脐带间充质干细胞的分离培养方法与流程

1.本发明涉及细胞分离技术领域，尤其涉及一种脐带间充质干细胞的分离培养方法。


背景技术：

2.间充质干细胞来源于中胚层，是一种具有自我更新和多向分化潜能的多能细胞。在20世纪70年代friedenstein等首先从骨髓中成功分离出间充质干细胞。间充质干细胞具有来源广泛、取材方便、扩增迅速、可自体移植等特点，因此被认为是组织工程中理想的种子细胞并作为临床细胞替代治疗的一种途径应用于研究中。
3.脐带间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。然而，传统的人脐带间充质干细胞的分离培养方法上存在效率低时间长的问题。原代脐带间充质干细胞的最常见分离方法包括酶消化法和组织块培养法。酶消化培养法的经济成本高，一般4～5h，一般使用胶原酶进行消化，但消化程度不易把控，如消化不够，无法得到足够数量的细胞；如果消化时间过久，使用的酶对细胞的损伤又太大，细胞会大量死亡。虽然，组织块培养法过程简便易行，且经济成本低，但原代培养时间太长，通常需要14～20d才能够得到数量不多的原代细胞。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题在于，提供一种脐带间充质干细胞的分离培养方法，其操作简单，成本低，有利于脐带间充质干细胞的大规模培养。
5.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种脐带间充质干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
6.取脐带组织并经清洗处理后得到组织块；
7.向所述组织块中加入混合酶溶液，处理第一预设时间后，再加入胶原酶i溶液，处理第二预设时间后离心并去除上清液，得到细胞沉淀；
8.将所述细胞沉淀清洗后置于培养基中培养，得到脐带间充质干细胞；
9.所述混合酶溶液包括弹性蛋白酶和中性蛋白酶，所述弹性蛋白酶和中性蛋白酶的质量比为(3～4)：1。
10.优选地，所述混合酶溶液由弹性蛋白酶和中性蛋白酶组成，所述弹性蛋白酶和中性蛋白酶的质量比为(3.1～3.5)：1。
11.在一种实施方式中，向所述组织块中加入质量浓度为0.6g/l～0.8g/l的混合酶溶液；
12.所述第一预设时间为30min～50min。
13.在一种实施方式中，所述胶原酶i溶液的浓度为1mg/ml～3mg/ml；
14.所述第二预设时间为15min～20min。
15.在一种实施方式中，所述混合酶溶液与所述胶原酶i溶液按照(3.5～5)：1的体积比加入。
16.在一种实施方式中，所述离心并去除上清液过程中，离心转速为500rpm～700rpm，离心时间为20min～30min。
17.在一种实施方式中，所述取脐带组织并经清洗处理后得到组织块，具体包括以下步骤：
18.取脐带组织，洗去组织块表面的血液和杂质，沿脐带静脉腔纵向剪开，剔除动脉和静脉；
19.撕取脐带组织内的沃顿胶组织并清洗，然后将所述沃顿胶组织剪碎成2mm3～4mm3的样品块，清洗杂质后用pbs缓冲液处理，得到组织块。
20.优选地，取脐带组织，放入含1wt％～3wt％青霉素和1wt％～3wt％硫酸链霉素的pbs溶液中清洗3次～5次，每次4min～6min，洗去组织块表面的血液和杂质，沿脐带静脉腔纵向剪开，剔除动脉和静脉；
21.撕取脐带组织内的沃顿胶组织并清洗，将所述沃顿胶组织剪碎成2mm3～4mm3的组织块，用无菌水冲洗20min～30min，洗去杂质后用pbs缓冲液处理4次～6次，每次5min～7min，得到组织块。
