一种锦鲤鳍组织细胞系及其应用的制作方法

1.本发明涉及水生生物细胞领域，具体而言，涉及一种锦鲤鳍组织细胞系及其应用。


背景技术：

2.锦鲤(cryprinuscarpiod)，以其绚丽的色彩、华丽的斑纹、雄健的身躯、温顺的习性而享誉世界，被人们称为“水中瑰宝”、“会游泳的艺术品”，是世界上最受欢迎的大型观赏鱼之一。锦鲤除具观赏价值外，还是营养丰富、肉质细嫩的食用鱼。
3.近年来，随着环境污染的日益加剧和养殖业的过度膨胀，锦鲤的病害问题日趋严重，各种传染性疾病尤其是病毒病的暴发，造成锦鲤死亡率逐年上升，极大地影响了锦鲤养殖业、观赏业、国际贸易出口业，经济损失严重。锦鲤疱疹病毒病由锦鲤疱疹病毒(koi herpesvirus，khv3)引起，主要感染锦鲤和鲤鱼，是锦鲤和鲤鱼养殖生产中发生的一种高致病性疾病，发病率和致死率均可高达80％-100％。1998年在以色列的magan michael地区暴发了锦鲤疾病，经鉴定其病原为khv3，导致渔场损失肉用鲤鱼600吨，出口损失近400万美元。随后该病传播与蔓延到美国、欧洲大陆、亚洲等；近年来我国已有该病毒病例的报道。khv3非常特殊，只能在源自于原始宿主的细胞中增殖，即在锦鲤组织细胞中增殖，很难在鱼类病毒分离常用的细胞系中增殖。因此，建立来源于锦鲤的细胞系，是进行锦鲤疱疹病毒的分离与鉴定，研究其致病机理，疫苗制备和免疫预防技术的重要基础。
4.目前，鱼类细胞的原代培养技术基本上可以分为两种，组织块培养法和消化培养法。消化法目前常用的是胰酶消化，但胰酶活力较高容易对一些上皮细胞造成损伤，时间难以把握，同时对纤维和结缔组织无效；组织块培养法易产生机械损伤，易造成细胞不迁出或迁出细胞有选择性。
5.因此，如何构建或丰富对锦鲤疱疹病毒敏感的细胞系成为了亟待解决的问题之一。
6.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种锦鲤鳍组织细胞系及其应用。
8.本发明是这样实现的：
9.第一方面，本发明实施例提供了一种锦鲤鳍组织细胞系，其保藏号为：cctcc no:c2021126。
10.第二方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的锦鲤鳍组织细胞系在蛙虹彩病毒lmbv培养中的应用。
11.第三方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的锦鲤鳍组织细胞系在分离蛙虹彩病毒中的应用。
12.第四方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的锦鲤鳍组织细胞系在制备用于检测蛙虹彩病毒的试剂中的应用。
13.第五方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的锦鲤鳍组织细胞系在制备蛙虹彩病毒疫苗中的应用。
14.第六方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的锦鲤鳍组织细胞系在制备由蛙虹彩病毒导致的相关疾病的药物中的应用。
15.第七方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的锦鲤鳍组织细胞系在锦鲤疱疹病毒khv3培养和/或分离中的应用。
16.第八方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的锦鲤鳍组织细胞系在制备用于检测锦鲤疱疹病毒的试剂中的应用。
17.第九方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的锦鲤鳍组织细胞系在制备锦鲤疱疹病毒疫苗中的应用。
18.第十方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的锦鲤鳍组织细胞系在制备由锦鲤疱疹病毒导致的相关疾病的药物中的应用。
19.本发明具有以下有益效果：
