一种多元甘醇修饰的脂质化合物及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种多元甘醇修饰的脂质化合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.基因治疗是指利用分子生物学的方法将目的基因导入患者体内使之表达，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，也指将核酸导入细胞内抑制目的基因的表达(基因沉默)或增加目的基因的表达(基因激活)，以达到治疗疾病的目的。近年来随着生物技术进步，基因治疗药物得到了快速的发展，给生物药物领域带来了巨大的发展前景。美国alnylam公司采用rnai技术研发了系列基因药物并成功的上市了四种rnai药物：onpattro(patisiran)、givlaari(givosiran)、oxlumo(lumasiran)和leavio(inclisiran)，其中leavio(inclisiran)是治疗高血脂症的生物药物，该药的成功上市将基因治疗药物从传统的治疗罕见性遗传病的领域拓宽到治疗大众病领域，为rnai药物带来了新的机遇。
3.核酸类药物由于其本身的性质，如负电性、易于被核酸酶所降解等导致其不能有效的透过细胞膜进入细胞并且在体内很快就被降解掉，所以需要合适的递送系统将核酸稳定的递送至目标位置并起效。mrna和sirna开发的共同难点就是如何将其有效地递送到目标部位的细胞中去。在递送过程中，还需要考虑如何避免被快速清除、避免被核酸酶降解、改善内吞后逃逸等问题。
4.目前递送核酸的系统多采用不同种类的脂质体递送方式，例如脂质纳米颗粒(lipid nanoparticle，lnp)、galnac、lpp(lipopolyplexes)等。lnp可以由四种脂质通过一定的比例制备而成，通常这四种脂质包含阳离子脂质、中性脂质、甾族脂质和聚合物缀合脂质，其中聚合物缀合脂质指的是聚乙二醇(peg)脂质。
5.现有技术中公开报道了一些聚乙二醇脂质，例如专利文献cn110352071a和cn1882693a公开了聚乙二醇脂质及应用聚乙二醇脂质制备的脂质纳米颗粒，用于将生物活性物质递送至体内。但聚乙二醇作为聚合物其本身为混合物，容易产生批次差异，对由其所形成的药品的质量和药效稳定性产生不利影响。


技术实现要素：

6.为克服现有技术的不足，本发明提供了一种化合物及其制备方法和应用。
7.在本发明第一方面，提供一种化合物，其具有如下结构：
[0008][0009]
其中，
[0010]
r1和r2各自独立地为含有6至30个碳原子的烃基；
[0011]
l1、l2和l3为独立的连接基；
[0012]
x为n或cr4，其中，r4选自：h、烷基、环烷基烷基、芳基、芳烷基、杂环基、杂环基烷基、卤素、-cn、-no2、-cora、-c(o)ora、-ocora、-c(o)nrarb、-ch＝nra、-ora、-oc(o)ra、-s(o)
t-ra、-s(o)
t-nrarb、-nrarb、-nrac(o)rb；其中，t为0-2的整数(如0、1、2)，各个ra和rb彼此独立地选自：h、烷基、环烷基、芳基、杂环基和卤素；
[0013]
n选自30-90的整数；
[0014]
y为端基。
[0015]
所述化合物具有单一分子量，而非由不同分子量的物质组成的混合物(例如聚合物，其通常由平均分子量表征)。
[0016]
具体地，l1和l2可以独立地选自：单键、亚烷基、-oc(o)(ch2)
i-、-c(o)o(ch2)
i-、-c(o)(ch2)
i-、-o(ch2)
i-、-s(o)
x
(ch2)
i-、-s-s-(ch2)
i-、-c(o)s(ch2)
i-、-sc(o)(ch2)
i-、-nr
a-(ch2)
i-、-c(o)nr
a-(ch2)
i-、-oc(o)nr
a-(ch2)
i-、-nr
a-c(o)(ch2)
i-、-nr
a-c(o)o(ch2)
i-、-s(o)
x
nr
a-(ch2)
i-、-oc(o)o(ch2)
i-；其中x为0-2的整数(如0、1、2)，i为0-10的整数，各ra彼此独立地选自：h、烷基、环烷基、芳基、杂环基和卤素。
[0017]
具体地，i为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，特别是0或1。
[0018]
具体地，各ra彼此独立地选自：h、c1-6烷基；在本发明的一些实施例中，ra为h。
[0019]
更具体地，l1和l2可以独立地选自：单键、c1-6亚烷基(例如-ch
2-、-ch2ch
2-、-ch2ch2ch
2-)、-oc(o)(ch2)-、-oc(o)-、-c(o)o(ch2)-、-c(o)o-、-c(o)(ch2)-、-c(o)-、-c(o)s(ch2)-、-c(o)s-、-c(o)nh-(ch2)-、-c(o)nh-、-oc(o)o(ch2)-、-oc(o)o-。
[0020]
在本发明的一些实施例中，l1和l2均为单键。
[0021]
在本发明另一些实施例中，l1为-c(o)o(ch2)-，l2为-c(o)o-。
[0022]
具体地，l3可以选自：单键、亚烷基、-(ch2)hoc(o)(ch2)
j-、-(ch2)hc(o)o(ch2)
j-、-(ch2)hc(o)(ch2)
j-、-(ch2)ho(ch2)
j-、-(ch2)hs(o)y(ch2)
j-、-(ch2)hs-s-(ch2)
j-、-(ch2)hc(o)s(ch2)
j-、-(ch2)hsc(o)(ch2)
j-、-(ch2)hnr
b-(ch2)
j-、-(ch2)hc(o)nr
b-(ch2)
j-、-(ch2)hoc(o)nr
b-(ch2)
j-、-(ch2)hnr
b-c(o)(ch2)
j-、-(ch2)hnr
b-c(o)o(ch2)
j-、-(ch2)hs(o)ynr
b-(ch2)
j-、-(ch2)hoc(o)o(ch2)
j-；其中y为0-2的整数(如0、1、2)，h和j彼此独立地选自0-10的整数，各rb彼此独立地选自：h、烷基、环烷基、芳基、杂环基和卤素。
[0023]
具体地，h和j彼此独立地选自：0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，特别是0和2；在本发明的一些实施例中，h为0。
[0024]
具体地，各rb彼此独立地选自：h、c1-6烷基；在本发明的一些实施例中，rb为h。
[0025]
更具体地，l3可以选自：单键、c1-6亚烷基(例如-ch
2-、-ch2ch
2-、-ch2ch2ch
2-)、-oc(o)(ch2)
2-、-oc(o)-、-c(o)o(ch2)
2-、-c(o)o-、-c(o)(ch2)
