊泡、制备方法、组合物及试剂盒。


背景技术：

2.虽然传统纳米技术可以提高药物的靶向性和缓释性、延长半衰期和降低毒副作用，但纳米颗粒易被机体免疫系统识别而清除。近年来，基于机体循环系统中各种仿生的新型药物递药系统逐渐成为生命科学领域的研究热点。其中，作为生物体内的固有细胞成分的细胞膜及其囊泡作为一类新兴的生物材料和治疗药物递送系统引起了研究者极大的关注。为使纳米级细胞囊泡更好的发挥诊断和治疗作用，需要对其结构和功能进行一定的修饰设计，以减少在肝脏或脾脏中积累，提高对靶组织的靶向性，使药物递送及治疗过程具有一定的可控性。在细胞囊泡的设计上，粒径是一个极其重要的需要考虑的因素。不同粒径的细胞囊泡在血液循环过程、组织渗透及保留过程、代谢过程等方面均具有显著差异。物理挤压的方式是获得纳米级细胞膜囊泡最常用的方法，但是这种传统物理挤压的方式所获得的纳米级细胞膜囊泡如图1所示，通过1000nm、400nm、200nm、100nm、50nm聚碳酸酯膜进行机械挤压获得的细胞膜囊泡的粒径始终维持在100nm以上，静脉注射后在血液循环中易被肝脾等器官捕获而难以有效到达目标组织器官，即使皮下注射也会因为粒径较大而长期滞留在注射部位，不易引流至淋巴结等免疫器官。


技术实现要素：

3.本技术提供了一种小粒径纳米细胞膜囊泡、制备方法、组合物及试剂盒，以至少解决现有技术中存在的以上技术问题。
4.根据本技术实施例的第一方面，提供了一种小粒径纳米细胞膜囊泡，所述小粒径纳米细胞膜囊泡通过α螺旋多肽修饰纳米细胞膜囊泡获得，所述小粒径纳米细胞膜囊泡的粒径小于100nm。
5.在一可实施方式中，所述α螺旋多肽为r4f，所述r4f的氨基酸序列包含faekfkeavkdyfakfwd。
6.在一可实施方式中，所述纳米细胞膜囊泡为具有双层磷脂结构的细胞胞外囊泡。
7.在一可实施方式中，所述小粒径纳米细胞膜囊泡带有负电荷。
8.根据本技术实施例的第二方面，提供了一种小粒径纳米细胞膜囊的制备方法，所述方法包括：将纳米细胞膜囊泡分散于缓冲液中，获得纳米细胞膜囊泡分散液；将α螺旋多肽溶解于缓冲液中，获得α螺旋多肽溶液；将α螺旋多肽溶液与纳米细胞膜囊泡分散液混匀后进行孵育，离心去除游离的α螺旋多肽，得到粒径小于100nm的小粒径纳米细胞膜囊泡。
9.在一可实施方式中，在所述将纳米细胞膜囊泡分散于缓冲液中之前，所述方法还包括：获得单细胞溶液；通过低渗处理对单细胞的细胞内成分进行释放，获得细胞成分液；对所述细胞成分液进行离心处理，获得细胞膜溶液；对所述细胞膜溶液进行反复挤压，使所
述细胞膜溶液通过不同孔径的纳米级聚碳酸酯多孔膜，获得纳米细胞膜囊泡。
10.在一可实施方式中，所述对所述细胞膜溶液进行反复挤压，使所述细胞膜溶液通过不同孔径的纳米级聚碳酸酯多孔膜，获得纳米细胞膜囊泡，包括：对所述细胞膜溶液进行超声处理；利用脂质体挤出器将超声处理的细胞膜溶液依次通过孔径逐渐减小的纳米级聚碳酸酯多孔膜，获得纳米细胞膜囊泡；所述纳米级聚碳酸酯多孔膜的孔径范围为200～1000nm。
11.在一可实施方式中，所述纳米细胞膜囊泡具有双层磷脂结构，将α螺旋多肽溶液与纳米细胞膜囊泡分散液混匀，包括：按照多肽与囊泡磷脂的摩尔比例为0.2～0.8：3将α螺旋多肽溶液与纳米细胞膜囊泡分散液混匀。
