一种荧光检测纳米探针、制备方法及应用

1.本发明涉及医药检测技术领域，尤其涉及一种荧光检测纳米探针、制备方法及应用。


背景技术：

2.抗生素具有杀菌和抑菌作用，被广泛应用于预防和治疗动物中的感染性疾病。由于缺乏全面的知识，抗生素被认为是“灵丹妙药”，导致在医疗行业和畜牧业中的不合理使用甚至滥用。在临床实践中，抗生素的不当使用会改变某些器官的功能，损害神经、肾脏和血液系统。滥用抗生素还会导致产生抗药性超级细菌，对全球健康构成巨大威胁。此外，水产养殖业的滥用可能会导致动物性食品中的残留。因此，准确检测食品、生物样品等复杂基质中痕量抗生素变得必需且迫切。
3.在抗生素家族中，氟喹诺酮类药物值得特别关注。作为第三代喹诺酮药物的诺氟沙星对革兰氏阳性和阴性菌具有广谱杀菌活性，是提高制药行业和养殖业经济利益的必要抗菌物质。然而诺氟沙星通常以不经代谢的原型排出体外，随着诺氟沙星的广泛使用，地表水、土壤或动物源性食品中不可避免的诺氟沙星残留对人类健康构成威胁。此外，环境中的诺氟沙星存在也更容易诱导耐抗生素细菌的出现。但是现有的诺氟沙星检测操作复杂，依赖大型仪器。因此，开发一种简单、快速、灵敏的诺氟沙星现场检测方法对于环境与食品安全的监测具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明公开了一种荧光检测纳米探针的制备方法，其可以有效解决背景技术中涉及的技术问题。
5.为实现上述目的，本发明的技术方案为：一种荧光检测纳米探针的制备方法，该方法包括如下步骤：步骤一、通过水热法合成制备蓝色荧光碳点（bcd）；步骤二、通过溶剂热法合成制备红色荧光碳点（rcd）；步骤三、将制备的bcd和rcd以一定比例混匀，与沃特曼滤纸共孵育，经烘箱干燥后得到荧光检测纳米探针。
6.作为本发明的一种优选改进，在步骤一中，以柠檬酸钠和聚丙烯酰胺为原料通过水热法制备bcd。
7.作为本发明的一种优选改进，步骤一具体包括如下步骤：将0.025mg过硫酸钾溶于10ml纯水中，得到混合物a；将5.0g丙烯酰胺溶于80ml纯水中，得到混合物b；将混合物a和混合物b充分混匀后转移至250ml圆底烧瓶中；调节温度为90
°
c反应2h，待反应冷却至室温后收取产物，并以1000da透析袋透析36h，透析所得产物转移至离心管并经真空干燥后得到聚丙烯酰胺；
称取聚丙烯酰胺0.52g，柠檬酸钠1.0g，并将二者充分溶于20ml纯水中，将溶液转移至聚四氟乙烯高压反应釜中，调节温度为200
°
c反应3h；待反应冷却后收取产物，并以1000da透析袋透析12h，所得产物转移至离心管并经真空干燥后称量定量并以10mg/ml重新分散于纯水中，得到bcd。
8.作为本发明的一种优选改进，在步骤二中，以对苯二胺为原料通过溶剂热法制备rcd。
9.作为本发明的一种优选改进，步骤二具体包括如下步骤：称取对苯二胺固体0.3g，溶解在30ml乙醇溶液中；通过超声波充分溶解后将溶液转移至聚四氟乙烯高压反应釜中，调节温度为180
°
c，反应12h，待反应冷却至室温后收集产物；将收集的产物以柱层析法进一步纯化；纯化后所得产物干燥后称量定量，并以10mg/ml重新分散于无水乙醇溶液中，得到rcd。
10.作为本发明的一种优选改进，步骤三中，bcd和rcd以4:3的比例混匀。
11.本发明还提供了一种荧光检测纳米探针，采用所述的一种荧光检测纳米探针的制备方法制备而成。
12.本发明还提供了一种荧光检测纳米探针的应用，将所述的荧光检测纳米探针应用于诺氟沙星检测。
13.本发明的有益效果如下：1、本发明提供的荧光检测纳米探针，具备较强的荧光检测性能，可以通过便携的365nm紫外灯激发产生荧光；并且，由于诺氟沙星会使得bcd荧光恢复并增强，而对rcd无明显影响，因此可以使得纸基比色纳米探针具有更强的抗干扰能力与更灵敏的检测性能，因此，本发明的荧光纳米探针可用于诺氟沙星的灵敏检测；2、本发明荧光检测纳米探针的制备方法简单、成本适宜，具有大规模生产的可能，具有工业和实际应用的潜力；3、本发明所使用的荧光检测纳米探针具有良好的生物相容性及生态友好性，对人体及环境无明显的直接或间接毒害作用。
附图说明
14.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：图1本发明荧光检测纳米探针的制备过程、用于检测诺氟沙星的基本原理及结合智能手机检测示意图；图2为本发明红蓝荧光碳点及荧光检测纳米探针的荧光发射光谱图；图3（a）和(b)分别本发明bcd和rcd的傅里叶红外光谱图；图4（a）-(d)为本发明bcd的x射线光电子能谱全谱及其精细谱；图5（a）-(c)为本发明rcd的x射线光电子能谱全谱及其精细谱；