22.在一种实施方式中，所述培养基为含5wt％～7wt％胎牛血清的dmem培养基。
23.在一种实施方式中，将所述细胞沉淀清洗后置于培养基中，然后置于温度为35℃～37℃、4.5％～5.5％co2饱和湿度的培养箱内培养，每隔48h换一次培养液。
24.实施本发明，具有如下有益效果：
25.本发明提供的脐带间充质干细胞的分离培养方法，添加特定的混合酶溶液和胶原酶i溶液，在所述混合酶溶液和胶原酶i溶液的协同作用下能够提高细胞分离效率，获得高活率的细胞，同时能够得到稳定增殖的脐带间充质干细胞。本发明提供的方法操作简单，成本低，有利于脐带间充质干细胞的大规模培养。
附图说明
26.图1为本发明实施例1中p2代细胞的显微镜观察结果；
27.图2为本发明实施例2中p2代细胞的显微镜观察结果；
28.图3为本发明实施例3中p2代细胞的显微镜观察结果；
29.图4为本发明对比例1中p2代细胞的显微镜观察结果；
30.图5为本发明对比例2中p2代细胞的显微镜观察结果；
31.图6为本发明对比例3中p2代细胞的显微镜观察结果；
32.图7为本发明对比例4中p2代细胞的显微镜观察结果；
33.图8为本发明对比例5中p2代细胞的显微镜观察结果。
具体实施方式
34.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明作进一步地详细描述。
35.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种脐带间充质干细胞的分离培养方法，
包括以下步骤：
36.s1、取脐带组织并经清洗处理后得到组织块。
37.在一种实施方式中，所述取脐带组织并经清洗处理后得到组织块，具体包括以下步骤：
38.取脐带组织，洗去组织块表面的血液和杂质，沿脐带静脉腔纵向剪开，剔除动脉和静脉；
39.撕取脐带组织内的沃顿胶组织并清洗，然后将所述沃顿胶组织剪碎成2mm3～4mm3的样品块，清洗杂质后用pbs缓冲液处理，得到组织块，
40.优选地，取脐带组织，放入含1wt％～3wt％青霉素和1wt％～3wt％硫酸链霉素的pbs溶液中清洗3次～5次，每次4min～6min，洗去组织块表面的血液和杂质，沿脐带静脉腔纵向剪开，剔除动脉和静脉；
41.撕取脐带组织内的沃顿胶组织并清洗，将所述沃顿胶组织剪碎成2mm3～4mm3的组织块，用无菌水冲洗20min～30min，洗去杂质后用pbs缓冲液处理4次～6次，每次5min～7min，得到组织块。
42.s2、向所述组织块中加入混合酶溶液，处理第一预设时间后，再加入胶原酶i溶液，处理第二预设时间后离心并去除上清液，得到细胞沉淀；
43.所述混合酶溶液包括弹性蛋白酶和中性蛋白酶，所述弹性蛋白酶和中性蛋白酶的质量比为(3～4)：1。
44.本发明中所述混合酶溶液包括中性蛋白酶和弹性蛋白酶。其中，中性蛋白酶能够快速且温和地进行蛋白水解；弹性蛋白酶通过作用于弹性蛋白的肽键、酰胺键和酯键实现水解，分离结缔组织和含有大量细胞网状纤维的组织。本发明将所述弹性蛋白酶与中性蛋白酶联合使用，不仅能够减少细胞膜损失，不引入支原体或动物病毒；且细胞分离效率高。所述弹性蛋白酶和中性蛋白酶的质量比低于3：1时，所述弹性蛋白酶的加入量过少，将导致细胞分离效率降低，即细胞得率降低，同时细胞活率也明显降低；所述弹性蛋白酶和中性蛋白酶的质量比高于4：1时，所述弹性蛋白酶的加入量过多，会导致细胞膜被破坏，从而导致细胞死亡，细胞活率明显降低。优选地，所述弹性蛋白酶和中性蛋白酶的质量比为(3.1～3.5)：1。
