一种芹菜根腐病菌的接种方法

1.本发明属于芹菜根腐病防治技术领域，更具体的说是涉及一种芹菜根腐病菌的接种方法。


背景技术：

2.近年来，芹菜的种植面积不断扩大，成为我国主要栽培蔬菜品种之一。芹菜连作重茬的现象越来越多，芹菜根腐病的发生逐年加重，导致减产绝收，成为危害芹菜产业发展的重要问题。芹菜根腐病发病初期在茎基部出现水浸状、褐色病症，植株上部枝叶萎蔫、变黄，后期茎基部缢缩、干枯，最终导致芹菜整棵死亡，主根红褐色腐烂。目前报道芹菜成株期根腐病病原菌主要为镰刀菌(fusarium sp.)，研究显示茄病镰刀菌(fusarium solani)是芹菜根腐病的主要致病菌。
3.芹菜根腐病是芹菜生长中主要发生的病害，芹菜根腐病的防治以化学防治为主，但传统的杀菌剂极易产生抗药性，防治效果低。高效低毒杀菌剂的筛选、及复配配方优化对芹菜根腐病的防治具有重要意义。另外，推广应用抗病品种是解决芹菜根腐病危害最直接有效的方法。但目前抗病种质资源缺乏，还没有商业化的芹菜根腐病抗病品种，因此开展芹菜根腐病抗病资源筛选和评价具有重要的意义。鉴此，准确有效的抗病性鉴定方法的建立是抗病资源挖掘利用、品种选育、抗性评价等研究工作的基础。
4.在芹菜根腐病接种方法的研究报道中发现，接种后芹菜发病时间长、发病症状不明显、难于判断弊端，而且接种后通常需要拔掉芹菜，调查根部病情分级，因此为芹菜根腐病致病力鉴定、杀菌剂防效测定及抗性种质资源筛选等造成一定的困难。
5.因此，如何提供一种芹菜根腐病菌的接种方法成为了本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于针对目前芹菜根腐病接种方法中存在发病时间长、症状难以判断的问题，本发明提供一种芹菜根腐病菌的接种方法，该方法操作简便、准确率高、可快速评价病原菌与芹菜间的互作关系，为其病原菌致病力的鉴定、杀菌剂活性筛选及芹菜种质资源的抗病性评价提供技术支持。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种芹菜根腐病菌的接种方法，包括如下步骤：(1)准备试验芹菜苗；(2)芹菜根腐病菌的培养；(3)病原菌孢子悬浮液制备；(4)芹菜水培处理；(5)发病情况调查。
9.进一步的，步骤(1)中，采用灭菌育苗基质进行育苗，育苗基质为草炭和蛭石(体积份数比为2:1)混匀后，121℃蒸汽灭菌30min；将芹菜种子播种于装有育苗基质的育苗盘内，按常规育苗方法管理，60d后，芹菜长出4片真叶，挑选健康、长势一致的幼苗待用。
10.进一步的，步骤(2)中，芹菜根腐菌培养的具体操作为：芹菜根腐病原接种pda培养基上活化培养，26℃培养箱中黑暗培养7d，然后用打孔器(直径4mm)在菌落边缘菌丝处打
孔，获得菌片接种于pd液体培养基中，每瓶培养基接种5片菌碟；将其置于振荡培养箱中26℃，120rpm/min振荡培养7d。
11.进一步的，步骤(3)中，病原菌孢子悬浮液制备具体操作为：将在pd液体培养基中培养好根腐病菌培养液双层纱布过滤，去除菌丝体，回收滤液，5000rpm/min，离心30min后，弃上清液，取沉淀物加入适量的蒸馏水，再用血球计数板将菌悬液调配成浓度为1
×
105～106个孢子/ml的孢子悬浮液，接种备用。
12.进一步的，步骤(4)中，芹菜水培处理的具体操作为：将步骤(1)中挑选的健康、长势一致的芹菜苗从育苗基质中取出，清洗去除根部基质，然后将其放入步骤(3)中配好的芹菜根腐菌孢子悬浮液中培养，培养条件23～28℃，光照12h，湿度不超过70％。