12.在一可实施方式中，所述α螺旋多肽溶液为r4f溶液，所述纳米细胞膜囊泡具有双层磷脂结构；对应的，所述将α螺旋多肽溶液与纳米细胞膜囊泡分散液混匀后进行孵育，包括：将r4f溶液滴加至纳米细胞膜囊泡分散液中，至r4f与囊泡磷脂的摩尔比例为0.4:3，获得α螺旋多肽溶液与纳米细胞膜囊泡分散液的混合溶液；将所述混合溶液孵育10～16小时，除去离心去除游离的α螺旋多肽，得到粒径小于100nm的小粒径纳米细胞膜囊泡。
13.根据本技术实施例的第三方面，提供了一种组合物，包含上述可实施方式中任一项所述的小粒径纳米细胞膜囊泡。
14.根据本技术实施例的第四方面，提供了一种试剂盒，包含上述可实施方式中任一项所述的小粒径纳米细胞膜囊泡。
15.根据本技术实施例的第四方面，提供了一种试剂盒，包含α螺旋多肽，用于制备上述可实施方式中任一项所述的小粒径纳米细胞膜囊泡。
16.本技术实施例提供的一种小粒径纳米细胞膜囊泡、制备方法、组合物及试剂盒，通过α螺旋多肽对纳米细胞膜囊泡进行修饰，使细胞膜囊泡的粒径小于100nm，能够通过“增强渗透和保留效应”实现在目标组织器官部位实现聚集，增强的滞留效果。
17.应当理解，本部分所描述的内容并非旨在标识本技术的实施例的关键或重要特征，也不用于限制本技术的范围。本技术的其它特征将通过以下的说明书而变得容易理解。
附图说明
18.通过参考附图阅读下文的详细描述，本技术示例性实施方式的上述以及其他目的、特征和优点将变得易于理解。在附图中，以示例性而非限制性的方式示出了本技术的若干实施方式，其中：
19.在附图中，相同或对应的标号表示相同或对应的部分。
20.图1示出了现有技术中机械挤压获得的红细胞膜囊泡粒径统计图；
21.图2示出了本技术实施例一种小粒径纳米细胞膜囊泡制备方法不同配比时的粒径统计图；
22.图3示出了本技术实施例一种小粒径纳米细胞膜囊泡制备方法不同配比时的电位统计图；
23.图4示出了本技术实施例一种小粒径纳米细胞膜囊泡制备方法0.4/3配比时的粒径统计图；
24.图5示出了本技术实施例一种小粒径纳米细胞膜囊泡制备方法0.4/3配比时的电
镜图；
25.图6示出了本技术实施例一种小粒径纳米细胞膜囊泡制备方法的高效液相色图。
具体实施方式
26.为使本技术的目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而非全部实施例。基于本技术中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
27.根据本技术实施例的第一方面，提供了一种小粒径纳米细胞膜囊泡，小粒径纳米细胞膜囊泡通过α螺旋多肽修饰纳米细胞膜囊泡获得，小粒径纳米细胞膜囊泡的粒径小于100nm。
28.本技术实施例提供的一种小粒径纳米细胞膜囊泡，通过α螺旋多肽对纳米细胞膜囊泡进行修饰，α螺旋多肽可以通过克服高脂质曲率将纳米细胞膜囊泡的双层磷脂纳米颗粒限制在其所需的大小，利用α螺旋多肽与磷脂结合的能力，通过自组装α螺旋多肽和纳米细胞膜囊泡，可将纳米细胞膜囊泡的粒径减小，从而获得粒径小于100nm的小粒径纳米细胞膜囊泡。小粒径纳米细胞膜囊泡在粒径小于100nm情况下，能够通过“增强渗透和保留效应”实现在目标组织器官部位实现聚集，增强的滞留效果。