2-、-c(o)-、-c(o)s(ch2)
2-、-c(o)s-、-c(o)nh-(ch2)
2-、-c(o)nh-、-oc(o)o(ch2)
2-、-oc(o)o-。
[0026]
在本发明的一些实施例中，l3为c1-6亚烷基，例如-ch
2-、-ch2ch
2-、-ch2ch2ch
2-。
[0027]
在本发明另一些实施例中，l3为-c(o)ch2ch
2-。
[0028]
在本发明的一些实施例中，l1、l2和l3可以为不可断裂(uncleavable)的连接基，其在体内环境下较稳定，不易被切割断裂，例如，硫醚连接基、亚烷基连接基，或作为单键直接
与r1、r2或连接，特别是c1-10(直链或支链的)亚烷基，例如c2-8亚烷基，c2-5亚烷基，-ch
2-、-ch2ch
2-、-ch2ch2ch
2-。
[0029]
具体地，r1和r2各自独立地为含有6至30个碳原子(例如6、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30个碳原子)的直链或支链、饱和或不饱和的烃基，特别是含有6至30个碳原子的直链烃基；更具体地，r1和r2可以各自独立地为含有6至30个碳原子的烷基，特别是含有6至30个碳原子的直链烷基，特别是含有10至24个碳原子的直链烷基，例如，c12直链烷基(月桂基)、c14直链烷基(肉豆蔻基)、c16直链烷基(棕榈基)、c18直链烷基(硬脂基)、c20直链烷基(二十碳基)。
[0030]
在本发明的一些实施例中，r1和r2相同，例如，r1和r2均为含有6至24个碳原子的直链烷基，例如，r1和r2均为c14直链烷基(肉豆蔻基)。
[0031]
具体地，r4选自：h、c1-6烷基、卤素；在本发明的一些实施例中，r4为h。
[0032]
具体地，n可以为30、32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、58、60、65、70、75、80、85、90；更具体地，n可以为30-60的整数，例如40-50的整数，44-48的整数；在本发明的一些实施例中，n为46或47。
[0033]
具体地，y可以选自：h、烷基、烷氧基、环烷基、芳烷基、单糖和低聚糖基团；更具体地，y可以选自：甲基、乙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、环丙基、环丁基、环己基、苄基、特别是甲基、乙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、环丙基、环丁基、环己基或苄基；在本发明的一些实施例中，y为甲氧基。
[0034]
具体地，y还可以选自：羟基、羧基、酯基、氨基、巯基、马来酰亚胺基、琥珀酰亚胺基、琥珀酰亚胺酯基、炔基、叠氮基、醛基、硝基苯碳酸酯基、丙烯酸酯基、甲基丙烯酸酯基、二苯并环辛炔基、异氰酸酯基、乙烯砜基、二硫吡啶基、戊二酸基、酰肼基、对硝基碳酸酯基、硅烷基、环氧基等。
[0035]
具体地，该化合物可具有如下结构：
[0036][0037]
其中，l1、l2、l3、r1、r2、n、y具有本发明上述相应定义。
[0038]
更具体地，该化合物可选自如下结构：
[0039][0040]
其中，r1、r2、n、y具有本发明上述相应定义。
[0041]
在本发明的一些实施例中，该化合物具有如下结构：
[0042][0043]
在本发明第二方面，提供第一方面所述化合物的药学上可接受的盐、酯、异构体、前药和溶剂化物。
[0044]
在本发明第三方面，提供第一方面所述化合物的制备方法，其可以包括利用进行反应的步骤，其中，n和y具有本发明第一方面中相应定义，rc为反应活性基团，例如，羟基、羧基、氨基、巯基、马来酰亚胺基、琥珀酰亚胺基、炔基、叠氮基、醛基、环氧基等。
[0045]
在本发明第四方面，提供一种脂质组合物，其包含第一方面所述化合物或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药和溶剂化物。
[0046]
具体地，该脂质组合物还可以包含阳离子脂质，例如十八酰胺(sa)、溴化月桂基三甲基铵、溴化十六烷基三甲基铵、溴化肉豆蔻基三甲基铵、溴化二甲基二-十八铵(ddab)、3
β-[n-(n',n'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(dc-胆固醇)、1,2-二-十四酰基-3-三甲基铵-丙烷(dmtap)、1,2-二-十八酰基-3-三甲基铵-丙烷(dotap)和dotap衍生物例如1,2-二-(9z-十八烯酰基)-3-三甲基铵-丙烷和1,2-二-十六酰基-3-三甲基铵-丙烷、1,2-二-(9z-十八烯酰基)-3-二甲基铵-丙烷(dodap)和dodap衍生物例如1,2-二-十四酰基-3-二甲基铵-丙烷、1,2-二-十六酰基-3-二甲基铵-丙烷和1,2-二-十八酰基-3-二甲基铵-丙烷、1,2-二-o-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(dotma)、1,2-二油酰基-c-(4'-三甲基铵)-丁酰基-sn-甘油(dotb)、二-十八酰胺-丙氨酰基精胺、saint-2、聚阳离子脂质2,3-二油酰基氧基-n-[2(精胺-羧酰氨基)乙基]-n,n-二甲基-1-丙铵三氟乙酸盐(dospa)、((4-羟基丁基)氮杂二烷基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(alc-0315)等中的一种或多种，特别是alc-0315。
[0047]
具体地，该脂质组合物中，第一方面所述化合物或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药和溶剂化物与阳离子脂质的摩尔比可以为1:0.01-0.1(例如1:0.01、1:0.02、1:0.025、1:0.03、1:0.035、1:0.04、1:0.045、1:0.05、1:0.06、1:0.08、1:0.1)，特别是1:0.03-0.05。
[0048]
具体地，该脂质组合物还可以包含中性脂质，例如1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dppc)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dppe)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dmpe)、2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(dopg)、油酰磷脂酰胆碱(popc)、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(pope)等中的一种或多种，特别是dspc。