20.本发明构建了一种锦鲤鳍组织细胞系，保藏号为：cctcc no:c2021126，其可以连续传代，现已传至60代次以上，一方面，其对锦鲤疱疹病毒khv3具有敏感性，接毒后3d可观察到细胞病变，7天细胞全部病变，10-14天细胞脱落死亡，经检测病毒滴度可以达到10
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/ml；另一方面，其对蛙虹彩病毒lmbv敏感，接毒后24℃培养，18h即可见50％细胞死亡，30h时基本上所有细胞脱落死亡，检测此时的病毒滴度为109tcid
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/ml。该细胞系具有广阔的应用前景，可应用于khv3、lmbv的病原特性研究以及相关疫苗的研制。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
22.图1为组织块培养的形态，其中a为组织块培养3d后的形态，b为组织块培养7d后的形态；
23.图2为传代培养的形态，其中a为传代培养20代的形态，b为传代培养35代的形态；
24.图3为锦鲤鳍组织细胞kf1124第60代的形态形态；
25.图4为锦鲤鳍组织细胞kf1124未感染khv3和感染khv3后的形态，其中a为未感染病毒的细胞第60代的形态，b为病毒感染第3天的形态，c为病毒感染第10天的形态；
26.图5为锦鲤鳍组织细胞kf1124未感染lmbv和感染lmbv后的形态，其中a为未感染病毒的细胞第60代的形态，b为病毒感染第1天的形态，c为病毒感染第3天的形态；
27.图6为lmbv病毒pcr检测结果；其中，m为dl 2000分子量标准；1为kf1124培养lmbv；2，3均为阴性对照；4为阳性对照(epc培养提取)。
具体实施方式
28.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建
议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
29.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
30.本发明实施例提供了一种锦鲤鳍组织细胞系(kf1124)，其保藏号为：cctcc no:c2021126。
31.保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址:中国.武汉，武汉大学，保藏日期：2021年11月19日，分类命名为锦鲤鳍组织细胞系kf1124，保藏编号：cctcc no:c2021126。
32.锦鲤鳍组织细胞系kf1124，首次传代细胞在4-8h即可贴壁生长，大约5d能生长成汇合细胞单层，细胞呈典型的成纤维样；连续传代15次后，传代细胞约3d即可汇合成细胞单层，5d可形成致密细胞单层。kf1124细胞经液氮冷冻后复苏，通过台盼蓝染色计数，约90％的细胞具有细胞活性，并保持原有生长状态，目前该细胞已经稳定传代60多次。
33.本发明构建的锦鲤鳍组织细胞系kf1124对锦鲤疱疹病毒khv3具有敏感性，接毒后3d可观察到细胞病变(cpe)，7天细胞全部病变，10-14天细胞脱落死亡，经检测病毒滴度可以达到10
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/ml，可以直接应用于khv3病原特性研究及其疫苗的研制。
34.此外，kf1124同属于鲤科，与鲤鱼上皮瘤细胞epc在一定程度上具有相似性。经验证，kf1124对蛙虹彩病毒敏感，接毒后24℃培养，18h即可见50％细胞死亡，30h时基本上所有细胞脱落死亡，检测此时的病毒滴度为109tcid
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/ml，因此该细胞系有多方面的应用，对蛙虹彩病毒的诊断检测、疫苗制备与免疫研究有重要意义。