29.在一可实施方式中，纳米细胞膜囊泡为具有双层磷脂结构的细胞胞外囊泡；α螺旋多肽为r4f，r4f的氨基酸序列包含faekfkeavkdyfakfwd。
30.纳米细胞膜囊泡可以通过对植物样本或动物样本进行提取获得，只需满足具有双层磷脂结构即可，具体包括但不限于：红细胞样本。当纳米细胞膜囊泡的来源为红细胞样本的情况下，由于红细胞成分简单，易于提取纳米细胞膜囊泡，方便操作。
31.为进一步理解上述实施方式，以下以红细胞和r4f为例进行具体实施方式的说明。需要理解的是，本方法的α螺旋多肽可以选择其他具有α螺旋的多肽，细胞可以选择其他具有双层磷脂结构的细胞胞外囊泡的细胞。
32.在一可实施方式中，小粒径纳米细胞膜囊泡带有负电荷。
33.通过α螺旋多肽修饰纳米细胞膜囊泡还可使得表面带有负电荷，有利于小粒径纳米细胞膜囊泡在组织间隙迁移，提高生物相容性。
34.根据本技术实施例的第二方面，提供了一种小粒径纳米细胞膜囊的制备方法，方法包括：操作101，将纳米细胞膜囊泡分散于缓冲液中，获得纳米细胞膜囊泡分散液；操作102，将α螺旋多肽溶解于缓冲液中，获得α螺旋多肽溶液；操作103，将α螺旋多肽溶液与纳米细胞膜囊泡分散液混匀后进行孵育，离心去除游离的α螺旋多肽，得到粒径小于100nm的小粒径纳米细胞膜囊泡。
35.在本方法操作中，本方法通过将纳米细胞膜囊泡和α螺旋多肽分别分散在缓冲液中，得到纳米细胞膜囊泡分散液和α螺旋多肽溶液。其中，用于分散纳米细胞膜囊泡和α螺旋多肽的缓冲液可以相同或不同，在本方法中，缓冲液选pbs。将纳米细胞膜囊泡分散液和α螺旋多肽溶液混匀后进行孵育，使α螺旋多肽对纳米细胞膜囊泡进行修饰，α螺旋多肽可以通过克服高脂质曲率将纳米细胞膜囊泡限制在其所需的大小，在孵育一段时间后，去除游离的α螺旋多肽，即可获得粒径小于100nm的小粒径纳米细胞膜囊泡。
36.在一可实施方式中，在操作101，将纳米细胞膜囊泡分散于缓冲液中之前，方法还包括：首先，获得单细胞溶液；然后，通过低渗处理对单细胞的细胞内成分进行释放，获得细胞成分液；再后，对细胞成分液进行离心处理，获得细胞膜溶液；之后，对细胞膜溶液进行反复挤压，使细胞膜溶液通过不同孔径的纳米级聚碳酸酯多孔膜，获得纳米细胞膜囊泡。
37.当单细胞溶液为红细胞溶液的情况下，本方法具体操作为：
38.首先，获得抗凝全血样本，设置离心参数为3000rpm(1731
×
g)，对抗凝全血样本离心10min，以分离红细胞层、血浆层和棕黄色层，去除血浆层和棕黄色层，保留红细胞层；
39.然后，对红细胞层进行清洗，具体的，向红细胞层中加入与红细胞层等体积预冷的pbs溶液(ph 7.4)进行混匀后，后于3000rpm离心10min，弃去上清液，重复至上清液无色，得到红细胞沉淀；
40.之后，将红细胞沉淀加入40倍预冷的0.25
×
pbs溶液置于4℃条件裂解30min，每隔10min摇匀一次，获得红细胞裂解液；
41.再后，将红细胞裂解液于14000rpm离心10min，弃去上清液，重复离心至上清液澄清，收集粉色沉淀，得到红细胞膜沉淀；
42.再后，将红细胞膜沉淀反复通过不同孔径的纳米级聚碳酸酯多孔膜，获得红细胞膜囊泡。