45.在一种实施方式中，向所述组织块中加入质量浓度为0.6g/l～0.8g/l的混合酶溶液；所述第一预设时间为30min～50min。所述混合酶溶液的加入量为5ml～11ml。所述混合酶溶液的质量浓度太高或消化时间太长，会导致细胞膜表面蛋白大量被分解，从而导致细胞死亡。反之，所述混合酶溶液的质量浓度太低或消化时间太短，则无法起到良好的分离效果。
46.进一步地，处理第一预设时间后，再加入胶原酶i溶液，在一种实施方式中，所述胶原酶i溶液采用下述方法制得：将胶原酶粉末溶于pbs溶液中，混合得到胶原酶i溶液。在一种实施方式中，所述胶原酶i溶液的浓度为1mg/ml～3mg/ml；所述第二预设时间为15min～20min。所述胶原酶i溶液的浓度高时，消化时间难以控制，易造成间充质干细胞“过度消化”，导致细胞存活率低。
47.所述胶原酶i溶液能够破坏胶原蛋白中存在的肽键，有助于消化细胞外基质，使细胞释放到悬浮液中。将所述胶原酶i溶液与混合酶溶液联合使用，其中，弹性蛋白酶用于分
离结缔组织和含有大量细胞网状纤维的组织，中性蛋白酶其温和的蛋白水解作用使该酶特别适用于分离原代，对细胞损伤小，能维持细胞膜的完整性，且其稳定，和弹性蛋白酶联合使用可提高组织的解离效率。而在混合酶溶液酶解一段时间后再加入胶原酶i溶液，与混合酶溶液按一定体积比混合，可以在提高细胞分离效率的同时，更好的保证细胞完整度。在一种实施方式中，所述混合酶溶液与所述胶原酶i溶液按照(3.5～5)：1的体积比加入。所述混合酶溶液或胶原酶i溶液加入量过多，都会造成细胞过度消化，细胞受损从而导致细胞活率降低。
48.另外，上述消化处理后，需要离心分离出沉淀细胞，在一种实施方式中，所述离心并去除上清液过程中，离心转速为500rpm～700rpm，离心时间为20min～30min。
49.需要说明的是，在酶解消化过程中，作用对象、用量和作用先后顺序的不同会带来天差地别的效果，虽然任何消化酶对组织都有一定的消化作用，但因消化酶用量、组成、顺序不同，组织消化后的细胞得率、细胞活率大相径庭，且不是所有的消化酶组合都能满足大规模培养的需要。
50.本发明先添加特定组成的混合酶溶液，消化预设时间后再加入胶原酶i溶液，在二者的协同作用下能够提高细胞分离效率，获得高活率的细胞，同时能够得到稳定增殖的脐带间充质干细胞，且适用于脐带间充质干细胞的大规模分离培养。
51.s3、将所述细胞沉淀清洗后置于培养基中培养，得到脐带间充质干细胞。
52.在一种实施方式中，所述培养基为含5wt％～7wt％胎牛血清的dmem培养基。将所述细胞沉淀清洗后置于培养基中，然后置于温度为35℃～37℃、4.5％～5.5％co2饱和湿度的培养箱内培养，每隔48h换一次培养液，培养6d～8d。
53.下面以具体实施例进一步说明本发明：
54.实施例1
55.本实施例提供一种脐带间充质干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
56.s1、取脐带组织并经清洗处理后得到组织块；
57.具体包括：取脐带组织，放入含1wt％青霉素和1wt％硫酸链霉素的pbs溶液中清洗3次，每次4min，洗去组织块表面的血液和杂质，沿脐带静脉腔纵向剪开，剔除动脉和静脉；
58.撕取脐带组织内的沃顿胶组织并清洗，将所述沃顿胶组织剪碎成2mm3的组织块，用无菌水冲洗20min，洗去杂质后用pbs缓冲液处理4次，每次5min，得到组织块。