图6为本发明荧光检测纳米探针bcd（左440nm处）与rcd（右620nm处）荧光强度随诺氟沙星滴定（0-70μm）时荧光强度的变化趋势图；图7为本发明荧光检测纳米探针检测诺氟沙星的标准曲线图；图8为本发明荧光检测纳米探针检测诺氟沙星的ph响应图；图9为本发明荧光检测纳米探针对不同物质的选择性检测测试图；图10为本发明添加不同干扰物质后，荧光检测纳米探针的抗干扰能力测试图；图11为本发明红蓝荧光碳点比例对荧光检测纳米探针的检测灵敏度影响图；图12为本发明随诺氟沙星浓度上升时荧光检测纳米探针的颜色变化图；图13为本发明荧光检测纳米探针检测诺氟沙星的标准曲线图。
具体实施方式
15.下面将结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
16.另外，本发明各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
17.本发明提供一种荧光检测纳米探针的制备方法，该方法包括如下步骤：步骤一、通过水热法合成制备bcd，具体的，以柠檬酸钠和聚丙烯酰胺为原料通过水热法制备bcd；具体包括如下步骤：将0.025mg过硫酸钾溶于10ml纯水中，得到混合物a；将5.0g丙烯酰胺溶于80ml纯水中，得到混合物b；将混合物a和混合物b充分混匀后转移至250ml圆底烧瓶中；调节温度为90
°
c反应2h，待反应冷却至室温后收取产物，并以1000da透析袋透析36h，透析所得产物转移至离心管并经真空干燥后得到聚丙烯酰胺；称取聚丙烯酰胺0.52g，柠檬酸钠1.0g，并将二者充分溶于20ml纯水中，将溶液转移至聚四氟乙烯高压反应釜中，调节温度为200
°
c反应3h；待反应冷却后收取产物，并以1000da透析袋透析12h，所得产物转移至离心管并经真空干燥后称量定量并以10mg/ml重新分散于纯水中，得到bcd。
18.步骤二、通过溶剂热法合成制备rcd，具体的，以对苯二胺为原料通过溶剂热法制备rcd；包括如下步骤：称取对苯二胺固体0.3g，溶解在30ml乙醇溶液中；通过超声波充分溶解后将溶液转移至聚四氟乙烯高压反应釜中，调节温度为180
°
c，反应12h，待反应冷却至室温后收集产物；将收集的产物以柱层析法进一步纯化；纯化后所得产物干燥后称量定量，并以10mg/ml重新分散于无水乙醇溶液中，得到
rcd。
19.步骤三、将制备的bcd和rcd以4:3的比例混匀，与沃特曼滤纸共孵育，经烘箱干燥后得到荧光检测纳米探针。
20.具体的，该荧光检测纳米探针为纸基比色荧光纳米探针。
21.该荧光检测纳米探针的检测机理如图1所示，可见，由于荧光检测纳米探针对分析物的检测与其荧光强度有关，在365nm紫外光的激发下，rcd荧光强度虽不是最高，但是由于眼睛对红色很敏感，所以其有足够的荧光亮度可以作为内标荧光。具体的，该荧光探针在紫外光照射下发出红色荧光；加入诺氟沙星后，荧光探针在紫外光照射下呈现蓝色荧光。
22.进一步的，该探针的rcd与bcd的组分表征如图2、3所示，考虑到探针对分析物的检测灵敏度与其本身的性质有关，使用傅里叶红外光谱仪和荧光分光光度计分别研究了比色荧光纳米探针的结构特征和光谱特性：此外，还使用了x射线光电子能谱来确定rcd与bcd探针的表面元素组成及其化学键与分子结构，具体如图4、5所示。
23.需进一步说明的是，本发明所制备的荧光检测纳米探针可用于诺氟沙星的灵敏检测，从而实现荧光检测分析。具体的，荧光检测纳米探针以bcd与fe
3
的内滤波效应淬灭，并在与诺氟沙星结合时荧光恢复并增强为检测机制。
24.下面以具体实施例1-5对本发明所制备的荧光检测纳米探针进行详细说明。
25.实施例1使用该荧光检测纳米探针对一种环境水样中诺氟沙星进行定量检测，包括以下步骤：称取诺氟沙星粉末，用水样稀释并以微量浓盐酸助溶制成不同浓度的标准样品(1μm-70μm)，各取10μl与荧光检测纳米探针共孵育5min，每个浓度3个重复，记录365nm波长激发下，红蓝荧光碳点荧光强度值，具体如图6所示，440nm处bcd荧光强度随诺氟沙星浓度增高而不断增强，而620nm处rcd荧光强度则作为荧光内标，不随诺氟沙星的滴加而改变；此外，诺氟沙星浓度为横坐标，红蓝碳点荧光强度比值为纵坐标，绘制了标准曲线图7，具有良好的线性关系r2＝0.998，lod＝1.228nm。
26.实施例2如图8所示，研究了ph值对探针荧光强度的影响。当ph《7.4时，比色荧光探针的检测灵敏度随着ph的降低而逐渐降低；相反，当ph》7.4时，比色荧光探针的检测灵敏度随着ph的升高而逐渐降低。这一结果表明，比色荧光纳米探针在ph为7.4的条件下对氟喹诺酮检测有更好的灵敏度。
27.实施例3对荧光检测纳米探针的选择性和抗干扰能力进行了测试：如图9，对于该比率荧光传感系统，选择代表性生物成分(精氨酸（arg）、天冬氨酸（asp)、酪氨酸（tyr）)、代表性金属阳离子(ca
2
、cu
2
、cr
3
、k