43.在一可实施方式中，对细胞膜溶液进行反复挤压，使细胞膜溶液通过不同孔径的纳米级聚碳酸酯多孔膜，获得纳米细胞膜囊泡，包括：首先，对细胞膜溶液进行超声处理；然后，利用脂质体挤出器将超声处理的细胞膜溶液依次通过孔径逐渐减小的纳米级聚碳酸酯多孔膜，获得纳米细胞膜囊泡；纳米级聚碳酸酯多孔膜的孔径范围为200～1000nm。
44.本方法在获得红细胞沉淀之后，将红细胞膜沉淀在冰浴超声仪中超声处理5～15min，具体的，在60w冰浴超声仪中超声处理5min,再利用脂质体挤出器使超声后的红细胞膜沉淀依次通过1000nm、800nm、400nm、200nm聚碳酸酯膜，重复10～30次，具体的，重复20次，获得红细胞膜囊泡。
45.在一可实施方式中，纳米细胞膜囊泡具有双层磷脂结构，操作103，将α螺旋多肽溶液与纳米细胞膜囊泡分散液混匀，包括：按照多肽与囊泡磷脂的摩尔比例为0.2～0.8：3将α螺旋多肽溶液与纳米细胞膜囊泡分散液混匀。
46.根据实验，本技术根据r4f与纳米红细胞膜囊泡的磷脂以0.1:3、0.2:3、0.4:3、0.8:3的不同摩尔比例对r4f溶液与纳米红细胞膜囊泡分散液进行混匀孵育，对得到的小粒径纳米细胞膜囊泡进行检测，检测结果如图2和图3所示。
47.当多肽与囊泡磷脂的摩尔比例为0.2～0.8：3的情况下，小粒径纳米细胞膜囊泡的粒径为至少小于81nm，具体的，当多肽与囊泡磷脂的摩尔比例为0.1:3的情况下，小粒径纳米细胞膜囊泡的粒径为111nm；当多肽与囊泡磷脂的摩尔比例为0.2:3的情况下，小粒径纳米细胞膜囊泡的粒径为81nm；当多肽与囊泡磷脂的摩尔比例为0.4:3的情况下，小粒径纳米细胞膜囊泡的粒径为55nm；当多肽与囊泡磷脂的摩尔比例为0.8:3的情况下，小粒径纳米细胞膜囊泡的粒径为71nm。在图3中，多肽与囊泡磷脂的摩尔比例为0.1:3、0.2:3和0.4:3的情况下，小粒径纳米细胞膜囊泡的电位差小于0.001，无显著性差异。当多肽与囊泡磷脂的摩尔比例为0.2～0.8：3之间的情况下，小粒径纳米细胞膜囊泡进行带负电荷，负电荷具体范围介于-15～-5。
48.在一可实施方式中，α螺旋多肽溶液为r4f溶液，纳米细胞膜囊泡具有双层磷脂结构；对应的，将α螺旋多肽溶液与纳米细胞膜囊泡分散液混匀后进行孵育，包括：将r4f溶液滴加至纳米细胞膜囊泡分散液中，至r4f与囊泡磷脂的摩尔比例为0.4:3，获得α螺旋多肽溶液与纳米细胞膜囊泡分散液的混合溶液；将混合溶液孵育10～16小时，除去离心去除游离的α螺旋多肽，得到粒径小于100nm的小粒径纳米细胞膜囊泡。
49.进一步的，参见图4和图5，当多肽与囊泡磷脂的摩尔比例为0.4：3的情况下，得到的纳米细胞膜囊泡中，粒径介于10～100nm的小粒径纳米细胞膜囊泡的含量占总纳米细胞膜囊泡80％左右，具有较高的得率。
50.进一步的，本方法对一种小粒径的纳米红细胞膜囊泡上α螺旋多肽r4f检测。
51.具体检测方法如下：
52.首先，将合成的0.5ml的小粒径纳米红细胞膜囊泡溶液加入甲醇定量至1ml，涡旋混合3min。
53.然后，以14000rpm、4℃离心10min，取上清液进行测定。
54.色谱条件：流动相：a相：0.1％tfa(三氟乙酸)水溶液、b相：0.1％tfa(三氟乙酸)乙腈。
55.洗脱程序：1～25min 10％～90％b相，25～28min 90％～10％b相，28～30min保持10％b相，洗脱程序共30min。