59.s2、向所述组织块中加入质量浓度为0.6g/l的混合酶溶液5ml，处理30min后，再加入质量浓度为1mg/ml的胶原酶i溶液1ml，处理15min后于500rpm的转速下离心20min，去除上清液，得到细胞沉淀；
60.所述混合酶溶液包括弹性蛋白酶和中性蛋白酶，所述弹性蛋白酶和中性蛋白酶的质量比为3：1。
61.s3、将所述细胞沉淀清洗后置于含5wt％胎牛血清的dmem培养基中并置于37℃、5％co2饱和湿度的培养箱内，每隔48h换一次培养液，培养7天后得到脐带间充质干细胞。
62.实施例2
63.本实施例提供一种脐带间充质干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
64.s1、取脐带组织并经清洗处理后得到组织块；
65.具体包括：取脐带组织，放入含3wt％青霉素和3wt％硫酸链霉素的pbs溶液中清洗
5次，每次6min，洗去组织块表面的血液和杂质，沿脐带静脉腔纵向剪开，剔除动脉和静脉；
66.撕取脐带组织内的沃顿胶组织并清洗，将所述沃顿胶组织剪碎成4mm3的组织块，用无菌水冲洗30min，洗去杂质后用pbs缓冲液处理6次，每次7min，得到组织块。
67.s2、向所述组织块中加入质量浓度为0.8g/l的混合酶溶液11ml，处理50min后，再加入质量浓度为1mg/ml的胶原酶i溶液3ml，处理20min后于700rpm的转速下离心30min，去除上清液，得到细胞沉淀；
68.所述混合酶溶液包括弹性蛋白酶和中性蛋白酶，所述弹性蛋白酶和中性蛋白酶的质量比为4：1。
69.s3、将所述细胞沉淀清洗后置于含7wt％胎牛血清的dmem培养基中并置于37℃、5％co2饱和湿度的培养箱内，每隔48h换一次培养液，培养7天后得到脐带间充质干细胞。
70.实施例3
71.本实施例提供一种脐带间充质干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
72.s1、取脐带组织并经清洗处理后得到组织块；
73.具体包括：取脐带组织，放入含2wt％青霉素和2wt％硫酸链霉素的pbs溶液中清洗4次，每次5min，洗去组织块表面的血液和杂质，沿脐带静脉腔纵向剪开，剔除动脉和静脉；
74.撕取脐带组织内的沃顿胶组织并清洗，将所述沃顿胶组织剪碎成3mm3的组织块，用无菌水冲洗25min，洗去杂质后用pbs缓冲液处理5次，每次6min，得到组织块。
75.s2、向所述组织块中加入质量浓度为0.7g/l的混合酶溶液9ml，处理40min后，再加入质量浓度为1mg/ml的胶原酶i溶液2ml，处理18min后于600rpm的转速下离心25min，去除上清液，得到细胞沉淀；
76.所述混合酶溶液包括弹性蛋白酶和中性蛋白酶，所述弹性蛋白酶和中性蛋白酶的质量比为3.5：1。
77.s3、将所述细胞沉淀清洗后置于含6wt％胎牛血清的dmem培养基中并置于37℃、5％co2饱和湿度的培养箱内，每隔48h换一次培养液，培养7天后得到脐带间充质干细胞。
78.对比例1
79.本实施例提供一种脐带间充质干细胞的分离培养方法，与实施例3不同之处在于，所述混合酶溶液包括弹性蛋白酶和中性蛋白酶，所述弹性蛋白酶和中性蛋白酶的质量比为2：1，其余与实施例3相同。
80.对比例2
81.本实施例提供一种脐带间充质干细胞的分离培养方法，与实施例3不同之处在于，所述混合酶溶液包括弹性蛋白酶和中性蛋白酶，所述弹性蛋白酶和中性蛋白酶的质量比为5：1，其余与实施例3相同。
82.对比例3
83.本实施例提供一种脐带间充质干细胞的分离培养方法，与实施例3不同之处在于，以弹性蛋白酶溶液替代混合酶溶液，其余与实施例3相同。
