泡叶藻酶解液培养的EM菌及其防治根结线虫的应用的制作方法

泡叶藻酶解液培养的em菌及其防治根结线虫的应用
技术领域
1.本发明涉及用泡叶藻酶解液发酵培养得到em菌，并用所得em菌防治根结线虫。


背景技术：

2.在引起植物侵染性病害的四大病原中，植物寄生线虫的危害超过细菌和病毒，仅次于真菌病害。植物线虫病是世界农业生产中重要的病害种类，每年对全球21多种主要农作物造成的损失高达1000亿美元，其中，根结线虫(meloidogyne spp．)是危害最大的一类植物寄生线虫，造成的损失占50%以上，每年仅对世界上重要的经济作物造成的经济损失就高达数百亿美元。
3.根结线虫寄主广泛，能够侵染3000多种植物，包括了大部分农作物，一般可造成作物减产10%～20%，严重时达75%以上。在我国，根结线虫分布广泛，发病率高，特别是随着保护地栽培模式的推广、作物复种指数的不断提高，根结线虫病的发生面积逐渐扩大，危害愈加严重，已成为影响我国作物产量和品质的重要因素。
4.目前有90多种根结线虫，90%以上的植物根结线虫病由四种线虫引起，即南方根结线虫(m．incognita)、北方根结线虫(m．hapla)、花生根结线虫(m．arenaria)和爪哇根结线虫(m．javanica)。根结线虫的繁殖力极强，通常每个雌虫可产卵1000枚以上。根结线虫主要存在于5～30cm深度的土壤中，通过侵入创口和形成瘤状的根结破坏植物根系结构，吸收植物营养，影响植物正常代谢活动，并引起其他病原菌的复合侵染，造成植物长势减弱甚至死亡，农作物减产甚至绝收。根结线虫通常没有明显的寄主专化性，能够侵染的植物超过3000种，分属114科，包括单子叶植物、双子叶植物、草本植物和木本植物，对大多数的粮食作物、油料作物、纤维作物、烟草、茶叶、果树、蔬菜、药材和花卉等均可造成严重损失。受其危害后，作物品质下降，大幅度减产，甚至绝产，同时线虫病的发生又加剧了枯萎病、黄菱病和立枯病等土传病害的危害，造成植物抵抗能力下降，极易受其它病原物侵染。
5.目前，我国对根结线虫防控措施主要有农业防治、物理防治、化学防治和生物防治，但仍以化学防治为主，防治措施综合化水平较低，由此造成的根结线虫抗药性积累等问题使得根结线虫防治形势愈加严峻。
6.在控制该类病害的方法中，由于根结线虫通常存活于土壤中和植物根内，所以一般化学农药难以控制其危害，因此该类病害成为大量剧毒农药频繁使用的对象，对农产品生产的安全性构成严重威胁。同时，由于化学杀线剂只能在短期内控制线虫数量，同时还存在成本高、持效短和抗药性等问题。此外，一些传统的防治方法，如轮作、种植抗病品种等虽可起到一定的防治作用，但在实际生产中能够轮作的作物并不多，对根结线虫具有抗性的作物品种十分有限。因此，传统控制方法并不能解决该类病害。综上所述，由于目前缺乏实用、高效、可持续的治理技术，根结线虫病发生区域不断扩大，危害作物种类持续增加，致使农业生产面临严峻挑战，杀线虫生物农药具有非常广阔的应用价值和市场前景。
7.em菌是以光合细菌、乳酸菌、酵母菌和放线菌为主的10个属80余个微生物复合而成的一种微生物菌制剂，可用于食品添加、养殖病害防治、土壤改良、生根壮苗、污水治理等
等。泡叶藻(ascophyllum nodosum)，主要生于大西洋，含有丰富的矿质营养及有机营养，是加工海藻肥的上等原料。