56.进样量：20μl、流速：1.0ml/min、柱温：30℃、检测波长：220nm。
57.检测结果参见图6，为r4f标准溶液和remv溶液的高效液相色图，可知，小粒径纳米红细胞膜囊泡溶液上具有r4f，即r4f已经对小粒径纳米红细胞膜囊泡进行修饰。
58.为方便上述实施方式的进一步理解，以下提供一种整体实施场景进行说明。
59.首先，制备纳米红细胞膜囊泡，包括如下步骤：
60.(1)将抗凝全血样品经3000rpm(1731
×
g)离心10min，以分离红细胞层、血浆层和棕黄色层，以去除血浆层和棕黄色层，保留下层红细胞层，加入等体积预冷的pbs溶液(ph 7.4)清洗，清洗步骤为，混匀后于3000rpm离心10min，弃上清液，重复清洗三次，至上清无色，得到红细胞沉淀。
61.(2)将得到红细胞沉淀加入40倍预冷的0.25
×
pbs溶液置于4℃条件裂解30min，裂解过程中，每隔10min摇匀一次，然后，14000rpm离心10min弃上清液，重复离心多次，直到上清液澄清为止，收集粉色沉淀，得到红细胞膜。
62.(3)将红细胞膜在60w的冰浴超声仪中超声处理5min，再依次通过1000nm、800nm、400nm、200nm聚碳酸酯膜的脂质体挤出器挤出20次，获得红细胞膜囊泡。
63.(4)为了保持膜的生物活性，在红细胞膜囊泡中加入蛋白酶抑制剂，并将红细胞膜囊泡储存在4℃条件下。
64.然后，制备小粒径纳米细胞膜囊泡，包括如下步骤：
65.(1)称取α螺旋多肽r4f，使用pbs溶解，得到0.5mg/ml r4f多肽溶液。
66.(2)将红细胞膜囊泡分散于pbs中，测定囊泡磷脂浓度，制成分散液b；
67.(3)将溶液a和分散液b按照多肽与囊泡磷脂摩尔比例为0.4/3(nmol/nmol)混合，通过滴加溶液a于分散液b中进行充分漩涡混匀，溶液于4℃孵育过夜。孵育完成后，加入pbs浓缩离心去除游离的α螺旋多肽，得到粒径减小的纳米细胞膜囊泡，定量并4℃保存备用。
68.为研究不同配比的多肽与囊泡磷脂对小粒径纳米细胞膜囊泡，以下还提供一种囊泡磷脂浓度的测定方法，包括如下步骤：
69.(1)将磷脂检测试剂盒(enzychrom
tm triglyceride assay kit)中所有试剂拿至室温解冻，简单离心所有试管，然后置于冰上操作；
70.(2)标准品配置：24μl标准品和216μl的双蒸水混匀，得到200μm的标准品，按照下表配置标准浓度，并转移20μl标准品至96孔板中；
[0071][0072]
(3)样品管：首次检测需要对500μl的血液，以不同比例稀释(孵育多肽之前)100倍、10倍、5倍及不稀释。样品孔每孔加入20μl的待测样本；
[0073]
(4)显色反应：每孔准备85μl的assay buffer，1μl的pld enzyme，1μl的enzyme mix和1μl的dye reagent，每孔添加80μl的混合液(8个孔相应的体积乘以8)。轻敲孔板混匀，室温孵育30min；
[0074]
(5)570nm进行光密度od值测量。
[0075]
不同α螺旋多肽与纳米红细胞膜囊泡合成比例研究方法具体如下：
[0076]
(1)不同α螺旋多肽与纳米红细胞膜囊泡合成比例研究：
[0077]