[0049]
具体地，该脂质组合物中，第一方面所述化合物或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药和溶剂化物与中性脂质的摩尔比可以为1:0.1-0.5(例如1:0.1、1:0.15、1:0.2、1:0.25、1:0.3、1:0.35、1:0.4、1:0.5)，特别是1:0.1-0.3。
[0050]
具体地，该脂质组合物还可以包含甾族脂质，例如燕麦甾醇、β-谷甾醇、菜子甾醇、麦角骨化醇、菜油甾醇、胆甾烷醇、胆固醇、粪甾醇、脱氢胆固醇、链甾醇、二氢麦角骨化醇、二氢胆固醇、二氢麦角甾醇、黑海甾醇、表胆甾醇、麦角甾醇、岩藻甾醇、六氢光甾醇、羟基胆固醇；羊毛甾醇、光甾醇、海藻甾醇、谷甾烷醇、谷甾醇、豆甾烷醇、豆甾醇、胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、脱氧胆酸和石胆酸等中的一种或多种，特别是胆固醇。
[0051]
具体地，该脂质组合物中，第一方面所述化合物或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药和溶剂化物与甾族脂质的摩尔比可以为1:0.5-1.5(1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.4、1:1.5)，特别是1:0.8-1.2。
[0052]
更具体地，该脂质组合物包含第一方面所述化合物，以及阳离子脂质、中性脂质和甾族脂质；在本发明的一些实施例中，该组合物包含第一方面所述化合物，以及alc-0315、dspc和胆固醇。
[0053]
具体地，该脂质组合物还可以包含一种或多种药学上可接受的辅料，例如，载体、佐剂、稀释剂等。
[0054]
在本发明第五方面，还提供一种药物组合物，其包含生物活性物质，以及第一方面所述化合物或第三方面所述的脂质组合物。
[0055]
具体地，该生物活性物质可以为小分子化合物、核酸、肽、蛋白质等。
[0056]
具体地，该生物活性物质为核酸，例如dna或rna，其中，dna可以为非编码dna(反义
dna)或编码dna，rna可以选自：反义rna、sarna、mrna、lncrna、mirna、sirna、pirna、grna、tsrna等中的一种或多种，特别是mrna、sirna。
[0057]
在本发明的一个实施例中，该生物活性物质为抑制靶基因的表达的sirna，例如anti-kdr sirna。
[0058]
具体地，该生物活性物质可用于预防和/或治疗选自以下的一种或多种疾病：癌症、炎症、纤维化疾病、自身免疫病、病原体感染引起的疾病、精神性病症、血液病、染色体疾病、遗传病、结缔组织疾病、消化性疾病、耳鼻喉疾病、内分泌疾病、眼病、生殖性疾病、心脏病、肾病、肺病、代谢性病症、口部疾病、肌肉骨骼疾病、营养性疾病、皮肤疾病等疾病。
[0059]
具体地，该药物组合物中，生物活性物质与第一方面所述化合物或第三方面所述的脂质组合物的摩尔比为0.01-0.5:1(例如0.01:1、0.02:1、0.03:1、0.04:1、0.05:1、0.06:1、0.07:1、0.08:1、0.09:1、0.1:1、0.2:1、0.3:1、0.4:1、0.5:1)，特别是0.01-0.1。
[0060]
具体地，该药物组合物中还可以包含一种或多种药学上可接受的辅料，例如，载体、佐剂、稀释剂等。
[0061]
在本发明的一些实施例中，上述药学上可接受的辅料为药学上可接受的注射剂辅料，例如等渗的无菌盐(磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁等，或上述盐的混合物)溶液。
[0062]
具体地，上述药物组合物可以采用任何合适的给药途径，例如胃肠道给药或非胃肠道给药(例如，静脉内、肌内、皮下、器官内、鼻内、皮内、滴注、脑内、直肠内等)途径；上述药物可以为任何合适的剂型，例如经胃肠道给药剂型，例如，包括，但不限于，片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、锭剂、糖浆剂、液体、乳剂、混悬剂等；非经胃肠道给药剂型，例如，注射给药剂型：如注射剂(例如，用于皮下注射、静脉注射、肌内注射、腹膜内注射)，呼吸道给药剂型：如喷雾剂、气雾剂、粉雾剂等，皮肤给药剂型，如外用溶液剂、洗剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、贴剂等，粘膜给药剂型：如滴眼剂、眼用软膏剂、滴鼻剂、含漱剂、舌下片剂等，腔道给药剂型：如栓剂、气雾剂、泡腾片、滴剂、滴丸剂等，用于直肠、阴道、尿道、鼻腔、耳道等。特别是注射给药剂型。
[0063]
具体地，上述药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。
[0064]
在本发明第六方面，提供第一方面所述化合物或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药和溶剂化物、第四方面所述的脂质组合物在生物活性物质的递送系统的制备、在生物活性物质的递送中的应用。
[0065]
具体地，在该应用中，生物活性物质具有本发明第四方面中所述定义。
[0066]
具体地，上述生物活性物质的递送系统为脂质纳米颗粒(lnp)。
[0067]
在本发明第七方面，提供第一方面所述化合物或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药和溶剂化物、第四方面所述的脂质组合物、第五方面所述的药物组合物在制备预防和/或治疗疾病的药物、在预防和/或治疗疾病中的应用。
[0068]
具体地，该疾病可以选自如下的一种或多种：癌症、炎症、纤维化疾病、自身免疫病、病原体感染引起的疾病、精神性病症、血液病、染色体疾病、遗传病、结缔组织疾病、消化性疾病、耳鼻喉疾病、内分泌疾病、眼病、生殖性疾病、心脏病、肾病、肺病、代谢性病症、口部疾病、肌肉骨骼疾病、营养性疾病、皮肤疾病等。
[0069]
具体地，病原体可以为微生物、寄生虫(原虫、蠕虫等)或其他媒介；其中，微生物可
选自：病毒、衣原体、立克次体、支原体、细菌、螺旋体、真菌等中的一种或多种。
[0070]
