一种基于CRISPR的H5N1病毒检测新方法

一种基于crispr的h5n1病毒检测新方法
技术领域
1.本发明涉及生物诊断技术领域，具体提供了一种基于crispr的h5n1病毒检测新方法。


背景技术：

2.cas13a是一种仅靶向rna而不靶向dna的新型crispr酶。其具有加工crrna和crrna介导的rna靶向剪切的双重活性，在crrna的引导下能够准确识别靶向rna片段，激活后特异性剪切靶向片段。crrna包括短发卡结构和间隔序列，cas13a通过识别其中的短发卡结构并与其形成复合物，并通过间隔序列片段识别互补靶区域，并进行特异性识别剪切，它的剪切依赖于间隔序列侧翼位点结构，即在原间隔序列前的碱基应当为a、c或u。有趣的是，研究发现cas13a还具备“附带剪切”的非特异性的rna核糖核苷酸酶(rnase)活性，在识别rna并进行特异性剪切之后，并没有失去活性，随后会对附近的单链rna片段继续进行无差别的剪切。2017年4月，美国研究人员建立了一种灵敏度达到埃摩级(单拷贝)，特异性达到单碱基的核酸检测技术——基于crispr-cas13a的核酸检测平台sherlock(specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking)，利用cas13a蛋白(lwcas13a)的非特异剪切活性，结合可以高效扩增目的片段的重组聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，rpa)，将样本中dna或rna进行扩增，扩增后的dna在进行t7核糖核酸聚合酶介导的转录后，引入cas13a工具进行检测，一旦含有标靶rna序列，便会大量剪切报告分子，检测到荧光信号，使得检测阈值可以达到单拷贝级别。
3.甲型h5n1流感病毒，是甲型流感病毒的一个高致病性亚型，具有血凝素第5型，神经氨酸酶第1型。h5n1病毒起源于家禽和野生鸟类，可传染给人类。自2003年11月以来，亚洲、非洲、太平洋、欧洲和中东的15个国家报告了约700例人感染高致病性h5n1型禽流感。2021年7月21日，印度全印医学科学院报道，1名11岁男童因感染h5n1型禽流感病毒于当日在该机构死亡。而快速诊断对于尽早地发现流感病毒的存在，防止病毒的进一步传播具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种基于crispr与重组酶介导等温核酸扩增技术(recombinase aided amplification，raa)结合的检测h5n1病毒的新方法。该方法包括以下步骤：
5.1、合成与纯化携带ha基因的质粒，体外转录mrna，模拟病毒核酸样本。
6.2、设计rt-raa引物对核酸样本进行扩增反应
7.参与该反应的试剂为：步骤1获得的核酸样本、上游引物、下游引物、buffer a、buffer b(来自杭州众测生物科技有限公司)
8.所述rt-raa扩增的反应条件为：37-42℃反应30min
9.所述rt-raa扩增引物由seq id no.1所示的单链dna分子和seq id no.2所示的单
链dna分子组成。
10.3、设计crrna序列并通过体外转录合成
11.合成两种不同的引物序列，退火后形成双链dna片段，再通过连接酶与载体相连，筛选得到正确的基因克隆。然后体外转录、纯化得到crrna。
12.所述合成crrna引物序列如seq id no.3所示。
13.4、表达与纯化cas13a蛋白
14.5、基于crispr cas13a与raa技术结合的新方法进行样本检测
15.参与该反应的试剂包括：raa扩增产物，cas13a蛋白，crrna，报告rna(rnasealertv2)，缓冲液(hepes、mgcl2)，ntp mix，rnase抑制剂，t7聚合酶。
16.所述检测条件为混匀上述组分后立即放入实时荧光定量pcr仪中，检测程序为：fam通道检测荧光信号变化，37℃反应30s，37℃反应2min(收集荧光)，共40-60个循环。
17.有益效果：本发明基于crispr-cas13a核酸检测技术，通过设计、构建、筛选，最终提供一对用于h5n1病毒ha基因高效特异raa扩增的引物和靶向该靶点序列的特异性crrna，该方法实现对h5n1病毒核酸的高灵敏、高特异便捷检测，灵敏度达到10copies/μl。
附图说明
18.图1为琼脂糖凝胶电泳检测4个引物对的扩增效率。
19.图2为对不同浓度mrna模板灵敏度检测结果。
20.图3为对不同浓度mrna模板重复性检测结果。
21.图4为本发明方法特异性检测结果。
具体实施方式
22.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
23.下述实施例中涉及的试剂及其来源如下：ntp mix(solarbio)，报告rna试剂盒(rnasealertv2)，琼脂糖凝胶电泳dna纯化回收试剂盒(天根生化)，rna合成试剂盒(k1047)，rna酶抑制剂(murine rnase inhibitor)，rna纯化磁珠(agencourtrnacleanxp，beckman coulter)，氨苄西林钠(华北制药股份有限公司)，hepes缓冲液(索莱宝，yz-b-hepes250)，mgcl2溶液(天根生化，rp107)