84.对比例4
85.本实施例提供一种脐带间充质干细胞的分离培养方法，与实施例3不同之处在于，以中性蛋白酶溶液替代混合酶溶液，其余与实施例3相同。
86.对比例5
87.本实施例提供一种脐带间充质干细胞的分离培养方法，与实施例3不同之处在于，不加入胶原酶i溶液，其余与实施例3相同。
88.对实施例1～3和对比例1～5的细胞得率和活力进行对比试验，试验方法如下：
89.试验样品：实施例1～3和对比例1～5分离方法培养的细胞；
90.取实施例1～3和对比例1～5组培养的细胞悬液与0.4％台盼蓝溶液以9:1比例混匀(终浓度0.04％)，染色3分钟。吸取10ul台盼蓝染色的细胞于载玻片上，加上盖片，于显微镜下任取几个视野计数死细胞数和活细胞数，计算总细胞数和细胞活率。死细胞着蓝色并膨大，无光泽；活细胞不着色并保持正常形态，有光泽。总细胞数＝活细胞总数 死细胞总数。
91.细胞存活率(％)＝活细胞总数/(活细胞总数 死细胞总数)
×
100％
92.表1不同组别细胞得率和活力对比结果
93.组别活细胞数(
×
105)总细胞数(
×
105)细胞活率(100％)实施例13.063.3192.5％实施例23.984.2693.4％实施例35.105.1998.2％对比例12.683.1585％对比例22.813.1988％对比例32.53.0183.06％对比例42.633.1184.5％对比例52.22.7879.1％
94.由表1可知，本技术实施例1～3组培养的细胞，细胞活率均可达90％以上，尤其是实施例3组，细胞得率达到5.19
×
105细胞，活率高达98.2％，细胞得率和存活度极高，且适用于脐带间充质干细胞的大规模分离培养。
95.对比例1中，所述弹性蛋白酶和中性蛋白酶的质量比低于3：1时，导致细胞分离效率降低，即细胞得率降低，而且细胞活率也明显降低。
96.对比例2中，所述弹性蛋白酶和中性蛋白酶的质量比高于4：1时，所述弹性蛋白酶的加入量过多，造成细胞膜被破坏，从而导致细胞死亡，细胞活率明显降低。
97.对比例3中以弹性蛋白酶溶液替代混合酶溶液，对比例4中以中性蛋白酶溶液替代混合酶溶液，对比例5中去掉了胶原酶i溶液的消化，导致对比例3-5的细胞分离效率降低，细胞分离得率降低，而且细胞活率也明显降低。说明本发明先添加特定组成的混合酶溶液，消化预设时间后再加入胶原酶i溶液，在二者的协同作用下能够提高细胞分离效率，获得高活率的细胞，同时能够得到稳定增殖的脐带间充质干细胞，且适用于脐带间充质干细胞的大规模分离培养。
98.然后，对实施例1～3和对比例1～5进行p2代细胞生长情况对比试验，试验方法如下：
99.取脐带组织，剪成3mm3，随机、平均分成8份，分别按照实施例1～3及对比例1～5所述的分离方法及培养基成分对细胞进行分离并培养，取p2代的细胞进行显微镜拍照，记录不同组别脐带间充质干细胞的生长情况，如下图1～8所示。由图片结果可知，本发明所述的细胞分离方法中，实施1～3细胞生长情况相对对比例1～5细胞丝网生长情况好，尤其是实
施例3组的细胞生长情况最佳。而对比例1～5组的细胞生长情况，出现了不同情况的问题，没有实施例1～3的生长情况好。例如，出现了组织消化不完全，细胞得率少；或者，组织消化成单个细胞，消化过度，导致细胞死亡或细胞活力降低，后期细胞质量较差，容易出现抽丝拉网的现象。
100.以上所述是发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。