具体地，病毒例如，但不限于，腺病毒科(如腺病毒)、疱疹病毒科(如hsv1(口腔疱疹)、hsv2(外生殖器疱疹)、vzv(水痘)、ebv(埃-巴二氏病毒)、cmv(巨细胞病毒))、痘病毒科(如天花病毒、牛痘病毒)、乳多泡病毒科(如乳头瘤病毒(hpv))、细小病毒科(如b19病毒)、嗜肝dna病毒科(如乙型肝炎病毒)、多瘤病毒科(如多瘤病毒)、呼肠孤病毒科(如呼肠弧病毒、轮状病毒)、小核糖核酸病毒科(如肠道病毒、口蹄疫病毒)、嵌杯样病毒科(如诺沃克病毒、戊型肝炎病毒)、披膜病毒科(如风疹病毒)、沙粒病毒科(如淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒)、逆转录病毒科(hiv-1、hiv-2、htlv-1)、黄病毒科(如登革热病毒、寨卡病毒、乙型脑炎病毒、基孔肯亚病毒、黄热病病毒、丙型肝炎病毒、西尼罗病毒等)、正粘病毒科(如流感病毒(如甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒等))、副粘病毒科(如1型人副流感病毒(hpiv)、2型hpiv、3型hpiv、4型hpiv、仙台病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、新城疫病毒等)、布尼亚病毒科(如加利福尼亚脑炎病毒、汉坦病毒)、弹状病毒科(如狂犬病毒)、丝状病毒科(如埃博拉病毒、马尔堡病毒)、冠状病毒科(如hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、sars-cov、mers-cov、sars-cov-2等)、星状病毒科(如星状病毒)、博尔纳病毒科(如博尔纳病毒)病毒。
[0071]
在本发明的一些实施例中，病毒为冠状病毒，具体如hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、sars-cov、mers-cov、sars-cov-2等。
[0072]
在本发明的一些实施例中，病毒为正粘病毒，如流感病毒(如甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒等)。
[0073]
在本发明的一些实施例中，病毒为副粘病毒，如1型hpiv、2型hpiv、3型hpiv、4型hpiv、仙台病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒等。
[0074]
在本发明的一些实施例中，病毒为黄病毒，如登革热病毒、寨卡病毒、乙型脑炎病毒、基孔肯亚病毒、黄热病病毒、丙型肝炎病毒、西尼罗病毒等。
[0075]
在本发明的一些实施例中，病毒为乳头瘤病毒(hpv)。
[0076]
具体地，由病毒感染引起疾病包括但不限于，流感、sars、covid-19、病毒性肝炎(如甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎等)、腮腺炎、麻疹、登革热、寨卡病毒病、乙型脑炎、基孔肯亚病、黄热病、西尼罗病毒病、宫颈癌等。
[0077]
在本发明的一些实施例中，上述药物为预防疾病的药物，例如疫苗。
[0078]
在本发明另一些实施例中，上述药物为治疗疾病的治疗剂。
[0079]
在本发明第八方面，提供一种递送生物活性物质的方法，其包括以第一方面所述化合物或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药和溶剂化物或第四方面所述的脂质组合物制备生物活性物质的递送系统，然后通过该递送系统将生物活性物质递送给有此需要的受试者的步骤。
[0080]
具体地，在该方法中，生物活性物质具有本发明第四方面中所述定义。
[0081]
具体地，生物活性物质被包封在递送系统中。
[0082]
具体地，在该方法中，受试者可以为接受该方法的任何动物或其细胞(体外或原位)；更具体地，受试者为哺乳动物，例如，大鼠、小鼠、豚鼠、兔、犬、猴子或人类，特别是人类。
[0083]
在本发明第九方面，提供一种预防和/或治疗疾病的方法，其包括向有此需要的受
试者给与第五方面所述的药物组合物的步骤，或，以第一方面所述化合物或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药和溶剂化物或第四方面所述的脂质组合物制备生物活性物质的递送系统，然后通过该递送系统将生物活性物质递送给有此需要的受试者的步骤，或，采用第八方面所述的递送生物活性物质的方法的步骤。
[0084]
具体地，受试者为哺乳动物，例如，大鼠、小鼠、豚鼠、兔、犬、猴子或人类，特别是人类。
[0085]
采用本发明所述的脂质化合物制成的脂质纳米颗粒(lnp)递送anti-kdr sirna(抑制vegfr2 mrna表达的sirna进入细胞后，对kdr mrna有明显且持续的抑制作用，表明该脂质化合物及由其制备的脂质纳米颗粒能够将生物活性物质靶向有效地递送至目标细胞和部位，高效实现生物活性物质的药理作用，且本发明所述的脂质化合物分子量单一，有利于控制批次间差异，提高成药稳定性，降低免疫原性，有望用于相关药物的开发和应用。
附图说明
[0086]
图1所示为本发明实施例1制备的化合物1的质谱图。
[0087]
图2所示为本发明实施例2制备的化合物2的质谱图。
[0088]
图3所示为本发明实施例3制备的化合物3的质谱图。
具体实施方式
[0089]
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
[0090]
本发明中，术语“vegfr2”与“kdr”均代表血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2)，可互换使用。
[0091]
本发明中，术语“烷基”指的是直链或支链的且不含不饱和键的烃基，且该烃基以单键与分子其它部分连接。在本文中所使用的烷基通常含有1至10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个碳原子(即，c1-10烷基)，优选含有1至6个碳原子(即，c1-6烷基)。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、正己基、异己基等。如果烷基被环烷基取代，其相应为“环烷基烷基”，如环丙基甲基、环丙基乙基、环丁基甲基、环戊基甲基、环己基甲基等。如果烷基被芳基取代，那么其相应为“芳烷基”，如苄基、二苯甲基或苯乙基。如果烷基被杂环基取代，那么其相应为“杂环基烷基”。
[0092]
本发明中，术语“亚烷基”指的烷烃分子失去两个氢原子而成的烃基(二价烷基)，其可以是直链或支链且其以单键与分子其它部分连接。在本文中所使用的烷基通常含有1至10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个碳原子(即，c1-10亚烷基)，特别是含有1至6个碳原子(即，c1-6亚烷基)。亚烷基的实例如亚甲基(-ch
2-)、亚乙基(-ch2ch
2-)、亚丙基、亚丁基等。