13.进一步的，步骤(5)中，发病情况调查的具体操作为：每天观察水培芹菜生长状况和发病情况；按芹菜根腐病水培接种病情分级标准，5～7d对植株发病程度进行调查，并计算病情指数。
14.进一步的，步骤(5)中，芹菜根腐病水培接种病情分级标准为：0级，无症状；1级，根絮状，无新根，须根变细，植株无显著变化；2级，植株茎基部萎蔫，主根变细，根部变褐，易断；3级，叶片萎蔫黄化，茎部缢缩；4级，整株植株萎蔫至死。
15.进一步的，步骤(5)中，病情指数计算公式为：病情指数＝σ(发病叶数
×
相应病级数)
×
100/(调查总叶数
×
4)。
16.本发明的有益效果在于：
17.1.本发明建立了一种芹菜根腐病菌的接种方法，操作简单、试验环境可控，可重复性高，可避免外界气候条件和土壤环境的影响，常年均可进行试验。
18.2.芹菜根腐病盆栽或田间接种试验具有发病慢、症状不明显的特征，难以对病原菌与芹菜间的互作关系作出快速准确的判断，本发明建立的水培接种方法发病快，鉴定时间短、鉴定结果准确可靠。
19.3.本发明建立的接种方法可应用于芹菜根腐病原菌的致病力鉴定，杀菌剂对芹菜根腐病防效的活体鉴定及芹菜根腐病抗病种质资源的筛选评价。
具体实施方式
20.下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
21.鉴于芹菜枯萎病病原潜育期长，是一种系统性侵染病害，全生育期均可发病，因此本发明建立芹菜枯萎病人工病圃是对其品种抗病性鉴定研究的重要途径，降低抗性鉴定技术难度，为大样本品质资源的筛选鉴定提供准确、可靠的技术手段。
22.实施例1
23.实施例1目的在于对芹菜根腐病不同接种方法的比较。
24.本实施例提供了一种芹菜根腐病菌的接种方法，包括以下步骤：
25.步骤1，准备试验芹菜苗：采用灭菌育苗基质进行育苗，育苗基质为草炭和蛭石(体积份数比为2:1)混匀后，121℃蒸汽灭菌30min。将芹菜种子(芹菜品种尤文图斯)播种于装
有育苗基质的育苗盘内，按常规育苗方法管理，60d后，芹菜长出4片真叶，挑选健康、长势一致的幼苗待用。
26.步骤2，芹菜根腐菌孢子的培养具体操作为：芹菜根腐病原qcgf001接种pda培养基上活化培养，26℃培养箱中黑暗培养7d，然后用打孔器(直径4mm)在菌落边缘菌丝处打孔，获得菌碟接种于pd液体培养基中，每瓶培养基接种5片菌碟。然后，将其置于振荡培养箱中26℃，120rpm/min振荡培养7d。
27.步骤3，制备芹菜根腐病菌孢子悬浮液，芹菜根腐菌孢子悬浮液的制备具体操作为：将在pd液体培养基中培养好根腐病菌培养液双层纱布过滤，去除菌丝体，把回收的滤液，5000rpm/min，离心30min后，弃上清液，取沉淀物加入适量的蒸馏水，再用血球计数板将菌悬液调配成浓度为6
×
105个孢子/ml的孢子悬浮液，接种备用。
28.步骤4，芹菜水培处理的具体操作为：将步骤1中挑选的健康、长势一致的芹菜苗从育苗基质中取出,清洗去除根部基质，然后将其放入步骤3中配好的芹菜根腐菌孢子悬浮液中培养，培养条件26℃，光照12h，湿度不超过70％。
29.步骤5，发病情况调查，：每天观察水培芹菜生长状况和发病情况；按芹菜根腐病水培接种病情分级标准，5～7d对植株发病程度进行调查，并计算病情指数。
30.步骤5中涉及的芹菜根腐病发病病情分级标准为：0级，无症状；1级，根絮状，无新根，须根变细，植株无显著变化；2级，植株茎基部萎蔫，主根变细，根部变褐，易断；3级，叶片萎蔫黄化，茎部缢缩；4级，整株植株萎蔫至死。