技术实现要素：

8.em菌是广谱性农业病害防治生物制剂，但很少有em菌防治根结线虫的应用报道。而且现有的em菌扩增发酵培养方法得到的活菌浓度不是太理想。本发明用泡叶藻作培养基成分发酵扩增em菌，得到高活菌浓度的发酵液，用所得发酵液取得防治线虫的优异田间生防效果。
9.本发明的一个目的是提供一种泡叶藻的adl复合酶酶解液，其可作为额外成分添加至现有的包括碳源、氮源、无机盐、生长因子的常规em菌培养基中，用于提高em菌产量。
10.其中adl复合酶为纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶，优选比例为3:2:1。
11.所述泡叶藻酶解方法，是将泡叶藻与水混合进行机械磨碎成匀浆，再往匀浆添加adl复合酶，充分搅拌反应，再经振动筛粗过滤得到酶解液。
12.本发明的另一个目的是提供一种含有上述泡叶藻酶解液的培养基，用于高效培养em菌。
13.发明人发现上述泡叶藻酶解液作为额外成分添加至现有的培养基中能大幅提升em菌产量。
14.所述培养基包含藻酶解液1.2%
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1.8%、鱼蛋白胨0.4%
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0.6%、玉米粉1.6%
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2.4%、磷酸二氢钠0.4%
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0.6%、糖蜜1.0%
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1.5%、尿素0.4%
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0.6%、碳酸钙0.2%
‑
0.3%，余量为水。
15.优选地，所述培养基按重量包含泡叶藻酶解液 1.5%、鱼蛋白胨 0.5%、玉米粉 2%、磷酸二氢钠 0.5%、糖蜜 1.25%、尿素 0.5%、碳酸钙 0.25%，余量为水。
16.本发明的又一个目的是提供一种液体发酵生产em菌的方法，包括以下步骤：ⅰ.将em菌种接种到种子培养基中培养，得到种子液；所述种子培养基可为本领域常规使用的种子培养基，在本发明的一较佳实施方式中，以种子培养基的重量计，所述种子培养基包括：蔗糖 2%、尿素 0.5%、糖蜜 1.2%、磷酸二氢钠 0.5%、碳酸钙 0.25%，补水至100%，121℃灭菌20min；培养条件和培养时间可由技术人员按需要调整，直到获得所需种子液活菌数，优选种子液活菌数≥2亿/ml；ⅱ.将种子液以优选的3%
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10%重量比接种于上述含有泡叶藻酶解液的培养基中，在28
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35℃条件下振荡转速160
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200r/min发酵60
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96h得到泡叶藻复合菌剂发酵液；ⅲ.经过振动筛80
‑
150目粗过滤和全自动错流膜除菌微滤系统进行无菌过滤浓缩，得到em菌发酵液成品。
17.本发明的再一个目的是提供上述em菌发酵液防治根结线虫的应用。
具体实施方式
18.下面结合具体实施例进一步但非限制性地描述本发明。
19.本发明所用材料均为可商购材料。
20.本发明所用em菌种购自郑州农盛乐生物科技有限公司(生产许可证：冀饲添（2016）t07008)。
21.本发明所用泡叶藻为产自北大西洋沿岸海域的进口泡叶藻。
22.实施例1.泡叶藻酶解根据不同操作条件分为a、b、c三组，对泡叶藻进行酶解，如下。
23.a组:将新鲜泡叶藻按照料水比1：2进行机械磨碎成匀浆，在45℃条件下按照匀浆：adl复合酶=100：0.5添加，充分搅拌反应28h，在经振动筛100目粗过滤得到泡叶藻酶解液，测得泡叶藻酶解液粘度为79mpa
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s（39.5℃）。
24.b组:将新鲜泡叶藻按照料水比1：2进行机械磨碎成匀浆，在50℃条件下按照匀浆：adl复合酶=100：0.4添加，充分搅拌反应24h，在经振动筛100目粗过滤得到泡叶藻酶解液，测得泡叶藻酶解液粘度为83mpa
▪
s（42.0℃）。