[0093]
本发明中，术语“烯基”指的是至少含两个碳原子、至少一个不饱和键的直链或支链的烃基，且该烃基以单键与分子其它部分连接。在本文中所使用的烯基通常含有1至10(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)个碳原子(即，c1-10烯基)，优选含有1至6个碳原子(即，c1-6烯基)。烯基的实例包括但不限于乙烯基、1-甲基-乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基或丁烯基等。
[0094]
本发明中，术语“环烷基”是指脂环烃，在本文中所使用的环烷基通常含1至4个单
环和/或稠环、含3-18个碳原子，优选3-10(例如3、4、5、6、7、8、9、10)个碳原子(例如，c3-10环烷基，c3-6环烷基)，如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基或金刚烷基等。
[0095]
本发明中，术语“芳基”指的是任何从简单芳香环衍生出的官能团或取代基，包括单环的芳基基团和/或稠环的芳基基团，如包含1-3个环的、单环或稠环的且具有6-18(例如6、8、10、12、14、16、18)个碳环原子。本文中所使用的芳基通常为包含1-2个环的、单环或稠环的且具有6-12个碳环原子的芳基(即，c6-12芳基)，其中碳原子上的h可以被取代，例如被烷基、卤素等基团取代。所述芳基的实例包括但不限于苯基、对甲基苯基、萘基、联苯基、茚基等。
[0096]
本发明中，术语“卤素”是指溴、氯、碘或氟。
[0097]
本发明中，术语“杂环基”是指3至18元非芳香环基团，其包含2至17个碳原子以及1至10个杂原子。杂环基可以为单环、双环、三环、或四环的环系统，其可包含稠合的、螺环的或桥接的环系统。杂环基可以是部分饱和的(杂芳基)或完全饱和的(杂环烷基)。本发明的化合物中的合适的杂芳基含1、2或3种杂原子，所述杂原子选自n、o或s原子，所述杂芳基包括，如，香豆素，包括8-香豆素、喹啉基，包括8-喹啉基、异喹啉基、吡啶基、吡嗪基、吡唑基、嘧啶基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、噻唑基、异噻唑基、三唑基、四唑基、异噁唑基、噁唑基、咪唑基、吲哚基、异吲哚基、吲唑基、吲嗪基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、噁二唑基、噻二唑基、呋吖基、哒嗪基、三嗪基，噌啉基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并呋吖基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基和呋喃并吡啶基。本发明的化合物中的合适的杂环烷基含1、2或3种杂原子，所述杂原子选自n、o或s原子，所述杂环烷基包括，如，吡咯烷基、四氢呋喃基、二氢呋喃、四氢噻吩基、四氢噻喃基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、氧硫杂环己烷基、哌嗪基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、高哌啶基、氧杂环丙烷基、硫杂环丙烷基、吖庚因基、氧氮杂环庚基基、二吖庚因基、三吖庚因基、1,2,3,6-四氢吡啶基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基，二氢吲哚基、2h-吡喃基、4h-吡喃基、二氧杂环己烷基、1,3-二氧戊环基、吡唑啉基、二噻烷基、二硫戊环基、二氢吡喃基、二氢噻吩基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、3-氮杂双环[3.1.0]己基、3-氮杂双环[4.1.0]庚基、3h-吲哚基和喹嗪基。
[0098]
本发明所述的药学上可接受的盐中包括酸加成盐和碱加成盐。
[0099]
所述的酸加成盐包括但不限于来自无机酸诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸和膦酸的盐，以及来自有机酸如脂肪族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、链烷二酸、芳香酸和脂肪族和芳香族磺酸的盐。因此，这些盐包括但不限于硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、碘酸盐、乙酸盐、丙酸盐、辛酸盐、异丁酸盐、乙二酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、苦杏仁酸盐、苯甲酸盐、氯代苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、酞酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、苯基乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐和甲磺酸盐，还包含氨基酸的盐如精氨酸盐、葡糖酸盐、半乳糖醛酸盐等。酸加成盐可以通过以常规方式使游离碱形式与足够量的所需酸接触形成盐的方式制备。可通过使盐形式与碱接触重新生成游离碱形式，并且以常规方式分离该游离碱。
[0100]
本发明所述的碱加成盐是指与金属或者胺形成的盐，诸如碱金属和碱土金属的氢氧化物，或者与有机胺形成。用作阳离子的金属的例子包括但是不限于钠、钾、镁、和钙。适
当的胺的例子包括但是不限于n,n
′‑
二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺(乙烷-1,2-二胺)、n-甲基葡糖胺和普鲁卡因。碱加成盐可通过以常规方式使游离酸形式与足够量的所需碱接触形成盐的方式制备。可通过使盐形式与酸接触重新生成游离酸形式，并且以常规方式分离游离酸。
[0101]
本发明中，立体异构体包括对映体、非对映体和几何异构体的形式存在。本发明的一些化合物具有环烃基，其可在超过一个碳原子上被取代，在这种情况下，其所有的几何形式，包括顺式和反式，及其混合物，都处在本发明的范围内。所述的环烃基包括脂环烃基和芳基，其中脂环烃基可以为非芳香的单环、稠环、桥环或螺环的饱和或不饱和的环状烃基，芳基如苯基、萘基、菲基、联苯基等。
[0102]
本发明中，溶剂化物是指本发明的化合物与一种或多种溶剂分子的物理结合。该物理结合包括各种程度的离子和共价键合，包括氢键合。在某些情况下，溶剂化物可被分离出来，例如当一个或多个溶剂分子掺入到结晶固体的晶格中。溶剂化物包括溶液相和可分离的溶剂化物。代表性的溶剂化物包括乙醇化物、甲醇化物等。