35.kf1124是发明人经多次试验，基于大量的试验成本后获得的，构建方法如下。
36.(1)组织预处理
37.取体长10cm左右的锦鲤，置于75％酒精中浸泡30s-2min，转移到超净工作台中，用手术剪刀将鳍条剪下，用含双抗的pbs溶液洗涤3-5次，第一次洗涤时先将其浸泡30min，后面每次浸泡10min，以去除组织表面的细菌微生物；
38.(2)组织处理
39.将处理好的鳍组织，用无菌的眼科剪刀剪成1mm3左右大小的组织块，均匀移植到t25细胞培养瓶中，于23-30℃低温培养箱中倒置1-16h(温度越高，时间越短)，使组织块能贴壁并在后续的培养处理过程中不易脱落；
40.(3)原代细胞培养
41.往组织块贴壁良好的t25细胞培养瓶中，加入培养液，于23-30℃培养箱中培养，待观察到细胞从鳍组织边缘迁出后，每隔一段时间半量更换培养液；
42.(4)传代培养
43.当原代培养细胞长满培养瓶底70-90％时，弃去培养液，加入1ml胰蛋白酶液消化1-5min,消化后去除酶液，加入培养液将细胞吹下并混匀，根据细胞量确定以1:2还是1:3传代；传代培养至10-15代以后，将培养液中的胎牛血清含量降至8-15v/v％，并进行后续的传代培养。经过多次传代培养，获得了一种分离的锦鲤鳍组织细胞系kf1124。
44.优选地，步骤(1)的pbs中含100-600μg/ml青霉素和300-600μg/ml链霉素。
45.优选地，在步骤(3)原代培养过程中，细胞初次贴壁后，每隔5-7天半量更换一次培液，即用移液管从每个细胞培养瓶里吸出2.5ml旧培养液，以去除未贴壁的组织块以及死细胞，并添加2.5ml新鲜的细胞培养液。
46.新鲜的细胞培养液可以为l15基础培养基加入浓度为15-25v/v％的胎牛血清，适量青霉素、链霉素，ph为7.0-7.5。
47.优选地，步骤(4)中传代培养至10-15代以后，用不含生长因子，不含抗生素，且胎牛血清含量为8-15v/v％的培养液进行后续的传代培养。
48.本发明要求保护的kf1124是基于上述构建方法获得的，然而细胞系的获得与样本本身和构建方法中的刺激因素，重复该构建方法无法必然地获得本技术要求保护的细胞系。
49.本发明实施例还提供了如前述实施例所述的锦鲤鳍组织细胞系在蛙虹彩病毒培养中的应用。
50.本发明实施例还提供了如前述实施例所述的锦鲤鳍组织细胞系在分离蛙虹彩病毒中的应用。
51.本发明实施例还提供了如前述实施例所述的锦鲤鳍组织细胞系在制备用于检测蛙虹彩病毒的试剂中的应用。
52.本发明实施例还提供了如前述实施例所述的锦鲤鳍组织细胞系在制备蛙虹彩病毒疫苗中的应用。
53.本发明实施例还提供了如前述实施例所述的锦鲤鳍组织细胞系在制备由蛙虹彩病毒导致的相关疾病的药物中的应用。
54.本发明实施例还提供了如前述实施例所述的锦鲤鳍组织细胞系在锦鲤疱疹病毒khv3的培养和/或分离中的应用。
55.本发明实施例还提供了如前述实施例所述的锦鲤鳍组织细胞系在制备用于检测锦鲤疱疹病毒的试剂中的应用。
56.本发明实施例还提供了如前述实施例所述的锦鲤鳍组织细胞系在制备锦鲤疱疹病毒疫苗中的应用。
57.此外，本发明实施例还提供了如前述实施例所述的锦鲤鳍组织细胞系在制备由锦鲤疱疹病毒导致的相关疾病的药物中的应用。
58.优选地，所述相关疾病包括锦鲤疱疹病毒病。
59.实施例1锦鲤鳍组织细胞系kf1124的构建方法
60.(1)细胞培养液配制
61.往l15基础培养基(生工生物)中添加20％的胎牛血清(hyclone)，同时添加100iu/ml的青霉素溶液、100ug/ml的链霉素溶液，控制ph为7.0-7.5；细胞传代至15代后，将培养液中的胎牛血清添加量降至10％，不添加抗生素。
62.(2)组织预处理
63.取体长10cm左右的锦鲤，置于75％酒精中浸泡30s，转移到超净工作台中，用手术剪刀将鳍条剪下，用含双抗的pbs溶液洗涤5次，第一次洗涤时先将其浸泡30min，第二次浸泡20min，后面每次浸泡10min，以去除组织表面的细菌微生物；
64.(3)组织处理