31.步骤5中，病情指数计算公式为：病情指数＝σ(发病叶数
×
相应病级数)
×
100/(调查总叶数
×
4)
32.对比例1
33.对比例1与实施例1的不同之处在于：步骤4，芹菜根腐病菌灌根接种，将步骤1中挑选的健康、长势一致的芹菜苗从育苗基质中取出，移栽至营养钵中，然后灌根接种步骤3中配好的芹菜根腐菌孢子悬浮液，置于人工气候室中培养，培养条件25
±
5℃，光照12h，湿度90％左右。
34.对比例2
35.对比例2与实施例1的不同之处在于：步骤4，芹菜根腐病菌灌根接种，将步骤1中挑选的健康、长势一致的芹菜苗从育苗基质中取出，将其伤根后在步骤3中配好的病原菌孢子悬浮液中浸苗15min，然后将其栽入营养钵中。置于人工气候室中培养，培养条件25
±
5℃，光照12h，湿度90％左右。
36.芹菜根腐病不同接种方法发病情况比较如表1所示。
37.38.表1
39.如表1所示，芹菜根腐病菌水培接种发病较快，接种7d后病情指数为34.21，而土壤灌根接种，没有发病症状，伤根蘸根接种病情指数4.38。接种30d后，水培接种芹菜发病较重，多数萎蔫死亡，病情指数为68.75，而灌根接种发病较轻，伤根蘸根接种病情指数为46.67。因此，结果显示芹菜根腐病水培接种方法更容易致病，发病症状明显。
40.实施例2
41.实施例2目的在于对田间分离的不同根腐病病原菌对芹菜的致病力鉴定。
42.本实施例提供了一种芹菜根腐病菌的接种方法，包括以下步骤：包括以下步骤：
43.步骤1，准备试验芹菜苗：采用灭菌育苗基质进行育苗，育苗基质为草炭和蛭石(体积份数比为2:1)混匀后，121℃蒸汽灭菌30min。将芹菜种子(芹菜品种尤文图斯)播种于装有育苗基质的育苗盘内，按常规育苗方法管理，60d后，芹菜长出4片真叶，挑选健康、长势一致的幼苗待用。
44.步骤2，芹菜根腐菌孢子的培养具体操作为：芹菜根腐病原(从天津市芹菜根腐病发病植株上分离到的病原菌qcgf001，qcgf002，
……
，qcgf006)接种pda培养基上活化培养，26℃培养箱中黑暗培养7d，然后用打孔器(直径4mm)在菌落边缘菌丝处打孔，获得菌碟接种于pd液体培养基中，每瓶培养基接种5片菌碟。然后，将其置于振荡培养箱中26℃，120rpm/min，振荡培养7d。
45.步骤3，制备芹菜根腐病菌孢子悬浮液，芹菜根腐菌孢子悬浮液的制备具体操作为：将在pd液体培养基中培养好根腐病菌培养液双层纱布过滤，去除菌丝体，把回收的滤液，5000rpm/min，离心30min后，弃上清液，取沉淀物加入适量的蒸馏水，再用血球计数板将菌悬液调配成浓度为1
×
106个孢子/ml的孢子悬浮液，接种备用。
46.步骤4，芹菜水培处理的具体操作为：将步骤1中挑选的健康、长势一致的芹菜苗从育苗基质中取出,清洗去除根部基质，然后将其放入步骤3中配好的不同浓度的芹菜根腐菌孢子悬浮液中培养，培养条件26℃，光照12h，湿度不超过70％。
47.步骤5，发病情况调查，每天观察水培芹菜生长状况和发病情况。7d对植株发病程度进行调查，并计算病情指数。
48.步骤5中，芹菜根腐病水培接种病情分级标准为：0级，无症状；1级，根絮状，无新根，须根变细，植株无显著变化；2级，植株茎基部萎蔫，主根变细，根部变褐，易断；3级，叶片萎蔫黄化，茎部缢缩；4级，整株植株萎蔫至死。
49.步骤5中，病情指数计算公式为：病情指数＝σ(发病叶数
×
相应病级数)
×
100/(调查总叶数
×
4)。