[0103]
本发明中，前药指适于对患者给药的无过分毒性、刺激性和变态反应等的并且对其应用目的有效的式ⅰ化合物形式，包括缩醛、酯和两性离子形式。前药在体内转化，如通过在血液中水解，得到母体化合物。
[0104]
本发明中，术语“核酸”是指呈单链或双链形式的含有至少两种脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物，并且包括dna、rna及其杂交物。
[0105]
本发明中，术语“脂质”是指一组有机化合物，其包括但不限于脂肪酸的酯，并且通常以难溶于水但可溶于许多有机溶剂为特征。
[0106]
本发明中，术语“阳离子脂质”是指能够带正电的脂质分子。
[0107]
本发明中，术语“中性脂质”是指不带电荷的、非磷酸甘油酯的脂质分子。
[0108]
本发明中，术语“脂质纳米颗粒”是指具有至少一个纳米量级尺寸的颗粒，其包含至少一种脂质。
[0109]
本发明中，术语“疫苗”是指适合于应用于动物(特别是哺乳动物，例如人类)的组合物，在施用后诱导免疫应答，其强度足以最低限度地帮助预防、改善或治愈起因于由微生物感染的临床疾病。
[0110]
本发明中，术语“递送系统”是指调控生物活性成分在空间、时间及剂量在生物体内分布的制剂或组合物。
[0111]
在本发明中，术语“患者”或“受试者”等等在本文中可交换使用，是指根据本文所述的方法治疗的任何动物或其细胞，可以是体外或原位。具体地，前述动物包括哺乳动物，例如，大鼠、小鼠、豚鼠、兔、犬、猴子或人类，特别是人类。
[0112]
在本发明中，术语“治疗”是指在疾病发作之后预防、治愈、逆转、减弱、减轻、最小化、抑制、制止和/或停止疾病的一种或多种临床症状。
[0113]
在本发明中，术语“预防”指在疾病发作之前，通过治疗以避免、最小化或令疾病难于发作或发展。
[0114]
本文所引用的各种出版物、专利和公开的专利说明书，其公开内容通过引用整体并入本文。
[0115]
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所
描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0116]
实施例1：化合物1的合成
[0117][0118]
1.化合物1a的合成
[0119][0120]
将十四胺(3.0g，14mmol)和十四溴(3.9g，14mmol)溶于20ml乙腈中，加入碳酸钾(1.9g，14mmol)，混合物在80℃下搅拌12小时。原料反应完全后，冷却至室温，抽滤，滤渣用二氯甲烷洗涤，得到的滤液中加入饱和碳酸氢钠溶液，用二氯甲烷萃取2次，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，经柱层析分离，得到化合物1a(3.9g，白色固体)，产率68％。ms m/z(esi):410.40[m 1]。
[0121]
2.化合物1的合成
[0122][0123]
将化合物1a(0.576g，1.4mmol)和(2g，1mmol)加入到含有二氯甲烷(20ml)的100ml单口瓶中，搅拌溶解，再依次加入diea(260mg，2mmol)和hatu(760mg，2mmol)，室温搅拌5小时。将反应体系过滤，母液真空浓缩，浓缩后加入40ml净化水，搅拌溶解后用乙酸乙酯洗涤3次，每次使用40ml，(洗涤过程会乳化，加少量乙醇进行破乳)。洗涤后向水相加入6g氯化钠搅拌溶解，使用二氯甲烷萃取水相二次，每次使用20ml。合并有机相，无水硫酸钠干燥，抽滤，将滤液真空浓缩，加入30ml异丙醇和10ml乙酸乙酯，加热至40℃条件下溶解，降温至零下15℃析晶，抽滤。滤饼真空干燥得到产品化合物1(1.5g，白色固体)，收率62.5％。ms m/z(esi):2582.76[m nh4]

；
[0124]
1h-nmr(300mhz,dmso)δ:2.96(2h,s),3.1～3.8(180h,m),1.46(4h,m),1.24(44h,m),0.86(6h,t)。
[0125]
实施例2：化合物2的合成
[0126][0127]
氮气氛围下，将lialh4(380mg，10mmol)缓慢加入冰水浴中装有30ml四氢呋喃的三
口瓶中。将化合物1(2g，1mmol)溶解在10ml四氢呋喃中，并缓慢滴加至反应瓶中，3小时后向反应体系滴加10ml净化水，使用硅藻土过滤体系，将滤液真空浓缩，加入20ml异丙醇和6ml乙酸乙酯，加热至40℃条件下溶解，冰水浴降温至析晶，抽滤。滤饼真空干燥得到产品化合物2(1.3g，白色固体)，收率64％。ms m/z(esi):2551.76[m h]

；
[0128]
1h-nmr(300mhz,dmso)δ:3.2～3.8(180h,m),2.36(4h,t),2.26(4h,m),1.53(2h,m),1.22(44h,m),0.84(6h,t)。
[0129]
实施例3：化合物3的合成
[0130][0131]
1.化合物3a的合成
[0132][0133]
将(40g，20mmol)和纯化水(0.4ml)加入到含有thf(400ml)的1l三口瓶中，搅拌溶解，再依次加入naoh(6.4g，160mmol)和环氧氯丙烷(37g，400mmol)，加热回流18小时。补加naoh(3.2g，80mmol)和环氧氯丙烷(18.5g，200mmol)继续反应18小时。将反应体系降温至室温，用硅藻土过滤，向母液中加入ph＝7的磷酸盐(100ml)缓冲液，真空浓缩除去thf，浓缩后加入纯化水(200ml)，用乙酸乙酯洗涤2次，每次使用100ml。洗涤后向水相加入45g氯化钠搅拌溶解，使用二氯甲烷萃取水相二次，每次使用100ml。合并有机相，无水硫酸钠干燥，抽滤，将滤液真空浓缩，加入400ml异丙醇重结晶，抽滤，滤饼真空干燥得到产品化合物3a(34g，淡黄色固体)，收率85％。ms m/z(esi):2114.41[m h]

；
[0134]
1h-nmr(300mhz,dmso)δ:3.3～3.85(184h,m),3.28(1h,t),3.28(3h,s),3.1(1h,m),2.7(1h,t),2,55(1h,m)。
[0135]
2.化合物3b的合成
[0136][0137]
将化合物3a(30g，15mmol)溶解在2mol/l氢氧化钾溶液中(300ml)室温搅拌12小时，加入45g氯化钠搅拌溶解，使用二氯甲烷萃取水相二次，每次使用150ml。合并有机相，无水硫酸钠干燥，抽滤，将滤液真空浓缩，加入450ml甲基叔丁基醚沉淀出固体，抽滤，滤饼真空干燥得到产品化合物3b(28g，淡黄色固体)，收率93.3％。ms m/z(esi):2132.43[m h]

；
[0138]