25.c组:将新鲜泡叶藻按照料水比1：2进行机械磨碎成匀浆，在55℃条件下按照匀浆：adl复合酶=100：0.3添加，充分搅拌反应30h，在经振动筛100目粗过滤得到泡叶藻酶解液，测得泡叶藻酶解液粘度为82mpa
▪
s（46.5℃）。
26.实施例2：em菌液体发酵根据如下相同操作工艺，分别采用实例1的a组、b组、c组所得泡叶藻酶解液平行进行三次发酵试验，对应地分别得到em菌发酵液成品1、em菌发酵液成品2、em菌发酵液成品3。
27.（1）将em菌种按5%重量比接种于种子液发酵培养基中，在35℃条件下振荡转速200r/min发酵48h得到种子液发酵液；本发明采用种子液发酵液体培养基配制方法：蔗糖 2%、尿素 0.5%、糖蜜 1.2%、磷酸二氢钠 0.5%、碳酸钙 0.25%，补去离子水至100%，121℃灭菌20min；（2）将种子发酵液以5%重量比接种于扩大发酵培养基中，在35℃条件下振荡转速180r/min发酵60h得到em菌发酵液；扩大发酵培养基配制方法：泡叶藻酶解液 1.5%、鱼蛋白胨 0.5%、玉米粉 2%、磷酸二氢钠 0.5%、糖蜜 1.25%、尿素 0.5%、碳酸钙 0.25%，补去离子水至100%，121℃灭菌30min；（3）经过振动筛100目粗过滤和全自动错流膜除菌微滤系统进行无菌过滤浓缩，得到em菌发酵液成品。
28.同时设置一组对比例，操作工艺其它步骤同上，只是其扩大发酵培养基不含泡叶藻酶解液，其配制方法为：鱼蛋白胨 0.5%、玉米粉 2%、磷酸二氢钠 0.5%、糖蜜 1.25%、尿素 0.5%、碳酸钙 0.25%，补去离子水至100%，121℃灭菌30min。
29.用菌落平板计数法测定发酵液产品的总活菌数，em菌发酵液成品1、em菌发酵液成品2、em菌发酵液成品3分别为42.95亿/ml、43.78亿/ml和43.45亿/ml，而对比例的发酵液产品为21.55亿/ml。可见用adl复合酶酶解泡叶藻酶所得酶解液作培养基成分的发酵工艺有着显著提高并且稳定的活菌产量。
30.另外，本实施例只是为了示例性地说明本发明，实际应用时还可以根据实际需要调整操作条件，例如为提高菌种存活率，菌种发酵的温度优选为28
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35℃；为提高菌体的生长速率，可对该菌进行振荡培养，振速优选为160
‑
200rpm；为得到最佳活菌数和代谢产物，培养时间一般为60
‑
96h。
31.实施例3：em菌发酵液成品对番茄的田试生防效果以邹平长山往年根结线虫严重试验田种植的番茄，进行如下实验设计，验证其对番茄根结线虫防治效果（在下文中，em菌发酵液成品也用“生防制剂”表示）：处理1：空白对照（不施药）处理2：对比例2kg/亩处理3：生防制剂2kg/亩处理4：生防制剂4kg/亩处理5：生防制剂6kg/亩在番茄收获后，挖出番茄植株的根，按照根结线虫分级调查指标进行调查，具体如下：0 级（无根结）；1 级（全株根结 5 个以下）；2 级（全株根结 6～15 个）；3级（全株根结 16～25 个）；4 级（全株根结 26～50 个）；5 级（全株根结 51 个以上）。
32.根据严重度计算病情指数和防治效果，并用病情指数进行防效差异显著性测验。计算公式如下：计算公式如下：表1 em菌发酵液成品1对番茄根结线虫的防治效果表2 em菌发酵液成品2对番茄根结线虫的防治效果表3 em菌发酵液成品3对番茄根结线虫的防治效果
可见，采用泡叶藻酶解液作培养基的发酵工艺得到1、2、3发酵液成品对番茄根结线虫有着可观且一致的防治效果，三者效果均优于对比例和空白对照区。
33.实施例4：em菌发酵液成品对黄瓜的田试生防效果以聊城莘县根结线虫严重的黄瓜蔬菜大棚为试验基地，进行如下实验设计，验证其对黄瓜根结线虫防治效果（下面泡叶藻复合菌剂发酵液用“生防制剂”表示）：处理a：空白对照（不施药）处理b：对比例2kg/亩处理c：生防制剂2kg/亩处理d：生防制剂4kg/亩处理e：生防制剂6kg/亩在黄瓜收获后，挖出黄瓜植株的根，按照根结线虫分级调查指标进行调查，具体如下：0 级（无根结）；1 级（全株根结 5 个以下）；2 级（全株根结 6～15 个）；3级（全株根结 16～25 个）；4 级（全株根结 26～50 个）；5 级（全株根结 51 个以上）。
34.根据严重度计算病情指数和防治效果，并用病情指数进行防效差异显著性测验。计算公式如下：计算公式如下：表4 em菌发酵液成品1对黄瓜根结线虫的防治效果表5 em菌发酵液成品2对黄瓜根结线虫的防治效果
表6 em菌发酵液成品3对黄瓜根结线虫的防治效果可见，采用泡叶藻酶解液作培养基的发酵工艺得到1、2、3发酵液成品对黄瓜根结线虫有着可观且一致的防治效果，三者效果均优于对比例和空白对照区。
35.尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围以权利要求所述的保护范围为准。