65.将处理好的鳍组织，用无菌的眼科剪刀剪成1mm3左右大小的组织块，均匀移植到t25细胞培养瓶中，于25℃低温培养箱中倒置过夜，使组织块能贴壁并在后续的培养处理过程中不易脱落；
66.(5)原代培养
67.往组织块贴壁良好的t25细胞培养瓶中，加入培养液，于25℃培养箱中培养，待观察到细胞从鳍组织边缘迁出后，每隔5天半量更换培养液；组织贴壁后大概3-4天可见细胞从组织块周围迁出，7天后即可形成生长晕，如图1。
68.(6)传代培养
69.当原代培养细胞长满培养瓶底时，弃去培养液，用2ml pbs洗涤一次，加入1ml 0.25％胰蛋白酶液(含edta，不含酚红，生工生物)消化2min，消化后去除酶液，加入2ml原代细胞培养液将细胞吹下并混匀，以1:2的方式进行传代，25℃培养；传代培养至10-15代以后，将培养液中的胎牛血清含量降至10v/v％，并进行后续的传代培养，此时细胞仍多为纤维状细胞，如图2所示。
70.经过多次传代培养，获得了一种分离的锦鲤鳍组织细胞系kf1124。
71.本发明制备的锦鲤鳍组织细胞kf1124现已传代至60多代，细胞多为上皮样细胞，生长稳定，基本上当以1:2的方式传代后，2-3天即可长满瓶底并开始再次传代，如图3所示。
72.实施例2锦鲤疱疹病毒感染实验
73.为了研究锦鲤鳍组织细胞系kf1124对锦鲤疱疹病毒(khv3)的病毒敏感性，以第60代锦鲤鳍组织细胞为主，检测khv3对该细胞的敏感程度。
74.将细胞传代到t25中，用含10％胎牛血清的l15培养液，25℃培养，待细胞长满瓶底的80％时，移去旧培养液，加入2ml pbs洗涤一次，加100μlkhv3病毒液和5ml含2％胎牛血清的l15培养液，20℃培养，观察细胞病变效应(cpe)。
75.观察结果如图4所示，与未加病毒的锦鲤鳍组织细胞(图4中a)相比，感染后的锦鲤鳍组织细胞出现了明显的细胞病变效应cpe(如图4中b、c所示)，从中可以明显看出锦鲤鳍组织细胞出现空泡化，细胞碎片增多，细胞脱落，单层呈破渔网状。
76.当细胞病变达到70％以上时，将锦鲤鳍组织细胞反复冻融2-3次后，离心过滤去除细胞杂质，采用微量培养板(corning)培养法测定病毒滴度。
77.取生长良好的本发明kf1124锦鲤鳍组织细胞经消化后取样计数，用l15将细胞按照5
×
104个/ml的浓度进行稀释，以100μl/孔的初始量接种到96孔板培养24h使细胞充分贴壁。次日，取出细胞板弃尽生长液，每孔添加100μl含2％fbs的l15基础培养基，然后将待检病毒样品按稀释倍数由低到高的顺序以100μl/孔分别添加到96孔板的b-g行各孔中，a和h行各添加100ul含2％fbs的l15维持液作为阴性对照，该实验设3个重复。将细胞板于20℃低温培养箱中培养10后观察细胞病变(cytopathic effect，cpe)并记录终点，按reed-muench法计算病毒的效价，公式为：
78.病毒滴度＝10
lgcpe》50％的病毒最高稀释度 (cpe》50％的百分数-50％)/(cpe》50％的百分数-cpe《50％的百分数)
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/100μl，以鲤鱼脑细胞ccb培养khv3作实验对照。
79.本发明构建的锦鲤鳍组织细胞系对khv3病毒敏感，三天可见cpe，7天全部细胞病变，10-14天细胞逐渐脱落死亡，经统计、计算，结果表明此时病毒滴度可达到10
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/ml(表1)，比ccb细胞的滴度10
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/ml(表2)明显提高，在此基础上可实现khv3病毒疫苗的制备、疫病诊断和治疗。
80.表1锦鲤鳍组织细胞系培养khv3病毒滴度检测
81.病毒稀释度10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