1h-nmr(300mhz,dmso)δ:4.6(1h,s),4.45(1h,s),3.3～3.8(189h,m),3.25(3h,
s)。
[0139]
3.化合物3的合成
[0140][0141]
将化合物3b(20g，10mmol)加入到含有dcm(200ml)的500ml单口瓶中，搅拌溶解，再依次加入十四酸(6.4g，28mmol)和dmap(489mg，4mmol)，置于冰水浴中。用40ml dcm将dcc(5.8g，28mmol)溶解后滴加至反应体系。16小时后，将反应体系过滤，母液真空浓缩除去二氯甲烷，加入300ml异丙醇和100ml乙酸乙酯，加热至40℃条件下溶解，降温至零下10℃析晶，抽滤。滤饼真空干燥得到产品化合物3(17g，淡黄色固体)，收率85％。ms m/z(esi):2569.70[m nh4]

；
[0142]
1h-nmr(300mhz,dmso)δ:5.1(1h,s),4.28(1h,m),4.1(1h,m),3.3～3.8(183h,m),3.24(3h,s),2.25(4h,t),1.5(4h,m),1.24(44h,m),0.86(6h,t)。
[0143]
实施例4：sirna:聚乙二醇脂质(peg-脂)颗粒组合物在arpe-19细胞中进行细胞递送后基因抑制效果
[0144]
1、细胞培养和转染
[0145]
细胞名称：arpe-19
[0146]
(1)将arpe-19细胞使用dmem/f12 12％fbs 双抗的培养基(含100u/ml penicillin，100μg/ml streptomycin)，37℃5％co2饱和湿度培养箱中培养。实验前24h以每孔1.2
×
105细胞接种于12孔板中培养过夜。
[0147]
(2)取50μl opti-mem培养基分别稀释2.5ml anti-kdr sirna:化合物1＝1:10、anti-kdr sirna:化合物2＝1:10、anti-kdr sirna:化合物3＝1:10、(以上比例为摩尔比，sirna浓度为20μm)，阳性对照取50μl opti-mem培养基稀释3μl lipofectamine 3000
tm
转染试剂，二者混合，轻轻摇匀，静置15min。此外，设置blank组、nc组和nc-rl组。
[0148]
化合物1、化合物2、化合物3分别由实施例1-3制备得到。
[0149]
anti-kdr sirna是指抑制vegfr2 mrna表达的sirna，其制备方法记载于专利文献cn202010229195.2，序列为：
[0150]
正义链：5
′‑
ggagugagaugaagaaauu-3
′
；
[0151]
反义链：5
′‑
aauuucuucaucucacucc-3
′
。
[0152]
(3)细胞板中各孔细胞进行换液，添加无抗生素培养基，每孔体积900μl，然后各孔加入上述混合液100μl，最终每孔总体积1000μl。sirna(或sirna nc或sir-nc rl)转染浓度均为50nm。
[0153]
(4)转染24h和48h后将12孔板从37℃，5％co2的培养箱中取出，收集细胞用于提取rna进行后续检测。
[0154]
2、rna提取
[0155]
(1)采用promega公司rna提取试剂盒说明提取rna。简言之，在pbs洗涤细胞后，加入300μl裂解液，用移液器吹打细胞，充分裂解后加入300μl稀释液，然后70℃水浴3min。
14000rpm离心10min，将上清液转移至新的1.5ml ep管中，加入300μl无水乙醇，充分混匀后，加入吸附柱中。14000rpm离心1min，弃去滤液，加入600μl洗涤液，再次离心1min。弃去滤液，每孔中加入现配的50μl dna酶反应液，室温静置15min；加入600μl洗涤液，离心1min；弃去滤液后再加入600μl洗涤液再次离心1min；弃去滤液，离心2min，每孔中加入50μl无核酸酶水，室温静置5min，然后离心收集洗脱的rna。
[0156]
(2)rna质检，nanodrop检测rna含量和纯度，1％琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性。
[0157]
3、q-pcr检测流程
[0158]
(1)rna反转录
[0159]
以样品提取的总rna作为模板，使用promega反转录试剂盒，建立如下反应体系：
[0160]
表1 rna反转录体系
[0161][0162]
以上体系混匀，离心收集液体至管底，42℃60min，72℃10min；产物即为cdna模板。
[0163]
(2)荧光定量pcr检测
[0164]
使用tb green premix ex taq ii(tli rnaseh plus)(promega)试剂，建立反应体系如下：
[0165]
表2荧光定量pcr反应体系
[0166][0167]
按如下程序进行pcr扩增
[0168]
95℃预变性10min，然后进入如下循环
[0169]
*95℃10s
[0170]
60℃20s
[0171]
70℃10s
[0172]
读板
[0173]
返回*共进行40个循环。
[0174]
制作熔解曲线：65℃至95℃之间，每0.5℃读板一次并停5s。
[0175]
4、基因抑制效果
[0176]
以gapdh为内参基因，通过δδct法计算kdr mrna的相对表达量；以blank组表达水平为100％，对各组mrna表达水平进行标准化。
[0177]
结果显示，本发明涉及的sirna处理的细胞中kdr mrna相对于blank组、sinc组和sinc rl组的相对表达水平在24h时有明显下降，并在转染后48h时有进一步的表达下降，这表明采用本发明的化合物1-3与sirna组成的颗粒对kdr mrna有明显且持续的抑制作用。
[0178]
实施例5：sirna:peg-脂颗粒组合物在a375细胞中进行细胞递送后基因抑制效果
[0179]
前述操作除a375细胞的培养基为含10％fbs的dmem培养基(含100u/ml penicillin，100μg/ml streptomycin)外，其余操作与实施例4相似。结果显示，本发明涉及的sirna处理的细胞中kdr mrna相对于blank组、sinc组和sincrl组的相对表达水平在24h时有明显下降，并在转染后48h时有进一步的表达下降，表明采用本发明的peg-脂与sirna制成的颗粒(化合物1、化合物2、化合物3)对kdr mrna有明显且持续的抑制作用。
[0180]
实施例6：peg-脂/阳离子脂质/中性脂质/甾族脂质-sirna纳米颗粒(lnp)在arpe-19细胞中进行细胞递送后基因抑制效果
[0181]
各组peg-脂/阳离子脂质/中性脂质/甾族脂质-sirna纳米颗粒(lnp)配方及制备方法如下：
[0182]