、mg
2
、na

、ni
2
)、阴离子（br-、cl-、so
42-）一些药物(环丙沙星（cip）、磺胺甲恶唑（sd）)等物质，评价了比率荧光传感系统对诺氟沙星的选择性；如图10，选择代表性生物成分(arg、asp、tyr)、代表性金属阳离子(ca
2
、cu
2
、cr
3
、k

、mg
2
、na

、ni
2
)、阴离子（br-、cl-、so
42-）一些药物(cip、sd)等物质，评价了比率荧光传感系统对诺氟沙星检测的抗干扰能力。
28.实施例4
如图11所示，为了获得最佳的荧光传感系统配比，在合成过程中加入不同浓度配比的红蓝荧光碳点制备不同浓度比的探针。用荧光分光光度计测量了不同浓度配比的红蓝荧光碳点对检测灵敏度的影响。
29.实施例5基于比率荧光系统进行传感器的设计-智能手机传感平台构建，为了评价比色荧光探针的适用性，对诺氟沙星进行了检测。本发明将荧光照片的颜色信息(rgb值)数字化，通过颜色识别应用程序进行分析。根据上述优化条件，合成了最佳的比率荧光探针，并通过加入不同浓度的诺氟沙星到比率荧光探针系统。反应完成后，用智能手机在365nm紫外光下拍摄从红色到蓝色的一系列照片，如图12所示，通过颜色识别器app获取这些照片对应的rgb值，进行进一步统计分析。
30.称取诺氟沙星粉末，用水样稀释并以微量浓盐酸助溶制成不同浓度的标准样品(0μm-80μm)，与荧光检测纳米探针共孵育30s，每个浓度3个重复，在365nm紫外灯照射下，用手机app“颜色识别器”读取rgb值，计算b/r值；以诺氟沙星浓度为横坐标，b/r值为纵坐标，绘制标准曲线，如图13所示。
31.通过智能手机上的颜色识别器应用程序对荧光图像进行的rgb分析。捕获一系列荧光图像后，可使用颜色识别器应用将相应颜色转换为rgb值，并可通过计算b值和r值的比率来评估诺氟沙星的浓度。b值和r值的比率(b/r)随诺氟沙星浓度变化，具有良好的线性关系r2＝0.994，lod＝5.362μm。结果表明，结合智能手机应用，该传感平台实现了对诺氟沙星的便携式、可视化和定量监测。
32.本发明的有益效果如下：1、本发明提供的荧光检测纳米探针，具备较强的荧光检测性能，可以通过便携的365nm紫外灯激发产生荧光；并且，由于诺氟沙星会使得bcd荧光恢复并增强，而对rcd无明显影响，因此可以使得纸基比色纳米探针具有更强的抗干扰能力与更灵敏的检测性能，因此，本发明的荧光纳米探针可用于诺氟沙星的灵敏检测；2、本发明荧光检测纳米探针的制备方法简单、成本适宜，具有大规模生产的可能，具有工业和实际应用的潜力；3、本发明所使用的荧光检测纳米探针具有良好的生物相容性及生态友好性，对人体及环境无明显的直接或间接毒害作用。
33.尽管本发明的实施方案已公开如上，但并不仅仅限于说明书和实施方案中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里所示出与描述的图例。