24.实施例1、用于本发明的样本、rt-raa引物、crrna和cas13a蛋白设计和制备
25.1、样本的制备
26.h5n1病毒ha基因为本实验室合成，转录后以模拟病毒核酸。具体步骤如下：(1)mrna转录：取1μg经酶切回收的线性化质粒，使用t7转录试剂盒转录mrna转录体系如表1。
27.表1、mrna转录体系
28.名称用量reaction buffer2μlntps各2μlt7聚合酶2μl
dna模板1μg无酶水至20μl
29.上述mrna转录体系混匀后，37℃转录2.5h，加入2μl dnase，混匀，37℃孵育15min，去除多余的dna。
30.(2)mrna纯化
31.向转录产物中加入160μl无酶水，20μl 3m醋酸钠补至200μl。加入等体积1：1的苯酚/氯仿溶液，混匀后在4℃条件下14000rpm/min离心5min，取上层。加入等体积氯仿萃取两次。加入600μl无水乙醇混匀后在-20℃放置至少30min。离心得到白色沉淀，加入500μl 70％乙醇洗涤。最后加入适量无酶水溶解，并分装于-80℃长期保存。
32.2、rt-raa引物的设计与筛选
33.(1)根据raa引物设计原则设计旨在用于crispr检测的h5n1特异性rt-raa引物，经筛选后确定引物对f3和r3的序列进行后续扩增(如seq id no.1和seq id no.2所示)
34.(2)rt-raa扩增产物的获得
35.以mrna样本作为模板，采用f3、r3为引物，利用rt-raa扩增试剂盒进行rt-raa扩增，得到rt-raa扩增产物。rt-raa扩增体系如表2所示
36.表2、rt-raa扩增体系
37.名称用量反应干粉1管a buffer25μl上游引物(10μm)2μl下游引物(10μm)2μl水13.5μlrna样本5μlb buffer2.5μl
38.将混合好的47.5μl溶液加入到装有冻干粉的检测单元管中，向每个反应管加入2.5μl b buffer，瞬离并混合均匀。将上述反应管放置在37-42℃条件下反应30min。反应结束后取10μl反应产物进行琼脂糖凝胶电泳。
39.检测如图1所示，结果显示，正向引物f3与反向引物r3组合时扩增效率较高，而与其他正向引物组合时扩增效率欠佳。于是f3和r3组合作为最佳扩增引物用于针对h5n1病毒ha基因的rt-raa扩增
40.3、crrna设计和制备
41.根据cas13a蛋白的特点，在扩增的基因片段序列直接设计特异识别h5n1病毒ha基因的crrna并克隆到载体继续转录或直接进行体外合成。
42.crrna的转录步骤同上述1中mrna制备的方法。纯化步骤如下：向转录产物中加入1.8倍体积的磁珠(agencourt rnacleanxp)，涡旋30s以混匀，室温静置5min。将反应体系放到磁力架，静置5-10min以分离磁珠。轻轻吸出体系中的液体，避免磁珠被吸出，向磁珠中加入200μl 70％的乙醇，室温孵育30s，吸出乙醇；重复此过程清洗磁珠，共3次。室温晾干体系，去除体系中的乙醇，约10min。加入50μl rnase-free水，涡旋30s，吸出上清液，放入无rnase的1.5ml离心管中，nanodrop测定纯化得到的crrna浓度，-80℃分装备用。
43.实施例2、h5n1病毒灵敏度、重复性与特异性检测
44.1、本发明方法的灵敏度检测
45.将实施例1中步骤1的获得的mrna模板进行梯度稀释，浓度依次为103copies/μl、102copies/μl、101copies/μl、100copies/μl。分别经rt-raa扩增得到rt-raa产物。检测体系如表3
46.表3、crispr cas13a检测体系
47.名称用量rt-raa产物5μlcas13a蛋白45nmntp mix2μlt7 rna聚合酶1μlrna酶抑制剂1μlcrrna22.5nm报告rna4μlhepes缓冲液1μlmgcl2溶液1μl无酶水至20μl
48.将表3中的rt-raa产物扩增模板替换为ddh2o，且保持其他试剂组分不变，即为阴性对照。上述反应体系混匀后立即放入荧光定量pcr仪，fam通道检测荧光信号变化，37℃反应30s，37℃反应2min(收集荧光)，共40-60个循环，检测体系中荧光强度变化。
49.检测结果如图2所示。检测灵敏度可以达到10copies/μl，实现快速灵敏的检出结果。
50.2、本发明方法的重复性检测
51.103copies/μl、102copies/μl、101copies/μl三个浓度为的mrna模板进行重复性检测。反应体系及程序同实施例2的步骤1。反应终点检测荧光强度。
52.检测结果如图3所示。三个浓度的mrna模板均表现出良好的重复性。
53.3、本发明方法的特异性检测
54.以甲流病毒h1n1、5型腺病毒(ad5)、新冠病毒基因(sars-cov-2)为模板，按照实施例2步骤1体系检测不同病毒以验证本发明方法的特异性。
55.检测结果如图4所示。检测终点，含有ha基因的实验组荧光强度显著高于其他病毒组和阴性对照组。说明本发明的基于raa扩增的crispr-cas13a系统检测h5n1病毒核酸的方法具有很高的特异性，检测过程中不存在交叉反应。
56.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。