将化合物1/alc-0315/dspc/胆固醇按照摩尔比46.3％/1.7％/9.4％/42.6％的比例溶解在无水乙醇中，配成10mmol/l混合液，然后加入ph＝4的柠檬酸缓冲液，制成含有四种脂质的30％乙醇-柠檬酸溶液，用0.1μm的过滤膜过滤备用。将anti-kdr sirna按照2mg/ml的浓度溶解在不含脂质的30％乙醇-柠檬酸溶液中，然后与上述含有四种脂质的30％乙醇-柠檬酸溶液按照anti-kdr sirna：脂质的质量比为0.06：1进行混合，孵育30分钟，用ph＝7.4的pbs透析16小时以上，冷冻干燥得含有anti-kdr sirna的脂质纳米颗粒。其他各组不同peg脂离子脂质纳米颗粒(化合物1替换为化合物2或化合物3)的配制方法同化合物1。
[0183]
结果表明，采用本发明的peg-脂/alc-0315/dspc/胆固醇与sirna制成的各组脂质纳米颗粒递送anti-kdr sirna入细胞后，对kdr mrna有明显且持续的抑制作用。
[0184]
实施例7：peg-脂/阳离子脂质/中性脂质/甾族脂质-mrna纳米颗粒在293t细胞中进行细胞递送后基因表达效果
[0185]
各组peg-脂/阳离子脂质/中性脂质/甾族脂质-sirna纳米颗粒(lnp)配方及制备方法如下：
[0186]
将化合物1/alc-0315/dspc/胆固醇按照摩尔比46.3％/1.7％/9.4％/42.6％的比例溶解在无水乙醇中，配成10mmol/l混合液，然后加入ph＝4的柠檬酸缓冲液，制成含有四种脂质的30％乙醇-柠檬酸溶液，用0.1μm的过滤膜过滤备用。将gfp mrna按照2mg/ml的浓度溶解在不含脂质的30％乙醇-柠檬酸溶液中，然后与上述含有四种脂质的30％乙醇-柠檬酸溶液按照gfp mrna：脂质的质量比为0.06：1进行混合，孵育30分钟，用ph＝7.4的pbs透析16小时以上，冷冻干燥得含有gfp mrna的脂质纳米颗粒。其他各组不同阳离子脂质纳米颗粒(化合物1替换为化合物2、化合物3)的配制方法同化合物1。
[0187]
用荧光显微镜检测表达绿色荧光蛋白(gfp)的细胞数量确定lnp的转染效果，结果显示化合物1-3作为peg脂的lnp组均有很好的递送效果。
[0188]
实施例8：不同分子量的peg-脂在豚鼠的过敏反应研究
[0189]
1、动物分组
[0190]
取正常饲养5天的健康豚鼠48只，随机分为6组，每组8只。a组：阴性对照组(0.9％氯化钠注射液)；b组：阳性对照组(0.15mg/ml卵白蛋白液，卵白蛋白购自美国sigma公司，批
号dho15-4)；c组：m-peg47-dtdpam(即化合物1，实施例1制备)，d组：m-peg47-dtdpa(即化合物2，实施例2制备)，e组：m-dtdpam-2000(天津键凯科技有限公司提供，批号zz409p002)，f组：m-dtdpa-2000(天津键凯科技有限公司提供，批号zz409p004)。
[0191]
2、给药方法
[0192]
采用腹腔注射法致敏，给药体积为1ml/只，隔日1次，共4次。末次致敏后第2天，各组豚鼠由足趾静脉注射相应药液进行激发，激发剂量为2ml/只。致敏期间每日观察动物状态，静脉注射激发前15min及注射后连续观察豚鼠反应40min，记录症状出现时间、消失时间。激发停药40min后取血，肝素抗凝，制备血浆。
[0193]
3、观察指标
[0194]
动物反应症状致敏期间及激发给药时，观察并记录动物的反应症状及持续时间，如搔鼻、喷嚏、不安宁、跳跃、喘息、紫癜等，并根据全身致敏性反应症状分级标准(表3)判断反应症状的评分及级别。
[0195]
表3全身致敏性反应症状分级标准
[0196][0197]
4、实验结果：
[0198]
(1)全身过敏实验结果
[0199]
豚鼠反应症状各组动物在首次致敏时，均未出现异常症状。致敏期间饮食、饮水、行为均未见异常，体重正常增长。a组动物在激发给药后均未出现过敏反应；b组激发给药后出现强烈过敏反应，表现为痉挛、紫癜、步态不稳、喘息、跳跃、流泪、精神萎靡；c组有3只豚鼠在激发给药后10～35min出现偶有搔抓、不安宁的症状，d组有2只动物有上述症状。e组有4只豚鼠出现喷嚏、咳嗽、呼吸急促等症状，1只出现竖毛、发抖等症状；f组有3只豚鼠出现喷嚏、咳嗽、呼吸急促等症状，2只豚鼠出现发抖、搔鼻症状；其他豚鼠均无异常。根据表3判断各组豚鼠反应症状级别，b组为极强阳性，c组和d组为弱阳性，e组和f组为阳性。但c组和d组无论是过敏反应出现次数还是发生程度都低于e组和f组。提示单一分子量的peg-脂的对豚鼠的致敏性要低于非单一分子量的peg-脂。各组豚鼠激发给药后反应症状分级结果见表4。
[0200]
表4不同分子量的peg-脂导致豚鼠过敏反应结果
[0201]
代号组别平均评分致敏性症状a组阴性对照组0阴性b组阳性对照组2.8强阳性c组m-peg47-dtdpam0.375弱阳性d组m-peg47-dtdpa0.25弱阳性e组m-dtdpam-20001.125阳性f组m-dtdpa-20001阳性
[0202]
(2)血浆ige及组胺含量比较
[0203]
各组动物激发给药后，血浆ige含量均高于a组，升高程度均低于100％。c组和d组动物血浆ige含量明显低于e组和f组。
[0204]
各用药组血浆组胺含量均高于a组，其中b组组胺含量与a组比较有显著性差异(p《0.05)；e组和f组血浆组胺含量明显高于a组，有统计学差异。而c组和d组血浆组胺含量虽有所升高，但远低于e组和f组，与a组相比，无统计学差异。
[0205]
表5各组豚鼠激发给药后血浆中ige及组胺含量(ng/ml)
[0206]
代号组别ige含量(ng/ml)组胺含量(ng/ml)a组阴性对照组204.83
±
18.654.92
±
0.98b组阳性对照组286.33
±
34.6712.21
±
4.25c组m-peg47-dtdpam235
±
26.795.23
±
1.21d组m-peg47-dtdpa225
±
31.446.71
±
2.10e组m-dtdpam-2000255
±
25.788.89
±
2.54f组m-dtdpa-2000248
±
34.118.23
±
2.23
[0207]
结论：豚鼠全身过敏实验结果显示，非单一分子量的peg-脂呈阳性结果，而单一分子量的peg-脂呈弱阳性结果，提示与非单一分子量的peg-脂相比，单一分子量的peg-脂免疫原性降低。血浆ige及组胺含量检测结果也支持该结论。
[0208]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0209]
本发明中描述的前述实施例和方法可以基于本领域技术人员的能力、经验和偏好而有所不同。
[0210]
本发明中仅按一定顺序列出方法的步骤并不构成对方法步骤顺序的任何限制。