将1ml全血量的纳米红细胞囊泡平均分为四份，每份的磷脂量为33.3nmol；分别加入的r4f的量(nmol)为每份磷脂量的0.1/3、0.2/3、0.4/3、0.8/3，r4f多肽溶液滴加混匀于红细胞膜囊泡溶液中，溶液于4℃孵育过夜。孵育完成后，加入pbs浓缩离心去除游离的r4f，重复离心3次后1
×
pbs定量到1ml。最后使用纳米粒度仪来分别测量纳米颗粒的粒径和zeta电位的大小。
[0078]
(2)纳米红细胞膜囊泡的粒径、电位和形状检测
[0079]
透射电子显微镜检测：滴加10μl的囊泡于电镜铜网上，静置1min；将铜网使用冰上预冷的去离子水轻轻漂洗3次，充分去除溶液中的盐分，使用滤纸将铜网上的水吸干；使用预冷的2％磷钨酸轻轻漂洗2次后，重新滴加10μl磷钨酸于铜网表面负染3min；滤纸吸干铜网表面的溶液后使用透射电子显微镜进行成像。
[0080]
纳米粒度电位仪：收集纯化好的囊泡溶液，使用30kda浓缩离心管将囊泡溶液离心至1ml左右，0.22μm滤头过滤。使用纳米粒度仪来分别测量纳米颗粒的粒径和zeta电位的大小。
[0081]
根据本技术实施例的第三方面，提供了一种组合物，包含上述可实施方式中任一项的小粒径纳米细胞膜囊泡。
[0082]
组合物包括但并不限于小粒径纳米细胞膜囊泡负载药物组合物，利用本技术实施例提供的小粒径纳米细胞膜囊泡负载药物组合物，可提高药物的靶向性和缓释性、降低毒副作用，具有生物相容性，并且可生物降解。进一步的，小粒径纳米细胞膜囊泡可以装载抗癌剂、抗炎剂、血管发生抑制剂、肽、蛋白质、毒素、珠粒、微米颗粒、纳米颗粒等。小粒径纳米
细胞膜囊泡还可以装载各种引物、探针、反义核酸、抗体等。
[0083]
根据本技术实施例的第四方面，提供了一种试剂盒，包含上述可实施方式中任一项的小粒径纳米细胞膜囊泡。
[0084]
具体的，本方法提供的试剂盒可以包含本技术提供的小粒径纳米细胞膜囊泡的各类试剂盒，包括但不限于，检测类试剂盒、诊断类试剂盒等。
[0085]
根据本技术实施例的第四方面，提供了一种试剂盒，包含α螺旋多肽，用于制备上述可实施方式中任一项的小粒径纳米细胞膜囊泡。
[0086]
进一步的，根据本技术所提供的小粒径纳米细胞膜囊泡的制备方法，该试剂盒还可以包括缓冲液等其他材料。
[0087]
应该理解，可以使用上面所示的各种形式的流程，重新排序、增加或删除步骤。例如，本发公开中记载的各步骤可以并行地执行也可以顺序地执行也可以不同的次序执行，只要能够实现本技术公开的技术方案所期望的结果，本文在此不进行限制。
[0088]
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或隐含地包括至少一个该特征。在本技术的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
[0089]
以上所述，仅为本技术的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本技术揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。因此，本技术的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。