50.不同根腐病病原菌对芹菜致病力鉴定情况如表2所示。
51.菌株编号病情指数qcgf00128.13qcgf0020.63qcgf00317.50qcgf0040.00qcgf0051.25qcgf0065.00
52.表2
53.如表2所示，将芹菜接种于不同来源的芹菜根腐病菌培养液中，鉴定分离病原菌对芹菜的致病力强弱，结果显示接种7d后，分离到的6株病原菌中qcgf001的致病力最强，病情指数为28.13，其次为qcgf003，qcgf002和qcgf004菌株对芹菜几乎无致病力。
54.实施例3
55.实施例3目的在于对三种化学药剂对芹菜根腐病的防效测定。
56.实施例提供了一种芹菜根腐病菌的接种方法，包括以下步骤：
57.步骤1，准备试验芹菜苗：采用灭菌育苗基质进行育苗，育苗基质为草炭和蛭石(体积份数比为2:1)混匀后，121℃蒸汽灭菌30min。将芹菜种子(芹菜品种尤文图斯)播种于装有育苗基质的育苗盘内，按常规育苗方法管理，60d后，芹菜长出4片真叶，挑选健康、长势一致的幼苗待用。
58.步骤2，芹菜根腐菌孢子的培养具体操作为：芹菜根腐病原qcgf001接种pda培养基上活化培养，26℃培养箱中黑暗培养7d，然后用打孔器(直径4mm)在菌落边缘菌丝处打孔，获得菌碟接种于pd液体培养基中，每瓶培养基接种5片菌碟。然后，将其置于振荡培养箱中26℃，120rpm/min，振荡培养7d。
59.步骤3，制备芹菜根腐病菌孢子悬浮液，芹菜根腐菌孢子悬浮液的制备具体操作为：将在pd液体培养基中培养好根腐病菌培养液双层纱布过滤，去除菌丝体，把回收的滤液，5000rpm/min，离心30min后，弃上清液，取沉淀物加入适量的蒸馏水，再用血球计数板将菌悬液调配成浓度为1
×
106个孢子/ml的孢子悬浮液，接种备用。
60.步骤4，芹菜水培处理的具体操作为：将步骤1中挑选的健康、长势一致的芹菜苗从育苗基质中取出,清洗去除根部基质，然后将其放入步骤3中配好的不同浓度的芹菜根腐菌孢子悬浮液中培养，培养条件26℃，光照12h，湿度不超过70％。其中，在芹菜根腐病的水培培养液中按使用剂量加入30％噁霉灵水剂、36％甲基硫菌灵悬浮剂和2.5％咯菌腈悬浮种衣剂，以不加化学药剂为清水对照。
61.步骤5，发病情况调查，每天观察水培芹菜生长状况和发病情况。7d对植株发病程度进行调查，并计算病情指数，及各药剂处理的防效。
62.步骤5中，芹菜根腐病水培接种病情分级标准为：0级，无症状；1级，根絮状，无新根，须根变细，植株无显著变化；2级，植株茎基部萎蔫，主根变细，根部变褐，易断；3级，叶片萎蔫黄化，茎部缢缩；4级，整株植株萎蔫至死。
63.步骤5中，病情指数计算公式为：病情指数＝σ(发病叶数
×
相应病级数)
×
100/(调查总叶数
×
4)。
64.步骤5中，化学药剂防治效果计算公式为：防效(％)＝(清水对照病情指数-药剂处理病情指数)
×
100/清水对照病情指数。
65.表3表示不同药剂对芹菜根腐病的防效测定情况。
[0066][0067]
表3
[0068]
如表3所示，不同药剂处理后，对芹菜根腐病病原菌的侵染起到一定的抑制作用，其中2.5％咯菌腈悬浮种衣剂2000倍抑制作用最强，处理7d后防效为78.13％，处理14d后防效为69.23％。
[0069]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
[0070]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。