接种孔数101010101010cpe孔数(平均值)101010863正常孔数000247cpe总孔数4737271793正常总孔数0002613cpe孔数占比47/4737/3727/2717/199/153/16细胞病变率100％100％100％89.5％60％18.75％
82.表2鲤鱼脑细胞ccb培养khv3病毒滴度检测
83.病毒稀释度10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
接种孔数101010101010cpe孔数(平均值)10108420正常孔数0026810cpe总孔数342414620正常总孔数00281626cpe孔数占比34/3424/2414/166/142/180/26细胞病变率100％100％87.5％42.9％11.1％0％
84.实施例3蛙虹彩病毒感染实验
85.为了研究本发明构建的锦鲤鳍组织细胞系kf1124对蛙虹彩病毒(lmbv)的病毒敏感性。用第60代锦鲤鳍组织细胞，检测lmbv的敏感程度。
86.将细胞传代到t25中，用含10％胎牛血清的l15培养液，25℃培养，待细胞长满瓶底的80％时，移去旧培养液，加入2ml pbs洗涤一次后，加100ul lmbv病毒液和900μl含2％胎牛血清的l15培养液，24℃培养2h后弃去，再用pbs缓冲液洗2-3遍，每次5ml，最后补加5ml含2％胎牛血清的l15培养液，24℃培养观察细胞病变效应(cpe)。
87.观察结果如图5所示，与lmbv感染前的锦鲤鳍组织细胞(图5中a)相比，感染后的锦鲤鳍组织细胞出现了明显的细胞病变效应cpe(如图5中b、c所示)，从中可以明显看出锦鲤鳍组织细胞碎片增多，细胞脱落，单层呈破渔网状。
88.将锦鲤鳍组织细胞脱落死亡的病毒液，离心过滤去除细胞杂质，取部分提取dna后经pcr鉴定是否为lmbv(具体方法参照水生动物疫病诊断手册相关章节)，结果如图6所示，pcr产物大小与预期一致，且条带单一、清晰，表明lmbv能在kf1124鳍组织细胞系上增殖。
89.同时采用微量培养板(corning)培养法测定病毒滴度,具体方法参考实施例2。按reed&muench方法计算细胞滴度，以鲤鱼上皮瘤细胞epc培养lmbv作对照。经计算，结果表明，本发明构建的锦鲤鳍组织细胞系对lmbv病毒敏感，病毒经培养，滴度可以达到109tcid
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/ml(具体数据见表3)，而商品化的epc细胞系培养的病毒，滴度只有108tcid
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/ml(表4)。
90.表3锦鲤鳍组织细胞系培养病毒(lmbv)滴度检测
91.病毒稀释度10-5
10-6
10-7
10-8
10-9
10-10
接种孔数101010101010cpe孔数(平均值)101010951正常孔数000159
cpe总孔数4535251561正常总孔数0001615cpe孔数占比45/4535/3525/2515/166/121/16细胞病变率100％100％100％93.75％50％6.25％
92.表4鲤鱼上皮瘤细胞培养病毒(lmbv)滴度检测
93.病毒稀释度10-5
10-6
10-7
10-8
10-9
10-10
接种孔数101010101010cpe孔数(平均值)10108610正常孔数0024910cpe总孔数352515710正常总孔数00261525cpe孔数占比35/3525/2515/177/131/160/25细胞病变率100％100％88.2％53.8％6.25％0％
94.综上，本发明构建的锦鲤鳍组织细胞系现已能稳定传代、增殖，并可用于锦鲤疱疹病毒khv3和蛙虹彩病毒lmbv的分离培养，不仅丰富了上述两种病毒的诊断方式，同时其培养获得的高滴度病毒使疫苗研制、鱼类疫病防治成为可能。
95.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。